Lên men thu BC
Giá thể hữu cơ BC
Chế phẩm BC Khảo sát thông số
bẫy hấp phụ
Khảo sát hoạt tính
Lên men thu sinh khối
Sinh khối vi khuẩn
Nitrosomonas Nitrobacter Chế phẩm dạng lỏng Khảo sát hoạt tính Acetobacter xylinum Khảo sát số lần tái sử dụng
Giá thể vô cơ Đá san hô Chế phẩm Đá san hô Khảo sát thông số bẫy hấp phụ Khảo sát hoạt tính Đá san hô Khảo sát số lần tái sử dụng
57 3.2.3 Giải thích sơ đồ
Mục đích thí nghiệm nhằm xác định hoạt lực phân giải ammonia và nitrite của 3 loại chế phẩm: giá thể vô cơ (đá san hô), giá thể hữu cơ (BC) và dịch vi khuẩn. Để thực hiện được điều này chúng tôi tiến hành qua 3 bước:
Xây dựng bộ sưu tập giống, nhằm tuyển chọn giống có hoạt tính cao đáp ứng yêu cầu xử lý ammonia và nitrite trong nước nuôi tôm.
Khảo sát các chế độ thích hợp để cố định vi khuẩn vào giá thể BC, đá san hô. Từ các chế độ thích hợp đã tìm ra, tiến hành thử nghiệm chế phẩm BC, đá san hô và chế phẩm dạng lỏng nhằm tìm ra tỉ lệ xử lý thích hợp.
Trong giai đoạn xây dựng bộ sưu tập giống, chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn từ chế phẩm vi sinh xuất xứ trong nước là Eco-Bio của công ty TNHH Cửu Long và làm thêm chế phẩm có xuất xứ nước ngoài là PondProtect của công ty Novo- zymes. Sau đó, chúng tôi huấn luyện thích nghi chủng giống ở điều kiện nước biển thực tế được nhằm thu nhận chủng vi khuẩn có khả năng thích nghi cao.
Trong giai đoạn tạo chế phẩm vi sinh, chúng tôi khảo sát hai chế độ bẫy hấp phụ là thời gian và tỉ lệ giá thể đem cố định nhằm tìm ra chế độ thích hợp cho việc tạo ra chế phẩm vi sinh từ BC và đá san hô.
Khâu cuối của đề tài nghiên cứu này là thử nghiệm chế phẩm, chúng tôi lập các thí nghiệm xử lý nước nuôi tôm ở các tỉ lệ khối lượng chế phẩm khác nhau nhằm tìm ra tỉ lệ nào thích hợp cả về mặt hoạt lực và tính kinh tế. Đồng thời, chúng tôi theo dõi số lần tái sử dụng của chế phẩm để kiểm tra hoạt tính còn lại sau mỗi đợt xử lý.
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1 Khảo sát đặc điểm sinh học 3.3.1 Khảo sát đặc điểm sinh học 3.3.1.1 Phân lập giống
Chúng tôi tiến hành phân lập giống vi khuẩn theo sơ đồ trên. Lưu ý là, đối với môi trường phân lập vi khuẩn oxi hoá ammonia (ban đầu chỉ có NH3 và một số khoáng chất khác, không chứa NO2-) và môi trường phân lập vi khuẩn oxi hoá nitrite (tương tự, có NO2- và một số khoáng chất khác, không chứa NH3), nhưng sau khi hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút thì xuất hiện khả năng các hợp chất nitơ chuyển hoá qua lại. Khi đó, môi trường cho vi khuẩn oxi hoá ammonia sẽ xuất hiện NO2- (là sản phẩm của phản ứng giữa NH3, NH4+, H2O, O2 ở nhiệt độ cao), ngược lại, môi trường cho vi khuẩn oxi hoá nitrite cũng xuất hiện một nồng độ nhỏ NH3. Vì vậy nếu kết luận khuẩn lạc nào mọc trên môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia thì thuộc dòng vi
58
khuẩn Nitrosomonas sp. hay dành cho vi khuẩn oxi hoá nitrite là thuộc Nitrobacter sp. là chưa có cơ sở, cần phải kiểm tra đặc điểm đại thể, hoạt tính và vi thể để có kết luận chính xác.
