Nguồn Chế phẩm Eco-Bio
Phân lập
Khuẩn lạc phát triển mạnh trên cả 2 môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia và nitrite.
Sau 4 ngày có thể nhìn rõ khuẩn lạc.
Đại thể Khuẩn lạc tròn, trắng đục, có khi vàng nâu. Kích thước khoảng 1,5 mm. Vi thể Dạng que ngắn, nhuộm màu tốt ở 2 cực khi tế bào còn non. Khi tế bào già thì khó nhuộm màu. Tế bào không di chuyển. Xu hướng đứng cụm lại từ 3 đến 5 tế bào. Gram âm. Hoạt tính +Môi trƣờng chỉ có NH4+:
Sau 17 ngày theo dõi, lượng ammonia trong môi trường giảm từ 13 mg/L xuống 9 ml/L. Đồng thời lượng nitrite trong môi trường lại tăng từ 0,003 mg/L lên khoảng 0.1 mg/L. Như vậy, vi khuẩn có hoạt tính oxi hoá ammonia.
+Môi trƣờng chỉ có NO2- :
Không có xu hướng làm tăng hay giảm nitrite.
77
Ghi chú Chúng tôi thực hiện huấn luyện thích nghi với giống CKL-1a, sau đó đã thu
nhận lại được giống sau huấn luyện, được đặt tên CKL-1b.
Kết luận Kết quả định danh của Trung tâm phân tích Hải Đăng cho thấy vi khuẩn
CKL-1a là Nitrosomonas mobilis.
4.1.2 Giống vi khuẩn CKL-2a Nguồn Chế phẩm Eco-Bio Nguồn Chế phẩm Eco-Bio
Phân lập Khuẩn lạc mọc mạnh trên môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá nitrite.
Sau 4 ngày có thể nhìn rõ khuẩn lạc.
Đại thể
Khuẩn lạc có 2 kiểu: trong môi trường khô thì tròn, trắng đục, nửa cầu nhô lên khỏi agar, kích thước 0,6mm; trong môi trường ẩm thì nhợt nhạt, trong suốt, kích thước 1,5-2mm.
Vi thể
Khá nhỏ, hình que ngắn, tròn ở 2 cực. Tế bào đứng riêng lẻ, đều. Di chuyển nhanh nhờ tiên mao.
Nhuộm màu tốt. Gram âm.
Hoạt tính
+Môi trƣờng chỉ có NH4+:
Không có xu hướng làm tăng hay giảm ammonia, không phát hiện lượng ni- trite sinh ra trong môi
78
trường.
+Môi trƣờng chỉ có NO2- :
Sau 17 ngày khảo sát, lượng nitrite giảm mạnh từ 1,2 mg/L về gần bằng 0. Như vậy, vi khuẩn có hoạt tính oxi hoá nitrite.
Ghi chú Chúng tôi thực hiện huấn luyện thích nghi với giống CKL-2a, sau đó đã thu
nhận lại được giống sau huấn luyện, được đặt tên CKL-2b.
Kết luận Kết quả định danh của Trung tâm phân tích Hải Đăng cho thấy vi khuẩn
CKL-2a là Nitrobacter vulgaris.
4.1.3 Giống vi khuẩn PKL-2 Nguồn Chế phẩm Pondprotect Nguồn Chế phẩm Pondprotect
Phân lập
Khuẩn lạc mọc được trên môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia và nitrite.
Sau 4 ngày có thể nhìn rõ khuẩn lạc.
Đại thể
Khuẩn lạc dạng tròn, trắng đục, xung quanh có những sợi nhỏ màu trắng. Một số khuẩn lạc có cùng hình thái nhưng ngả màu nâu vàng. Giữa khuẩn lạc có một chấm trắng.
Vi thể
Hình que, khá dài. Tế bào dính nhau ở cực, từ 3 đến 5 tế bào tạo thành chuỗi ngắn. Nhuộm màu tốt ở 2 cực. Gram âm.
Kết luận Đã thu được giống thuần.
79 4.1.4 Giống vi khuẩn PKL-3
Nguồn Chế phẩm Pondprotect
Phân lập
Khuẩn lạc mọc được trên môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia và nitrite.
Sau 4 ngày có thể nhìn rõ khuẩn lạc.
Đại thể Khuẩn lạc dạng tròn, trắng đục. Kích thước từ 1-2mm. Vi thể Dạng trực cầu, que ngắn. Tế bào đứng riêng lẽ. Nhuộm màu tốt ở 2 cực. Gram âm.
Kết luận Đã thu được giống thuần.
Cần khảo sát hoạt tính và định danh vi khuẩn.
4.1.5 Giống vi khuẩn PKL-5 Nguồn Chế phẩm Pondprotect
Phân lập
Khuẩn lạc mọc được trên môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia và nitrite.
