Phần lớn vi khuẩn oxi hoá nitrite thuộc nhóm Gram âm, sử dụng nitrite là nguồn sinh năng lượng và CO2 là nguồn carbon chính. Các vi khuẩn thuộc nhóm này sống tự dưỡng hoá vô cơ nghiêm ngặt, ngoại trừ giống Nitrobacter có thể sống trên môi trường hữu cơ. Đồng thời Nitrobacter còn có khả năng khử nitrate trong điều kiện kị khí để thu năng lượng.
Vi khuẩn oxi hoá nitrite có nhiều hình dạng khác nhau như dạng que, cầu và dạng xoắn. Về mặt lịch sử thì nhóm vi khuẩn này được tìm ra dựa trên hình dạng tế bào và sự sắp xếp của màng bao tế bào chất, các khoá phân loại dựa trên công trình nghiên cứu của Sergei và Helene Winogradsky năm 1892. Thời gian sinh trưởng của nhóm vi khuẩn này thường thấp, thời gian thế hệ kéo dài từ 8 giờ đến vài ngày. Tốc độ sinh trưởng bị chi phối bởi mức độ tập trung cơ chất, nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxy hoà tan. Phần lớn vi khuẩn oxi hoá nitrite phát triển rất tốt ở nồng độ nitrite từ 2-30 mM ở pH 7,5-8 và nhiệt độ 25-300C. Khi lên men trong môi trường hỗn hợp giữa khoáng vô cơ và các chất hữu cơ thì sinh khối cao gấp 10 lần so với trong môi trường chỉ có khoáng vô cơ [14].
2.2.3.1 Phân lập, giữ giống và nuôi cấy
Vi khuẩn oxi hoá nitrite được phân lập trên môi trường khoáng có chứa nitrite. Các công thức môi trường vô cơ, hữu cơ, hỗn hợp được đưa ra như bảng bên dưới. Cần lưu ý là dung dịch nuôi cấy cần được ủ ít nhất từ 1 đến vài tháng trong môi trường
18
tối. Vi khuẩn này nhạy cảm với áp suất cục bộ do oxy gây ra trong môi trường lỏng, tế bào phát triển trên bề mặt thạch agar khá kém, khuẩn lạc nhỏ hơn 0,1 mm [3].
Đối với việc giữ giống thì các dòng vi khuẩn nitrate hoá nói chung đều có thể sống được trong môi trường lỏng nghèo dinh dưỡng trong hơn 1 năm ở nhiệt độ 170C. Tuy nhiên tế bào cần được chuyển qua môi trường mới định kì 4 tháng. Kĩ thuật lạnh đông dịch tế bào có sự bổ sung chất đệm bảo vệ là sucrose và histidine cho thấy hiệu quả kém khi chỉ 0,5% tế bào Nitrobacter có thể sống sau 1 năm. Hiện có cách giữ giống Nitrobacter đến vài năm, đó là nuôi dịch trong chai 1 lít, sau đó ở trên bề mặt dịch thì phủ lên một môi trường đặc biệt và đậy kín bằng nắp. Glycerol được dùng thay pyruvate để giữ pH ổn định trong một thời gian dài. Vì vi khuẩn Nitrobacter có thể oxi hoá nitrite trong điều kiện hiếu khí và khi hết oxy thì chúng khử nitrate trong điều kiện kị khí, nên người ta đã thu được sinh khối tế bào cao bằng cách này [14]. Bảng 3. Các môi trường khác nhau cho vi khuẩn oxi hoá nitrite: môi trường A (khoáng vô cơ) đề xuất bởi Bock (1893), phân lập vi khuẩn từ đất; môi trường B (khoáng vô cơ) đề xuất bởi Watson và Waterbury (1971), phân lập vi khuẩn từ biển; môi trường C (hỗn hợp) đề xuất bởi Bock (1983) và môi trường C (hữu cơ) nhưng không cho NaNO2. Chỉnh pH sau khi đã hấp tiệt trùng, thường sử dụng NaHCO3 10%.