Chúng tôi khảo sát đặc điểm đại thể (khuẩn lạc) trước, sau đó từ những khuẩn lạc thu được chúng tôi thử hoạt tính. Chỉ những dòng vi khuẩn nào có hoạt tính mới được chọn lựa để kiểm tra tiếp về đặc điểm vi thể, lý do của trình tự này nhằm tránh trường hợp sau khi kiểm tra đại thể, vi thể thì đến khi thử hoạt tính lại không có, mất công phải thực hiện lại từ đầu (xem phần Phụ lục).
Chế phẩm vi sinh Huyền phù với nước cất Lấy 1ml đổ đĩa Petri, ủ 10 ngày ở nhiệt độ phòng Chọn khuẩn lạc đặc trưng Đĩa Petri với môi
trường phân lập
Thử hoạt tính
Nhuộm Gram
Vi khuẩn sau phân lập
59 3.3.1.2 Kiểm tra đặc điểm đại thể, vi thể
Phương pháp kiểm tra đại thể bằng cách đối chiếu với bảng mô tả đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn oxi hoá ammonia và nitrite được đưa trong phần 2.2, sau đó cấy ria những khuẩn lạc đó ra đĩa petri. Ủ trong 1 tuần. Kế đến sử dụng khuẩn lạc thuần thu được để kiểm tra hoạt tính
Phương pháp kiểm tra vi thể bằng cách nhuộm Gram, hầu hết các dòng vi khuẩn nitrate hoá đều thuộc nhóm Gram âm [11]. Dựa trên mô tả đặc điểm vi thể, nhất là hình dạng và kích thước tế bào, đặc điểm cụm tế bào mà ta kết luận là loài vi khuẩn kiểm tra thuộc loài nào trong hệ vi khuẩn nitrate hoá.
3.3.1.3 Kiểm tra hoạt tính
Môi trường thử hoạt tính oxi hoá ammonia: hoà 0,297g NH4Cl vào 100ml
nước cất, được dung dịch có nồng độ 1 mg N-NH4+/ml (dung dịch Stock). Pha loãng dung dịch Stock ra 100 lần, ta được dung dịch thử hoạt tính có nồng độ 10 mg N-NH4+/L.
Môi trường thử hoạt tính oxi hoá nitrite: hoà 0,1468g NaNO2 vào 100ml nước
cất, được dung dịch có nồng độ 1 mg NO2-/ml (dung dịch Stock). Pha loãng dung dịch Stock ra 1000 lần, ta được dung dịch thử hoạt tính có nồng độ 1 mg NO2-/L.
3.3.1.3.1 Hoạt tính oxi hoá ammonia
Dựa trên khả năng oxi hoá ammonia thành nitrite của dòng vi khuẩn
Nitrosomonas sp., chúng tôi bố trí thí nghiệm kiểm tra hoạt tính như sau:
Cấy khuẩn lạc vi khuẩn muốn kiểm tra hoạt tính vào erlen chứa 100ml môi trường thử hoạt tính dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia. Sau 2, 10 và 17 ngày, lấy 10ml dung dịch từ môi trường để đo các giá trị ammonia và nitrite còn lại.
Theo dõi lượng ammonia mất đi: cho thuốc thử vào mẫu, sau đó đem đo OD và ghi nhận giá trị giảm/tăng lượng ammonia trong môi trường.
Theo dõi lượng nitrite tạo thành: cho thuốc thử vào mẫu, sau đó đem đo OD và ghi nhận giá trị giảm/tăng lượng nitrite trong môi trường.
Những vi khuẩn có hoạt tính oxi hoá ammonia sẽ làm giảm lượng ammonia và làm tăng lượng nitrite trong môi trường, từ đó ta kết luận về hoạt tính của giống vi khuẩn đang kiểm tra.
60
3.3.1.3.2 Hoạt tính oxi hóa nitrite
Dựa trên khả năng oxi hoá nitrite thành nitrate của dòng vi khuẩn Nitrobacter sp., chúng tôi bố trí thí nghiệm kiểm tra hoạt tính tương tự như trên, chỉ khác là chúng tôi chỉ theo dõi sự hao hụt nitrite trong môi trường chứ không đồng thời kiểm tra sự tạo thành nitrate.