Sau 4 ngày có thể nhìn rõ khuẩn lạc.
Đại thể
Khuẩn lạc dạng tròn, trắng đục. Kích thước từ 1-2mm.
80 Vi thể
Hình que, khá dài. Dính nhau theo chiều ngang tạo thành từng cụm 3 đến 5 tế bào. Khi tế bào non thì hình que dài hơn tế bào già. Nhuộm màu tốt ở 2 cực. Gram âm.
Kết luận Đã thu được giống thuần. Cần khảo sát hoạt tính và định danh vi khuẩn. 4.1.6 Giống vi khuẩn PKL-6
Nguồn Chế phẩm Pondprotect
Phân lập
Khuẩn lạc mọc được trên môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia và nitrite.
Sau 4 ngày có thể nhìn rõ khuẩn lạc.
Đại thể
Khuẩn lạc dạng to, tròn, trắng đục, đôi khi ngả vàng. Kích thước 1,5-3mm.
Vi thể
Hình que, thon dài. Khi tế bào non thì dễ nhuộm màu hơn tế bào già. Liên kết với nhau theo chiều ngang tạo thành từng chuỗi từ 3 đến 6 tế bào.
Gram âm.
Kết luận Đã thu được giống thuần.
Cần khảo sát hoạt tính và định danh vi khuẩn.
4.1.7 Giống vi khuẩn NKL-1
Nguồn Nước biển thử nghiệm chế phẩm
Phân lập
Khuẩn lạc mọc được trên môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia và nitrite.
81 Đại thể
Khuẩn lạc dạng nhỏ, tròn, trắng đục đôi khi ngả nâu vàng.
Vi thể
Hình cầu, liên kết rất sát nhau theo từng đám tế bào lớn. Dễ nhuộm màu. Gram âm.
Ghi chú Sự hiện diện của giống vi khuẩn này giúp giải thích biến động ammonia và
nitrite trong nước biển đối chứng ở thí nghiệm kiểm tra hoạt lực chế phẩm.
Kết luận Đã thu được giống thuần. Cần khảo sát hoạt tính và định danh vi khuẩn. 4.1.8 Giống vi khuẩn NKL-2
Nguồn Nước biển thử nghiệm chế phẩm
Phân lập
Khuẩn lạc mọc được trên môi trường dành cho vi khuẩn oxi hoá ammonia và nitrite.
Sau 4 ngày có thể nhìn rõ khuẩn lạc.
Đại thể
Khuẩn lạc to, nhầy, trắng đục. Kích thước lên đến 2- 5mm.
Vi thể
Rất nhiều loại vi khuẩn sống chung với nhau. Gram âm.
82
Kết luận Cần khảo sát thêm đặc điểm đại thể và vi thể để tách riêng những giống vi
khuẩn riêng biệt (nếu có).
4.2 Khảo sát quá trình cố định tạo chế phẩm
Từ kết quả phân lập giống ở trên, chúng tôi chọn 2 giống vi khuẩn là CKL-1a và CKL-2a để đưa vào lên men thu sinh khối và thử nghiệm hoạt tính phân giải ammonia và nitrite.
Theo nguyên tắc thì chỉ tiêu dùng để so sánh các nghiệm thức cố định tế bào là mật độ cfu/g. Tuy nhiên vì đặc thù của chế phẩm là xử lý môi trường nên chúng tôi quan tâm đến chỉ tiêu khả năng phân giải ammonia của giá thể sau các chế độ cố định khác nhau, vì không phải cứ nhiều tế bào vào giá thể thì sẽ làm khả năng phân giải ammonia tăng cao mà đôi khi chúng lại tác động cạnh tranh lẫn nhau làm hiệu quả xử lý giảm xuống.
4.2.1 Giá thể BC
Bảng 8. Kết quả khảo sát khả năng phân giải ammonia (mg N-NH4+/L) của giá thể BC.
NGÀY NGHIỆM THỨC Đối chứng BC 48h BC 72h BC 96h BC tl 1/2 BC tl 1/3 BC tl 1/4 BC tl 1/5 1 31 31 30 31 31 31 30 30 3 5 32 25 28 29 28 26 29 28 7 9 11 13 29 22 25 27 26 24 21 25 15 17 19 21 26 16 18 20 24 22 16 18 23
83
25 27
29 25 10 11 15 14 12 8 11
Nghiệm thức:
Đối chứng: nước biển đối chứng, không bổ sung giá thể BC.
BC 48h: nước biển có bổ sung giá thể BC được cố định sau 48 giờ.
BC 72h: nước biển có bổ sung giá thể BC được cố định sau 72 giờ.
BC 96h: nước biển có bổ sung giá thể BC được cố định sau 96 giờ.