Thành phần Môi trƣờng A B C Nước cất (ml) 1000 300 1000 Nước biển (ml) 700 NaNO2 (mg) 200-2000 69 200-2000 MgSO4.7H2O (mg) 50 100 50 CaCl2.2H2O (mg) 6 CaCO3 (mg) 3 3 KH2PO4 (mg) 150 1,7 150 FeSO4.7H2O (mg) 0,15 0,15
Chelated iron 13% FeNaEDTA (mg) 1
Na2MoO4.2H2O (µg) 30 (NH4)2Mo7O24.4H2O (µg) 50 50 MnCl2.6H2O (µg) 66 CoCl2.6H2O (µg) 0,6 CuSO4.5H2O (µg) 6 ZnSO4.7H2O (µg) 30 NaCl (mg) 500 500 Sodium pyruvate (mg) 550 Dịch nấm men (mg) 1500 Peptone (mg) 1500 pH chỉnh đến giá trị 8,6 6 7,4 [20].
19 2.2.3.2 Đặc điểm về giống
Việc phân loại vi khuẩn oxi hoá nitrite về cơ bản là sự khác nhau ở đặc điểm hình thái, kiểu gen và đặc tính sinh hoá. Với các tiêu chí này, người ta đã phân loại vi khuẩn oxi hoá nitrite thành 4 giống chính là Nitrobacter, Nitrosococcus, Nitrospina và
Nitrospira. Trong đó có 8 loài vi khuẩn được phân biệt dựa trên các đặc điểm cụ thể:
kích thước tế bào, cấu trúc tinh thể màng bao tế bào, sự hiện diện của carboxysome, tỉ lệ G + C trong DNA và đặc điểm phân bố.
Bảng 4. Đặc điểm hình thái-sinh hoá của vi khuẩn oxi hoá nitrite.
Vi thể Đại thể Sinh hoá
GIỐNG
Nitrobacter sp. Tế bào dạng que, oxi hoá nitrite thành nitrate.
Nitrobacter winogradsky + Que ngắn 0,6-0,8 x 1,0-2,0 μm, không di động với màng bao gelatin. + Không dễ nhuộm màu. Gram âm.
+ Khuẩn lạc trên agar từ 7 đến 10 ngày rất bé, có màu nâu nhạt, có dạng tròn, sau 10 ngày thì khuẩn lạc đậm màu hơn. + Trên silica gel thì khuẩn lạc nhỏ hơn nhưng đậm đặc hơn trên agar.
+ Trên thạch nghiêng sau 7 đến 10 ngày thì khuẩn lạc xuất hiện ít, không rõ, có màu xám.
+ Có thể nuôi cấy trong môi trường không có chất hữu cơ. Nhạy cảm với sự có mặt của một số hợp chất hữu cơ nhất định.
+ Trong môi trường không có chất hữu cơ, sau 10 ngày, tạo thành bùn kết bông. Nhạy cảm với muối
ammonium trong môi
trường kiềm.
+ Sống hiếu khí. Sống tự dưỡng nghiêm ngặt.
+ Nhiệt độ tối ưu từ 25- 280C.
+ Phân bố ở trong đất.
Nitrobacter
agilis (sau này
người ta xếp loài này vào 1 dòng của Nitrobacter winogradsky) [31] + Hình que 0,5-0,9 µm thỉnh thoảng đứng thành cặp hoặc đám tế bào lớn. + Di động rất nhanh nhờ vào một tiên mao dài từ 7-10 lần chiều dài tế bào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Trên agar có nitrite thì sau 2 tuần, khuẩn lạc có dạng nửa cầu nhô lên, khuẩn lạc trong suốt.
+ Môi trường vô cơ phải chứa nitrite, tế bào phân tán đều trong môi trường nuôi cấy.
+ Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng từ 25-300C, cho oxi hoá là 280C.
+ Hoàn toàn không oxi hoá ở nhiệt độ 370C. + Nhiệt độ bị chết ở 600C trong 5 phút. + Sống tự dưỡng nghiêm ngặt. Phân bố ở nhà kính, bùn hoạt tính, đất, ao nuôi thuỷ sản.
20 GIỐNG
Nitrocystis sp. Tế bào dính với nhau thành mảng lớn, khuẩn lạc nhầy, nổi lên khối u nhỏ.
Nitrocystis sarcinoides
+ Dạng que nhỏ kích thước 0,5 x 1µm. + Tế bào có dạng elip hoặc dạng cái chêm, tập hợp tế bào giống như những hạt kê nhỏ.
+ Trên silica gel thì ở bề mặt khuẩn lạc có lớp áo cao lanh, khuẩn lạc xuất hiện như những hột nhỏ có màu hổ phách, nổi lên.
