nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng trichoderma sp phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Lịch NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THÔ TỪ CHỦNG TRICHODERMA SP PHÒNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Lịch NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THÔ TỪ CHỦNG TRICHODERMA SP PHÒNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình dẫn suốt trình xây dựng đề cương hoàn thành luận văn Cô giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thực đề tài Xin chân thành cám ơn PGS TS Đồng Thị Thanh Thu, TS Võ Thị Hạnh, TS Nguyễn Hữu Phúc hết lòng giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Xin gởi lời cám ơn đến Ths Trần Thị Minh Định, bạn Nguyễn Thái Bình, bạn Nguyễn Thiện Phú, toàn thể thầy cô khoa Sinh, phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, phòng thí nghiệm Di truyền – Thực vật Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ thời gian thực luận văn Cuối cùng, xin gởi lời cám ơn đến thầy cô, bạn bè, người thân gia đình tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận văn Phạm Thị Lịch MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Mục tiêu Nhiệm vụ Đối tượng nghiên cứu .8 Ý nghĩa đề tài Thời gian địa điểm nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Nấm Trichoderma spp 10 1.1.1 Vị trí phân loại 10 1.1.2 Đặc điểm sinh học .10 1.1.3 Cấu trúc Trichoderma spp 11 1.1.4 Các chế đối kháng Trichoderma với nấm gây bệnh trồng 12 1.1.5 Vai trò - tiềm ứng dụng Trichoderma spp 14 1.2 Chitin hệ enzyme chitinase 16 1.2.1 Chitin 16 1.2.2 Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase .17 1.2.3 Đặc tính hệ enzyme chitinase .18 1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm 19 1.2.5 Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase 20 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp 21 1.2.7 Tình hình nghiên cứu sử dụng chế phẩm enzyme chitinase 23 1.3 Vi nấm gây hại cà chua .27 1.3.1 Đặc điểm sinh thái cà chua .27 1.3.2 Các tác nhân vi nấm gây hại chủ yếu cà chua (giai đoạn con) 28 1.3.3 Biện pháp phòng trừ vi nấm cà chua .29 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu 32 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.1.2 Hóa chất - Nguyên liệu 32 2.1.3 Thiết bị dụng cụ .32 2.1.4 Các MT nghiên cứu sử dụng 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào NS phương pháp khuếch tán MT thạch 34 2.2.2 Phương pháp bảo quản mẫu dầu khoáng .35 2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái NS 35 2.2.4 Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS 36 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase 37 2.2.6 Phương pháp nuôi cấy NS thu nhận chitinase MT bán rắn 38 2.2.7 Phương pháp tách chiết dịch thu nhận chế phẩm enzyme thô từ MT nuôi cấy 39 2.2.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme chitinase CPE 39 2.2.9 Phương pháp thẩm tích CPE màng cellophane 40 2.2.10 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng hoạt độ chitinase NS 40 2.2.11 Phương pháp nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính lí hóa CPE chitinase 41 2.2.12 Phương pháp khảo sát khả kìm hãm tăng sinh khối vi nấm gây bệnh CPE chitinase tác nhân kháng nấm khác .42 2.2.13 Phương pháp khảo sát khả làm giảm độ nảy mầm BT vi nấm gây bệnh trồng CPE tác nhân kháng nấm khác 43 2.2.14 Gây nhiễm nấm bệnh vào cà chua phương pháp nhân tạo [6] 44 2.2.15 Xác định mật độ BT phương pháp đếm KL [19] .45 2.2.16 Xác định mật độ BT phương pháp đo mật độ quang [14] 45 2.2.17 Phương pháp xử lí CPE chitinase từ Trichoderma sp phòng vi nấm gây hại cà chua 46 2.2.18 Phương pháp xử lí số liệu thống kê 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48 3.1 Kết tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao 48 3.2 Ảnh hưởng MT điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma BL2 49 3.2.1 Ảnh hưởng MT lên men bán rắn 49 3.2.2 Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng .51 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 53 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ MT nuôi cấy 54 3.2.5 Ảnh hưởng pH ban đầu MT nuôi cấy 55 3.2.6 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu MT nuôi cấy .56 3.2.7 Động thái trình sinh tổng hợp chitinase chủng Trichoderma BL2 58 3.3 Chiết tách dịch enzyme thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 .59 3.