Có nhiều loại chất mang được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật, chúng được phân loại theo các nhóm sau: chất mang có nguồn gốc hữu cơ, chất mang có nguồn gốc vô cơ, chất mang có nguồn gốc tự nhiên và hệ thống màng [5].
Điều kiện lựa chọn chất mang:
Giá thành chất mang phải rẻ.
Có tính chất cơ lý bền vững nên chịu được khuấy trộn, áp lực.
Chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng.
Kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của vi sinh vật.
Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học.
Cố định vi sinh vật dễ dàng.
Có thể sử dụng nhiều lần.
An toàn cho môi trường sống.
Độ trương tốt, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn.
38
2.5.2 Các phƣơng pháp cố định tế bào vi sinh vật
2.5.2.1 Phƣơng pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang
Tế bào cố định trên chất mang rắn được thực hiện bởi hiện tượng hấp phụ vật lý dựa trên lực tương tác tĩnh điện hoặc bằng liên kết cộng hóa trị giữa màng tế bào và chất mang. Chiều dày hấp phụ chỉ khoảng một lớp tế bào đến 1mm hoặc hơn nữa. Do không có rào cản giữa các tế bào và môi trường, do đó tế bào có thể tách rời và di chuyển vào môi trường.
Gắn tế bào bằng liên kết cộng hóa trị
Bản chất của liên kết cộng hóa trị là nối giữa tế bào vi sinh vật thông qua “cầu nối”. Cầu nối này có kích thước không lớn lắm, và có hai đầu, một đầu nối polymer và một đầu nối tế bào.
+ Chất mang để cố định tế bào vi sinh vật bằng phương pháp này thường là: cellulose, DEAE-cellulose, agarose, silicagel, bentoit, gỗ, mùn cưa…
Gắn tế bào bằng phương pháp hấp phụ
+ Trong quá trình cố định tế bào vi sinh vật bằng phương pháp hấp phụ có các liên kết sau hình thành: Liên kết tĩnh điện Val der walls: giữa tế bào và bề mặt chất mang tạo nên sự chênh lệch điện thế, làm cho tế bào và chất mang gắn liền với nhau; Lực mao quản: chất mang có các mao quản được ngâm trong huyền phù, do đó lực mao quản kéo tế bào với chất mang; Lực liên kết ion: việc gắn tế bào sẽ có hiệu quả cao khi điện tích của tế bào vi sinh vật và chất mang có dấu ngược nhau.
+ Chất mang để cố định tế bào vi sinh vật bằng phương pháp này thường là: vật liệu vô cơ như xốp, đất sét, thủy tinh có cấu trúc xốp…
2.5.2.2 Phƣơng pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel
Trong phương pháp cố định này, các tế bào đi vào trong cấu trúc của vật liệu làm chất mang. Polymer tạo thành màng bao bọc xung quanh tế bào. Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới múc đủ để tế bào không chui ra ngoài, nhưng vẫn đủ lớn để vận chuyển cơ chất và sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra vào. Các loại gel polysaccharide thường sử dụng để cố định như alginate, k-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid hoặc các polymer khác như gelatin, collagen, polyvinyl ethnol.
Để gói tế bào vi sinh vật vào trong khuôn gel, người ta tiến hành thanh trùng, trùng hợp hóa trong gel khi có mặt đồng thời tế bào vi sinh vật. Sau khi hoàn thành, tế bào vi sinh vật bị giữ chắc trong gel. Các tế bào vi sinh vật được gói theo kiểu này thường phân bố không đều. Thông thường chỉ những tế bào vi sinh vật ở gần bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất.
39
2.5.2.3 Phƣơng pháp cố định bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật
Các tế bào liên kết với nhau thành một khối tế bào. Phương pháp này được xem xét là có thể xảy ra ở các loại nấm men, nấm mốc và tế bào thực vật. Sự kết tụ của các tế bào nấm men là một ứng dụng quan trọng trong ngành sản xuất rượu vang do sự ảnh hưởng tới quá trình lên men và tách tế bào nấm men ra khỏi sản phẩm.
2.5.2.4 Phƣơng pháp cố định bằng membrane
Tế bào được chứa trong một lớp màng membrane hoặc trong vi bao. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật này thích hợp khi hoạt động trao đổi chất ít xảy ra. Một nhược điểm của phương pháp cố định tế bào bằng phương pháp vi bao là sự hạn chế của hoạt động trao đổi chất và có thể bị tắc ngẻn do tế bào tăng trưởng. Ngoài ra còn có nhược điểm là chuyên biệt đối với mỗi loại vi sinh vật.