+ Khuẩn lạc có thể lớn đến 5 mm về đường kính, rất nhầy và nhớt khi còn nhỏ và trở nên nâu dần theo thời gian, chặt lại giống như lớp vảy và hình thành những hạt nhỏ như cát.
+ Mỗi khuẩn lạc được bao bên ngoài bởi một vài lớp màng nhầy để giữ chúng sát nhau và do đó cả khuẩn lạc sẽ cùng dính vào que cấy khi cấy chuyền.
+ Sống hiếu khí. Ở bùn hoạt tính. Nitrocystis micropunetata + Tế bào dạng que elip, khoảng 0,5 µm đường kính, rất khó nhuộm ngoại trừ ở 2 đầu tế bào. + Bao bọc bởi lớp vỏ nhầy.
+ Khuẩn lạc trên silica gel thì giống như Nitrocystis
sarcinoides ngoại trừ có viền rất rõ và chắc hơn. Tế
bào không dính với nhau bởi lớp màng nhầy trong khuẩn lạc như ở Nitrocystis sarcinoides.
+ Lớp vỏ của khuẩn lạc thì rất dễ phân biệt giữa khuẩn lạc già và trẻ.
[11].
2.2.3.3 Những loài vi khuẩn Nitrobacter sp. tiêu biểu
2.2.3.3.1 Nitrobacter winogradsky
Tên dòng vi khuẩn này được đặt theo tên nhà sinh vật học Winogradsky là người đầu tiên phân lập được nó. Vi khuẩn có dạng que ngắn, hình quả lê, thỉnh thoảng có dạng cầu, kích thước 0,6-0,8 x 1,0-2,0 μm. Carboxysome thường xuất hiện ở dạng thể vùi trong nguyên sinh chất. Tế bào di động rất nhanh nhờ tiên mao ở gần cực và bên hông. Vi khuẩn này thuộc loại hoá tự dưỡng không bắt buộc. Khi nuôi trên môi trường có nhiều loại dinh dưỡng, vi khuẩn oxi hoá nitrite sẽ ưu tiên dùng nitrite trước, sau đó mới oxi hoá các hợp chất hữu cơ còn lại.
Vi khuẩn cũng có thể sử dụng pyruvate, acetate và glycerol như nguồn sinh năng lượng, cùng với dịch chiết nấm men, amino acid, peptone, NH3 và nitrate như nguồn cung cấp nitơ. Dưới điều kiện môi trường gồm các chất khoáng vô cơ hay môi trường hỗn hợp nhiều loại dinh dưỡng, thời gian thế hệ dao động từ 8 đến 14 giờ. Trong khi ở môi trường giàu chất hữu cơ thì vi khuẩn phát triển chậm nên thời gian thế hệ từ 70 đến 100 giờ. Vi khuẩn có khả năng sống trong điều kiện kị khí với nitrate là chất nhận điện tử và tạo ra các dạng nitrite, nitric oxide (NO), nitrous oxide (N2O). Tế bào ít nhạy cảm với oxy khi được chuyển từ điều kiện kị khí sang điều kiện hiếu khí. NO có thể là nguồn cơ chất thay thế nitrite cho vi khuẩn oxi hoá trong điều kiện hiếu khí thành nitrate. Những dòng vi khuẩn điển hình chủ yếu được phân lập từ đất. Ngoài ra,
21
vi khuẩn này còn phân bố ở nước ngọt, biển, cống rãnh, hệ thống xử lý nước thải và phân bón [13].
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 61,7. Dòng điển hình: ATCC 25391.
Hình 2-8. Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky được nhuộm Gram âm, có dạng que ngắn. Bar = 1 μm [13].
2.2.3.3.2 Nitrobacter alkalicus
Vi khuẩn này có tên alkalicus nghĩa là alkaline, độ kiềm vì khả năng sống trong pH kiềm khá cao từ 6,5 đến 10,2 và pH tối thích là 9,5. Vi khuẩn có dạng quả lê, kích thước từ 0,6-0,8 x 1,2-1,8 μm. Vách tế bào có thêm một lớp bọc bên ngoài được cấu trúc bởi các tiểu đơn vị protein theo một trật tự nhất định. Nitrite là nguồn sinh năng lượng cho vi khuẩn ở điều kiện môi trường khoáng vô cơ, trong khi môi trường hữu cơ thì người ta không ghi nhận được sự phát triển của vi khuẩn. Đối lập với các loại vi khuẩn oxi hoá nitrite khác, người ta không phát hiện thấy carboxysome trong vi khuẩn này, do đó để sinh trưởng thì vi khuẩn bắt buộc phải dùng nguồn carbon ở dạng ion carbonate. Vi khuẩn này được phân lập ở lớp bùn trong các hồ nước khoáng có hàm lượng Na2CO3 cao hoặc từ đá vôi, đá khoáng.