3.3.1.3.3 So sánh hoạt tính
Kết quả kiểm tra hoạt tính theo phương pháp trên chưa kết luận được về hoạt tính mạnh/yếu của dòng vi khuẩn đem kiểm tra. Để thực hiện thí nghiệm so sánh hoạt tính giữa 2 dòng vi khuẩn cần thực hiện như sau:
1) Cân chính xác 0,1g sinh khối tế bào (qua ly tâm).
2) Huyền phù 0,1g sinh khối trên trong 10ml nước. Xác định mật độ tế bào trong 1ml dịch huyền phù. Tính gián tiếp ra tổng số tế bào có trong 0,1g sinh khối. 3) Cho 1ml dịch huyền phù vào môi trường thử hoạt tính.
4) Tiến hành theo dõi trong 1 tuần, thời gian lấy mẫu 24 giờ/lần.
5) Dựa trên đồ thị xác định hoạt tính riêng (µg cơ chất/tế bào/L.ngày) rồi qui về hoạt tính chung (mg cơ chất/g sinh khối/L.ngày).
6) Cách thức tiến hành theo dõi, lấy mẫu, đo OD như nhau giữa các dòng vi khuẩn cần so sánh hoạt tính.
Tuy nhiên khi diễn giải kết quả phân giải cơ chất như là hoạt tính mạnh/yếu của dòng này so với dòng khác, ta phải cân nhắc các yếu tố sau để chọn dòng vi khuẩn thích hợp nhất:
Đặc điểm sinh hoá của dòng vi khuẩn có hoạt tính riêng thấp nhưng phát triển nhanh, sinh sản mạnh nên tốc độ phân giải cơ chất của tổng số tế bào (hoạt tính chung) sẽ mạnh hơn so với dòng vi khuẩn có hoạt tính riêng cao hơn nhưng khả năng sinh sản thấp, thời gian thế hệ kéo dài (hoạt tính chung thấp).
Khả năng thích nghi và tính ổn định của hệ gen giúp dòng vi khuẩn này giữ được hoạt tính tuy thấp nhưng ổn định hơn các dòng khác có khả năng phân giải cao nhưng dễ thoái hoá qua các lần phân bào.
Quan hệ cộng sinh/hợp tác giữa dòng vi khuẩn này với hệ vi sinh bản địa có thể giúp tăng cường hoặc ức chế hoạt tính của dòng vi khuẩn đó.
3.3.1.4 Giữ giống
Vi khuẩn sau khi đã xác định thuộc chủng nitrate hoá thì sẽ được giữ giống trong thạch nghiêng. Mặc dù khả năng mọc trên thạch là rất kém, cũng như đòi hỏi thời gian lâu, dễ bị nhiễm các loại mốc dị dưỡng (các bào tử mốc này rất khó loại triệt để nếu chỉ sau vài lần cấy ria thu khuẩn lạc từ môi trường phân lập vi khuẩn).
61
Bên cạnh đó, giống còn được trữ ở dạng dịch lỏng và trữ ở nhiệt độ thấp 40C, định kì 1 tháng sẽ chuyển qua môi trường mới nhằm tránh thoái hoá giống.
3.3.2 Lên men thu sinh khối
Sau quá trình phân lập giống, chúng tôi chọn ra được 2 giống vi khuẩn để tiến hành lên men thu sinh khối. Chúng tôi đặt tên chúng là Nitrosomonas (có hoạt tính oxi hoá ammonia) và Nitrobacter (có hoạt tính oxi hoá nitrite).