Bảng 6. Ưu và nhược điểm của một số phương pháp cố định tế bào.
Ƣu điểm Nhƣợc điểm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hấp phụ lên bề mặt rắn
+ Quá trình thực hiện đơn giản
+ Điều kiện nhẹ nhàng nên đảm bảo khả năng sống của tế bào
+ Tế bào dễ bị tách khỏi chất mang do tác động cơ học hoặc khi thay đổi môi trường
+ Số lượng tế bào cố định thường thấp + Quá trình cố định thụ động khó điều khiển Liên kết cộng hóa trị với chất mang
+ Khả năng trao đổi chất cao. + Độ bền liên kết giữa tế bào và chất mang tốt
+ Thường ảnh hưởng đến sự sống và hoạt tính của tế bào
+ Mỗi tế bào phải có phản ứng đặc thù
Liên kết giữa các tế bào
+ Điều kiện nhẹ nhàng, khả năng kéo dài thời gian hoạt động của tế bào
+ Độ bền cơ học kém
Bao tế bào bằng membrane
+ Mật độ tế bào cố định lớn + Khả năng trao đổi chất tốt
+ Độ bền cơ học kém
+ Sự sinh trưởng tế bào dễ phá hủy màng chắn Bọc tế bào trong hệ thống lỗ xốp + Mật độ tế bào lớn + Độ bền cơ học cao
+ Ứng dụng cho nhiều loại tế bào khác nhau
+ Cản trở sự trao đổi chất của tế bào + Có thể ảnh hưởng đến hoạt tính tế bào [5] 2.5.3 So sánh tế bào cố định và tế bào tự do o Ƣu điểm
40
Kéo dài thời gian hoạt động và ổn định của tế bào. Đồng thời chất mang cố định là nhân tố bảo vệ tế bào chống lại các tác nhân ảnh hưởng như pH, nhiệt độ, dung môi, kim loại nặng…
Tăng hấp thu cơ chất và cải thiện năng suất.
Có khả năng lên men liên tục.
Tăng sức chịu đựng với nồng độ cơ chất cao, giảm sự ức chế của sản phẩm cuối.
Có khả năng lên men nhiệt độ thấp nâng cao chất lượng sản phẩm.
Sản phẩm được thu hồi dễ dàng hơn do giảm bớt quá trình tách chiết và lọc do đó làm giảm chi phí yêu cầu về thiết bị và năng lượng.
Có khả năng tái sử dụng trong quá trình lên men mà không cần loại bỏ khỏi môi trường.
Giảm khả năng nhiễm vi khuẩn do mật độ tế bào cao .
Có khả năng sử dụng các thiết bị phản ứng đơn giản, nhỏ do đó làm giảm chi phí.
Giảm thời gian tạo thành sản phẩm.
o Nhƣợc điểm
Hoạt lực thấp hơn tế bào tự do. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong môi trường phản ứng, không tránh khỏi hiện tượng rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang.
Trong ý nghĩa trên, việc tìm ra chất mang giúp cố định hệ vi khuẩn nitrate hoá sẽ giúp các trại nuôi tôm có thể tiết kiệm chi phí trong việc mua các loại chế phẩm vi sinh dùng một lần, đồng thời tế bào được bảo vệ tốt hơn trước các tác nhân có hại trong môi trường.
Qua sàng lọc một số loại chất mang đáp ứng các tiêu chí đã liệt kê, chúng tôi chọn ra bacterial cellulose (BC) đại diện cho chất mang có nguồn gốc hữu cơ và đá san hô đại diện cho chất mang vô cơ, nhằm khảo sát hoạt lực và số lần tái sử dụng giữa 2 chất mang này, giúp tìm ra loại chế phẩm thích hợp áp dụng trong điều kiện thực tế.
2.6 Giá thể hữu cơ bacterial cellulose (BC) 2.6.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 2.6.1 Vi khuẩn Acetobacter xylinum
o Phân loại
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
41
o Đặc điểm hình thái
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không di
động và không sinh bào tử. Tế bào A. xylinum đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi dài, có khả năng tạo váng dày trên môi trường nuôi cấy.