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt tính CPE 59 3.3.2 Quy trình thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 60 3.4 Ảnh hưởng yếu tố lí hóa đến hoạt độ enzyme chitinase CPE 62 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng 62 3.4.2 Ảnh hưởng pH phản ứng 63 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian phản ứng 64 3.4.4 Ảnh hưởng thời gian nhiệt độ bảo quản đến hoạt độ chitinase CPE 65 3.5 Kết khảo sát khả đối kháng CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 phòng trừ vi nấm gây bệnh trồng 67 3.5.1 Khả kìm hãm tăng sinh khối vi nấm gây bệnh 67 3.5.2 Khả làm giảm độ nảy mầm BT vi nấm gây bệnh 69 3.6 Kết việc sử dụng CPE chitinase từ Trichoderma BL2 tác nhân kháng nấm khác phòng trừ vi nấm gây hại cà chua 74 3.6.1 Ở lô gây nhiễm Phytophthora sp 74 3.6.2 Ở lô gây nhiễm Fusarium sp 76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC 88 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BT Bào tử CPE Chế phẩm enzyme CPSH Chế phẩm sinh học DNS 3,5-dinitrobenzoic acid HLĐK Hiệu lực đối kháng KL Khuẩn lạc MT Môi trường Nxb Nhà xuất NS Nấm sợi OD Hiệu số mật độ quang mẫu thử thật thử không TB Trung bình TLB Tỉ lệ bệnh TN Thí nghiệm UI Imeasurre Unit (Đơn vị hoạt độ enzyme) VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Khí hậu nước ta có nhiều thuận lợi để phát triển sản xuất nông nghiệp, song tạo điều kiện tốt để sinh vật gây hại sinh trưởng, phát triển phá hại nghiêm trọng mùa màng Trong đó, bệnh hại trồng vi nấm đất vấn đề mà người nông dân gặp nhiều khó khăn việc quản lý phòng trừ Vi nấm đất gây bệnh tồn đất thời gian dài kể điều kiện ký chủ Chúng bảo tồn sợi nấm, hạch nấm, hậu bào tử, bào tử trứng bào tử có vách dày đất tàn dư trồng Nấm xâm nhiễm, gây hại trồng làm cho rễ tế bào mạch dẫn không khả hút nước chất dinh dưỡng từ giá thể Vì mà triệu chứng bệnh vi nấm đất gây thường giống nhau, héo vàng, còi cọc chết cây, làm giảm suất thu hoạch Riêng cà chua, theo thống kê ngành Bảo vệ Thực vật Lâm Đồng (năm 2012), huyện Đơn Dương Đức Trọng: Bệnh xoăn nhiễm diện tích gần 600 ha, tỷ lệ hại 2,9 - 20% Mốc sương: bệnh nhiễm 1.236,6 Đơn Dương, Đức Trọng, tỷ lệ hại 8,4 30%, tăng 271,1 so với kỳ trước Đốm vi khuẩn: bệnh nhiễm Đơn Dương 1.620 ha, tỷ lệ hại 16,7 - 30%, tăng 120 so với kỳ trước Để phòng trừ vi nấm gây hại trồng có nhiều biện pháp giới, canh tác, hóa học biện pháp sinh học Trong đó, biện pháp sinh học xem mang lại hiệu quả, thân thiện, an toàn với môi trường Biện pháp sinh học tạo môi trường thuận lợi cho loại sinh vật có ích (kẻ thù tự nhiên dịch hại) phát triển nhằm góp phần tiêu diệt dịch hại, bảo vệ thiên địch tránh khỏi độc hại dùng thuốc hoá học, tạo nơi cư trú cho thiên địch sau vụ gieo trồng cách trồng xen, làm bờ rạ cho thiên địch ẩn nấp Sử dụng chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật có tác dụng trừ dịch hại, không độc hại với loại sinh vật có ích, an toàn với sức khỏe người môi trường Trong số nhóm vi sinh vật sử dụng làm chế phẩm phòng trừ bệnh hại trồng Trichoderma loài nấm đối kháng quan tâm nhiều lĩnh vực sản xuất nông nghiệp Do Trichoderma có khả tiêu diệt vi nấm gây hại trồng nhiều chế kí sinh, sinh kháng sinh, tiết enzyme ngoại bào,… Hệ enzyme ngoại bào Trichoderma đóng vai trò quan trọng đấu tranh sinh học, đặc biệt enzyme chitinase Chitinase Trichoderma phân hủy vách tế bào chủ loài nấm gây hại, chitin thành phần cấu tạo vách tế bào vi nấm gây bệnh trồng Từ lí trên, định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma sp để phòng trừ vi nấm gây hại cà chua” Mục tiêu Tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng nấm mốc Trichoderma sp có khả phòng trừ vi nấm gây hại cà chua Nhiệm vụ Tuyển chọn chủng Trichoderma sp có khả sinh enzyme chitinase cao chủng Trichoderma khảo sát Nghiên cứu điều kiện môi trường điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng hợp chitinase chủng tuyển chọn Thu nhận enzyme chitinase tạo chế phẩm enzyme Nghiên cứu đặc điểm lí hóa chế phẩm enzyme