BC tl 1/2: nước biển có bổ sung giá thể BC được cố định theo tỉ lệ khối lượng giá thể và dịch vi khuẩn là 1:2 trong 72 giờ.
BC tl 1/3: nước biển có bổ sung giá thể BC được cố định theo tỉ lệ khối lượng giá thể và dịch vi khuẩn là 1:3 trong 72 giờ.
BC tl 1/4: nước biển có bổ sung giá thể BC được cố định theo tỉ lệ khối lượng giá thể và dịch vi khuẩn là 1:4 trong 72 giờ.
BC tl 1/5: nước biển có bổ sung giá thể BC được cố định theo tỉ lệ khối lượng giá thể và dịch vi khuẩn là 1:5 trong 72 giờ.
4.2.1.1 Thời gian bẫy hấp phụ
Đồ thị 1. Kết quả phân giải ammonia của giá thể BC được cố định ở các chế độ bẫy hấp phụ khác nhau.
Qua đồ thị ta thấy nghiệm thức BC 48h cho kết quả mạnh và rõ rệt hơn so với BC 72h và BC 96h. Trong giai đoạn khảo sát chế độ bẫy hấp phụ này, chúng tôi quan tâm đến lượng ammonia đã phân giải đầu – cuối của quá trình xử lý và phân tích ảnh hưởng của các thông số bẫy hấp phụ lên khả năng phân giải ammonia.
0 5 10 15 20 25 30 35 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 m g N -NH 4 + /L Ngày Đối chứng BC 48h BC 72h BC 96h
84
Đồ thị 2. Tổng lượng ammonia đã phân giải sau 29 ngày xử lý trên 1L nước biển. Kết quả trên cho thấy giá thể được cố định sau 48 giờ xử lý đến 22 mg N-NH4+ cao hơn nhiều so với kết quả 19 và 16 mg N-NH4+
của 2 chế độ còn lại. Điều này gợi ý rằng giá thể BC có thể đã bão hoà ở thời gian hấp phụ thấp hơn 48 giờ, và nếu để càng lâu thì quá trình nhả hấp phụ và hấp phụ vào sẽ cân bằng nhau làm mật độ vi khuẩn trong BC không đạt tối đa. Điều quan trọng là phải gắp BC ra ngay sau khi đã hấp phụ cao nhất sau 1 khoảng thời gian nhất định. Trong đề tài này, chúng tôi chọn chế độ 48 giờ cho các thí nghiệm kế tiếp nhưng đề nghị nên khảo sát lại thời gian bẫy hấp phụ ở các mốc thời gian nhỏ hơn (24, 36 và 48 giờ).
4.2.1.2 Tỉ lệ giá thể
Đồ thị 3. Kết quả phân giải ammonia của giá thể BC được cố định ở các tỉ lệ khối lượng so với dịch vi khuẩn khác nhau.
22 19 16 0 5 10 15 20 25 30 BC 48h BC 72h BC 96h m g N -NH 4 + 0 5 10 15 20 25 30 35 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 m g N -NH 4 + /L Ngày Đối chứng BC tl 1/2 BC tl 1/3 BC tl 1/4 BC tl 1/5
85
Do cùng thời gian hấp phụ là 72 giờ, chỉ khác nhau về tỉ lệ giá thể so với dịch giống, nên về nguyên tắc, giá thể nào bẫy hấp phụ với lượng giống nhiều hơn sẽ có hoạt lực phân giải tốt hơn. Tuy vậy qua đồ thị, ta thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa các chế độ trên trong 10 ngày đầu, và có sự tăng mạnh hoạt lực phân giải ở chế độ BC tl 1/4 và 1/5 trong khi 2 chế độ còn lại thì giảm đều đặn gần như nhau.
Đồ thị 4. Tổng lượng ammonia đã phân giải sau 29 ngày xử lý trên 1L nước biển. Đồ thị trên cho thấy khi tăng dần tỉ lệ bẫy hấp phụ thì khả năng phân giải ammo- nia cao dần từ 1/2 đến 1/4, nhưng nếu vượt qua ngưỡng đó thì khả năng phân giải không cao nữa. Cụ thể ở nghiệm thức BC tl 1/5 thì lượng ammonia phân giải sụt xuống còn 19 mg, ngang với BC tl 1/3. Nguyên nhân vì giá thể BC đã bão hoà vi khuẩn ở chế độ cố định 72 giờ và lúc đó có hiện tượng nhả hấp phụ mạnh khi mật độ vi khuẩn trong dịch và trong giá thể chênh lệch nhau quá cao (đến 5 lần).
Trên lý thuyết ta chọn tỉ lệ 1/4 là thông số cho các thí nghiệm tiếp theo, nhưng chúng tôi chọn tỉ lệ 1/2 vì các lý do: tiết kiệm dịch giống phục vụ cho việc cố định và xét về tổng lượng ammonia đã phân giải thì ở tỉ lệ này kết quả thu được rất khả quan (phân giải được gần 17 mg N-NH4+/L sau 29 ngày xử lý).