Hình 2-18. Hình thái tế bào Acetobacter xilinum [1].
o Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
A. xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm Gram của chúng có thể bị biến
đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí. Chúng không sử dụng muối NH4+ làm nguồn N duy nhất, đồng thời trên bề mặt môi trường dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose. Ngoài ra, A. xy-
linum tạo: (1) phản ứng catalase dương tính, (2) oxy hóa ethanol thành CO2 và H2O,
(3) không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, (4) không tạo sắc tố nâu, (5) tổng hợp cellulose.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào
chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng có thể chuyển glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trường giảm từ 1 đến 2 đơn vị. Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu của A. xylinum là 5,5 và chúng không phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Khi nuôi trên môi trường đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đường nuôi cấy.
2.6.2 Vai trò của bacterial cellulose đối với Acetobacter xylinum
A. xylinum là vi khuẩn không có khả năng quang hợp. Trong môi trường tự
nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào, màng BC là một ví dụ. Những tế bào vi khuẩn sản xuất cellulose
42
được bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose.
Một vài tác giả cho rằng, cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng
A. xylinum sản xuất cellulose. Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của các lớp
cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc, và các vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn A. xylinum có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp vỏ bao. Cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% tế bào A. xylinum được bao BC sống sót sau 1 giờ xử lý tia cực tím. Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể, chỉ còn 3%.
2.6.3 Các đặc điểm cấu trúc BC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống với PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5 nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên. Các sợi cơ bản kết lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30.000-75.000 nm hay gỗ bulô (Betula) là 14.000- 40.000 nm. Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1-9 μm làm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hy- drogen. BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. BC có mức độ poly- mer hóa từ 2.000-6.000; một vài trường hợp đạt tới 16.000-20.000, trong khi mức po- lymer hóa ở thực vật là 13.000-14.000. So với PC, BC có độ kết tinh cao hơn, thấm nước tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn hơn. BC được hình thành qua một quá trình phức tạp gồm nhiều giai đoạn, cho sản phẩm có kích thước khác nhau theo sơ đồ sau:
43
Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh. Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Các miếng BC này được gọi là BC trên môi trường tĩnh (S-BC: Static BC). Các sợi cellulose sơ cấp liên tục được đẩy ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng. Các dải cellulose từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhưng không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A. xylinum. Các sợi BC kế nhau được tạo ra từ môi trường tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC được tạo từ môi trường lắc (A-BC: Agitated-BC). A-BC được tạo ra dưới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường. Các sợi đan lưới với nhau trong môi trường lắc giống như mô hình kẻ ô, có cả hai hướng song song và vuông góc. Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC được quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử. Những sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau. Những sợi A-BC thì rối rắm và cong. Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A-BC (0,1-0,2μm) lớn hơn sợi S-BC (0,05 – 0,10μm). Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [1].
Hình 2-19. BC được tạo từ môi trường tĩnh (a) và môi trường lắc (b) [1].
2.6.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men tạo BC
o Phƣơng pháp lên men: Ngày nay, sản xuất BC được thực hiện bằng nhiều phương pháp lên men khác nhau như nuôi cấy lắc, nuôi cấy tĩnh trên khay… Việc lựa chọn phương pháp nào để thực hiện là tùy thuộc vào định hướng ứng dụng vì sản phẩm BC sẽ có đặc tính hóa lý và cấu trúc khác nhau ứng với từng phương pháp khác nhau. Khi nuôi cấy tĩnh hay bề mặt, màng BC (S-BC) được tích lũy trên bề mặt môi trường nuôi. S-BC thương mại thông dụng như Nata-de Coco, màng rung truyền âm thanh, làm màng trị bỏng… Còn khi nuôi cấy lắc thì BC (A-BC) sẽ có dạng sợi huyền phù, hay dạng khối không đồng nhất (dạng
44
hột nhỏ, hoặc hình cầu, hình elip). Kiểu nuôi này thích hợp hơn cho sản xuất BC công nghiệp và cho các ứng dụng khác của A-BC như: mỹ phẩm, vật liệu, chất nhũ hóa… Kiểu lên men BC này chưa được nghiên cứu và tiến hành ở Việt Nam. Theo các nhà nghiên cứu thì phương pháp nuôi cấy chìm cho hiệu suất sinh tổng hợp BC cao hơn vì các thiết bị lên men chìm có thể cung cấp tốt lượng oxy cho tế bào hoạt động. Đồng thời BC này còn có khả năng giữ nước cao hơn từ phương pháp tĩnh. Tuy nhiên, trở ngại ở đây là thường phát sinh các