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 62. GenBank accesion number (16S rRNA): AF 069956.
Hình 2-9. Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau 2 tháng nuôi cấy ở pH 10. Bar = 0,1 cm [30].
22 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2-10. Tế bào Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi điện tử. Lớp vỏ bên ngoài (S) được gồm nhiều tiểu đơn vị protein ghép với nhau. Bar = 1 μm [30].
2.2.3.3.3 Nitrobacter hamburgensis
Vi khuẩn được phân lập đầu tiên ở thành phố Hamburg, Đức, và để tưởng nhớ sự kiện đó người ta đã đặt tên thành phố cho dòng vi khuẩn này. Hình thái và cấu trúc tế bào tương tự như các dòng vi khuẩn oxi hoá nitrite khác. Carboxysome hiện diện ở tế bào chất. Khả năng di động nhờ tiên mao ở đuôi và bên hông. Phát triển kém trên môi trường khoáng vô cơ nhưng lại có khả năng phát triển tốt ở môi trường hỗn hợp. Khi môi trường có nitrite, pyruvate, dịch chiết nấm men và peptone thì tốc độ sinh trưởng đạt cao nhất. Đây là dòng duy nhất có thể phát triển tốt trong môi trường có chất hữu cơ. Cả nirtite và chất hữu cơ đều được sử dụng trong quá trình biến dưỡng của tế bào. Tế bào còn có thể khử nitrate để phục vụ quá trình sinh trưởng. Vi khuẩn khá nhạy cảm với oxy khi chuyển từ điều kiện kị khí sang hiếu khí. Dòng vi khuẩn này được phân lập từ đất ở Hamburg (Đức), Yucatan (Mexico) và Corse (Pháp).
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 61,6. Dòng điển hình là X14. GenBank accesion number (16S rRNA): L11663.
Hình 2-11. Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis được nhuộm Gram âm, có dạng quả lê. Bar = 250nm [13].
2.2.3.3.4 Nitrobacter vulgaris
Vulgaris trong tiếng La tinh nghĩa là phổ biến. Đặc điểm hình thái và cấu trúc
tương tự như các dòng oxi hoá nitrite khác. Carboxysome hiện diện trong tế bào chất. Phần lớn tế bào trong dòng này có 2 pha sinh trưởng, pha đầu tiên sẽ oxi hoá nitrite,
23
pha thứ hai oxi hoá các hợp chất hữu cơ khác. Mức độ sinh trưởng trong pha đầu tiên (hoá tự dưỡng) thường chậm hơn pha thứ hai (hoá dị dưỡng). Tế bào ở dòng Z có thời gian nhân đôi là 140 giờ ở pha đầu tiên và 25 giờ ở pha thứ hai. Cả nitrate và oxy đều là chất nhận điện tử và acetate hoặc pyruvate là chất cho điện tử khi tế bào sử dụng hợp chất hữu cơ. Tế bào sản sinh ra những polymer ngoại bào giúp liên kết những tế bào xung quanh lại tạo thành cụm, màng (biofilm).
Điểm khác biệt với các dòng oxi hoá nitrite khác là vi khuẩn Nitrobacter vulgaris
không nhạy cảm với oxy chuyển từ môi trường kị khí sang môi trường hiếu khí. Trên màng nguyên sinh chất ở Nitrobacter vulgaris thì chỉ có duy nhất một loại cytochrome c 32 kDa trong khi ở N. winogradsky và N. hamburgensis thì có cả loại cytochrome 30 kDa. Dòng vi khuẩn này được phân lập từ đất, nước ngầm, nước ngọt hoặc nước lợ, cống rãnh và cả trong tổ mối. N. vulgaris là loài phổ biến nhất trong loài Nitrobacter, thậm chí nó có xuất hiện trong bê tông, đá, gạch.
Tỉ lệ mol% G + C trong DNA là 59,4. Dòng điển hình là Z.
Hình 2-12. Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp màng introcytoplasmic và carboxysome. Bar = 250 nm [13].