3.3.2.1 Nhân giống Nitrosomonas
Môi trường lên men đồng thời cũng là môi trường phân lập những dòng vi khuẩn oxi hoá ammonia như sau:
Nitrosomonas sp. (NH4)2SO4 3 g/L K2HPO4 0,5 g/L MgSO4 0,05 g/L CaCl2 0,04 g/L Phenol red 0,05 mg/L FeSO4 0,05 mg/L CaCO3 1 g/L Nước cất đủ 1 lít Khử trùng 1210C trong 20 phút
Nếu làm thạch nghiêng thì không cho CaCO3 vào. Dùng agar 18g/L
Lƣu ý:
+ Phenol red nhằm đánh giá sự thay đổi pH trong môi trường, khi pH 8 thì phenol red sẽ ánh hồng, nếu pH càng giảm thì màu hồng càng nhạt. Đó là dấu hiệu cho biết phải bổ sung NaOH 1N hoặc KOH 1N vào dịch nuôi cấy để chỉnh về pH kiềm. Nguyên nhân là trong quá trình sống, Nitrosomonas sử dụng NH3 và giải phóng H+ ra môi trường qua phản ứng phân ly nước, điều này làm hạ giá trị pH của môi trường.
+ Nitrosomonas sp. khá nhạy cảm với ánh sáng, cần thiết phải được bao kín môi
trường nuôi vi khuẩn để làm mật độ tế bào tăng cao.
+ Sau khi nuôi cấy, ta sẽ trữ giống vi khuẩn ở nhiệt độ 40C thì chất lượng dịch giống sẽ thay đổi tương đối ít. Nếu để dịch giống ngoài nhiệt độ thường thì khả năng tạp nhiễm và thoái hoá sẽ rất nhanh.
+ Do hệ enzyme oxi hoá ammonia có kim loại Cu, vì thế trong một số tài liệu, người ta cho thêm thành phần vi lượng CuSO4 để giúp vi khuẩn tăng hoạt tính oxi hoá ammonia [15].
62 3.3.2.2 Nhân giống Nitrobacter
Môi trường lên men đồng thời cũng là môi trường phân lập những dòng vi khuẩn oxi hoá nitrite như sau:
Nitrobacter sp.
NaCl 0,3 g/L
KNO2 hoặc NaNO2 0,5 g/L
KH2PO4 0,25 g/L
MgSO4 1,4 g/L
CaCO3 1 g/L
Nước cất đủ 1 lít
Khử trùng 1210C trong 20 phút
Nếu làm thạch nghiêng thì không cho CaCO3 vào. Dùng agar 20g/L
Lƣu ý:
+ Do Nitrobacter sp. khả năng sống ở môi trường hỗn hợp có chất hữu cơ và khoáng vô cơ, nên nếu muốn tăng mật độ tế bào thì cần thiết bổ sung peptone hoặc dịch chiết nấm men vào môi trường. Đối với môi trường chỉ gồm khoáng vô cơ thì khả năng sinh trưởng sẽ kém hơn 10 lần so với môi trường hỗn hợp.
+ Ở nồng độ pH trên 9 sẽ gây ức chế vi khuẩn, nên khi chỉnh pH cần chú ý đến giá trị ngưỡng trên. pH tốt nhất là 7,5-8,5 và nên bổ sung dạng NaHCO3 10% để vừa tạo độ kiềm yếu, vừa cung cấp ion CO32- cho vi khuẩn dễ sử dụng.
+ Tuy các công trình không đề cập đến ánh sáng là tác nhân ức chế vi khuẩn Nitrobac- ter sp., nhưng vì chúng sống cộng sinh chặt chẽ với Nitrosomonas nên trong điều kiện tối ưu cần lên men trong điều kiện tối.
Phƣơng pháp lên men:
1) Chuẩn bị môi trường tiệt trùng dành cho các loại vi khuẩn, cho vào chai 5L một lượng thể tích 2L môi trường.
2) Sục không khí vào bình trong suốt 7 ngày để sinh khối phát triển.
3) Đối với bình lên men chứa vi khuẩn oxi hoá ammonia, thì do ban đầu pH 8,5 nên có màu hồng rất đậm (do phenol red là chất chỉ thị pH kiềm) . Sau một thời gian phát triển, vi khuẩn làm hạ giá trị pH xuống nên màu hồng nhạt dần. Lúc này cần bổ sung KOH vào để chỉnh lại giá trị pH tối ưu. 4) Sau khi lên men, dịch giống Nitrosomonas sp. sẽ được trộn với dịch giống
Nitrobacter sp. theo tỉ lệ 2:1 và trữ ở nhiệt độ 40C, dùng cho việc cố định lên các loại giá thể.