4.2.2 Giá thể đá san hô
Bảng 9. Kết quả khảo sát khả năng phân giải ammonia (mg N-NH4+/L) của giá thể đá san hô. NGÀY NGHIỆM THỨC Đối chứng CR 48h CR 72h CR 96h CR tl 1/2 CR tl 1/4 CR tl 1/5 CR tl 1/8 1 31 32 32 32 31 31 32 32 3 5 32 33 34 33 32 33 34 33 7 17 19 23 19 0 5 10 15 20 25 30 BC tl 1/2 BC tl 1/3 BC tl 1/4 BC tl 1/5 m g N -NH 4 +
86 9 11 13 29 25 27 29 25 26 27 28 15 17 19 21 26 17 18 20 20 18 18 21 23 25 27 29 25 2 6 7 7 5 6 10 Nghiệm thức:
Đối chứng: nước biển đối chứng, không bổ sung giá thể đá san hô.
CR 48h: nước biển có bổ sung giá thể đá san hô được cố định sau 48 giờ.
CR 72h: nước biển có bổ sung giá thể đá san hô được cố định sau 72 giờ.
CR 96h: nước biển có bổ sung giá thể đá san hô được cố định sau 96 giờ.
CR tl 1/2: nước biển có bổ sung giá thể đá san hô được cố định theo tỉ lệ khối lượng giá thể và dịch vi khuẩn là 1:2 trong 72 giờ.
CR tl 1/4: nước biển có bổ sung giá thể đá san hô được cố định theo tỉ lệ khối lượng giá thể và dịch vi khuẩn là 1:4 trong 72 giờ.
CR tl 1/5: nước biển có bổ sung giá thể đá san hô được cố định theo tỉ lệ khối lượng giá thể và dịch vi khuẩn là 1:5 trong 72 giờ.
CR tl 1/8: nước biển có bổ sung giá thể đá san hô được cố định theo tỉ lệ khối lượng giá thể và dịch vi khuẩn là 1:8 trong 72 giờ.
87 4.2.2.1 Thời gian bẫy hấp phụ
Đồ thị 5. Kết quả phân giải ammonia của giá thể đá san hô được cố định ở các chế độ bẫy hấp phụ khác nhau.
Đồ thị trên cho thấy san hô được cố định ở các khoảng thời gian 48, 72 và 96 giờ đều cho hiệu quả xử lý tốt gần như nhau. Mặc dù có biến động ammonia trong khoảng 10 ngày đầu nhưng sau đó lượng ammonia bị phân giải liên tục và đều đặn trong suốt thời gian còn lại.
Đồ thị 6. Tổng lượng ammonia đã phân giải sau 29 ngày xử lý trên 1L nước biển. Kết quả chứng tỏ đá san hô được cố định sau 48 giờ có khả năng xử lý ammonia cao hơn hẳn 2 chế độ còn lại, nghĩa là khi ủ suốt 48 giờ trong dịch vi khuẩn thì giá thể đã bão hoà và nếu tiếp tục thì vi khuẩn sẽ không vào thêm mà còn di chuyển ngược ra ngoài. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 m g N -NH 4 + /L Ngày Đối chứng CR 48h CR 72h CR 96h 30 26 25 0 5 10 15 20 25 30 35 40 CR 48h CR 72h CR 96h m g N -NH 4 +
88
Do đó chúng tôi chọn giá trị 48 giờ là thông số bẫy hấp phụ để tạo chế phẩm đá san hô trong các thí nghiệm tiếp theo. Nhưng để tối ưu thì cần thí nghiệm với các mốc thời gian bẫy hấp phụ nhỏ hơn (24, 36, 48 giờ) nhằm chọn ra thời gian thích hợp nhất.
4.2.2.2 Tỉ lệ giá thể
Đồ thị 7. Kết quả phân giải ammonia của giá thể đá san hô được cố định ở các tỉ lệ khối lượng so với dịch vi khuẩn khác nhau.
Đá san hô được bẫy hấp phụ ở các tỉ lệ khác nhau cho thấy không có sự khác biệt lớn về khả năng phân giải ammonia trong suốt quá trình khảo sát. Vì vậy, ta sẽ chọn tỉ lệ cố định đá san hô và dịch vi khuẩn là 1/2 để tiết kiệm dịch hấp phụ. Tuy nhiên, đặc thù của đá san hô là ở dạng rắn, nên khi cho lượng dịch quá ít vào erlen thì phần chất lỏng không ngập hết giá thể dẫn đến khả năng vi khuẩn bám vào không đồng nhất.
Đồ thị 8. Tổng lượng ammonia đã phân giải sau 29 ngày xử lý trên 1L nước biển.