63
Hình 3-2. Lên men vi khuẩn nitrate hoá. 2 bình có màu hồng nhạt bên trái lên men
Nitrosomonas; bình còn lại lên men Nitrobacter.
3.3.3 Tạo giá thể 3.3.3.1 Giá thể BC 3.3.3.1 Giá thể BC
Môi trƣờng giữ giống (thạch nghiêng)
Glucose 20 g/L
Ammonium sulfate (SA) (NH4)2SO4 8 g/L Diammonium phosphate (DAP) (NH4)2HPO4 2 g/L
Nước dừa già 1 lít
Agar 20 g/L
Không cho acid acetic
Khử trùng 1210C trong 20 phút
Môi trƣờng nhân giống cấp 1, cấp 2
Glucose 20 g/L
Ammonium sulfate (SA) (NH4)2SO4 8 g/L Diammonium phosphate (DAP) (NH4)2HPO4 2 g/L
Nước dừa già 1 lít
Acid acetic đậm đặc 5 ml/L
Khử trùng 1210C trong 20 phút
Môi trƣờng lên men thu BC
Glucose 15~18 g/L
Ammonium sulfate (SA) (NH4)2SO4 8 g/L Diammonium phosphate (DAP) (NH4)2HPO4 2 g/L
Nước dừa già 1 lít
Acid acetic đậm đặc 5 ml/L
Thanh trùng 1000C trong 2 phút
64
Bước 1: từ ống giống gốc, ta đem cấy chuyền, giữ giống. Sau đó đem kiểm tra đặc điểm đại thể, vi thể trước khi lên men.
Bước 2: cấy ria quan sát hình thái khuẩn lạc, ta thấy những khuẩn lạc to (khoảng 1-2mm) sau 5 ngày ủ ở nhiệt độ phòng. Khuẩn lạc màu trắng, nhầy đặc trưng cho lớp màng BC hình thành xung quanh tế bào.
Bước 3: quan sát hình thái tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi (vật kính 100X), những tế bào que dài, Gram âm, đặc trưng cho chủng
Acetobacter xilynum.
Bước 4: tiến hành nhân giống cấp 1 trong ống nghiệm. Ở trên hình (1+2) lớp màng BC tạo ra sau 5 ngày nhân giống; (3) các tế bào kết thành dải màu nâu nhạt
65
Bước 5: tiến hành nhân giống cấp 2, thể tích khoảng 250-300ml. Sau 5 ngày thì lớp màng BC hình thành ở trên bề mặt khá dầy.
Bước 6: tiến hành lên men thu BC bằng cách cấy vào khay nhựa chứa môi trường lên men (A), sau 7 ngày ta sẽ thu được sản phẩm (B). Để tránh nấm mốc và ánh sáng rọi vào, ta cần bao giấy ở phía trên khay và đặt trong tủ kín. Tỉ lệ cấy giống khoảng 1/3-1/4 thể tích lên men.
Bước 7: BC sau khi lên men được rửa sạch, ngâm nước và xử lý để trung hoà pH. Có thể cắt ra những kích thước khác nhau tuỳ thuộc yêu cầu thí nghiệm cụ thể. Sau khi hấp tiệt trùng có thể bảo quản ở điều kiện thường.
Lƣu ý khi lên men BC:
+ Sau khi lên men được 1 tuần, miếng BC đã có bề dày khoảng 1 cm. Tại thời điểm này, trong dịch còn lại có lẫn lượng đường glucose còn sót, acic acetic và một số hợp chất trao đổi chất khác. Ta cần rửa sạch và vắt miếng BC vài lần rồi ngâm nước trong 24 giờ để các bó sợi hemincellulose trong BC giãn ra. Nếu thời gian ngâm nước quá lâu, màng BC sẽ ngậm nước nhiều, khi đó sẽ trở nên bở và dễ nát. Nếu thời gian ngâm nước ít, lượng đường chưa thoát ra hết, khi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ cao sẽ bị caramen hoá, làm BC chuyển từ màu trắng sang màu nâu đậm. Quá trình xử lý bằng cách ép miếng BC quyết định nên chất lượng về độ dai của giá thể. Có thể sử dụng cây lăn bột