chitinase Thử nghiệm khả phòng – diệt nấm bệnh cà chua chế phẩm điều kiện in vivo Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm Trichoderma nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM Chủng Fusarium sp nhận từ Bộ môn Bảo vệ thực vật – Khoa Nông học Đại học Nông Lâm Chủng Phytophthora sp nhận từ Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam Ý nghĩa đề tài  Ý nghĩa khoa học Góp phần tìm hiểu khả phòng trừ nấm bệnh gây hại cà chua chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp 6.3 Ảnh hưởng thành phần MT9 đến hoạt độ enzyme chitinase Chủng Trichoderma BL2 Số lần đo Trung Sai số MT9 bình 24 h 0,727 0,738 0,724 0,730 0,007 Glucosamine (µg/ml) 63,941 64,866 63,689 64,165 0,619 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 12,788 12,973 12,738 12,833 0,124 48 h 0,900 0,891 0,912 2,703 0,011 Glucosamine (µg/ml) 78,479 77,723 79,487 78,563 0,885 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 15,696 15,545 15,897 15,713 0,177 72 h 1,199 1,185 1,193 1,192 0,007 Glucosamine (µg/ml) 103,605 102,429 103,101 103,045 0,590 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 20,721 20,486 20,620 20,609 0,118 96 h 0,832 0,845 0,840 0,839 0,007 Glucosamine (µg/ml) 72,765 73,857 73,437 73,353 0,551 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 14,553 14,771 14,687 14,671 0,110 120 h 0,438 0,440 0,433 0,437 0,004 Glucosamine (µg/ml) 39,655 39,824 39,235 39,571 0,303 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 7,931 7,965 7,847 7,914 0,061 144 h 0,413 0,423 0,420 0,419 0,005 Glucosamine (µg/ml) 37,555 38,395 38,143 38,031 0,431 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 7,511 7,679 7,629 7,606 0,086 168 h 0,305 0,311 0,298 0,305 0,007 Glucosamine (µg/ml) 28,479 28,983 27,891 28,451 0,547 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 5,696 5,797 5,578 5,690 0,109 94 Phụ lục Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng đến hoạt độ enzyme chitinase Chủng Trichoderma BL2 Nguồn chất Số lần đo Trung Sai số bình Bột vỏ tôm 0,245 0,256 0,264 0,255 0,010 Glucosamine (µg/ml) 23,437 24,361 25,034 24,277 0,802 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 4,687 4,872 5,007 4,855 0,160 Bột vỏ cua 0,363 0,359 0,352 1,074 0,006 Glucosamine (µg/ml) 33,353 33,017 32,429 32,933 0,468 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 6,671 6,603 6,486 6,587 0,094 Bột chitin 1,271 1,268 1,258 1,266 0,007 Glucosamine (µg/ml) 109,655 109,403 108,563 109,207 0,572 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 21,931 21,881 21,713 21,841 0,114 Chitin huyền phù 1,522 1,527 1,535 1,528 0,007 Glucosamine (µg/ml) 130,748 131,168 131,840 131,252 0,551 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 26,150 26,234 0,110 95 26,368 26,250 Phụ lục Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến hoạt độ enzyme chitinase Chủng Trichoderma BL2 Nồng độ chất (%) Số lần đo Trung Sai số bình 0,235 0,231 0,228 0,231 0,004 Glucosamine (µg/ml) 22,597 22,261 22,008 22,289 0,295 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 4,519 4,452 4,402 4,458 0,059 0.5 0,781 0,782 0,795 2,358 0,008 Glucosamine (µg/ml) 68,479 68,563 69,655 68,899 0,656 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 13,696 13,713 13,931 13,780 0,131 1.0 1,469 1,475 1,466 1,470 0,005 Glucosamine (µg/ml) 126,294 126,798 126,042 126,378 0,385 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 25,259 25,360 25,208 25,276 0,077 1.5 1,535 1,545 1,538 1,539 0,005 Glucosamine (µg/ml) 131,840 132,681 132,092 132,204 0,431 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 26,368 26,536 26,418 26,441 0,086 2.0 0,929 0,932 0,915 0,925 0,009 Glucosamine (µg/ml) 80,916 81,168 79,739 80,608 0,763 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 16,183 16,234 15,948 16,122 0,153 96 Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ MT nuôi cấy đến hoạt độ enzyme chitinase Chủng Trichoderma BL2 Nhiệt độ môi trường (oC) Số lần đo Trung Sai số bình 20 0,912 0,905 0,909 0,909 0,004 Glucosamine (µg/ml) 79,487 78,899 79,235 79,207 0,295 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 15,897 15,780 15,847 15,841 0,059 25 1,468 1,472 1,463 4,403 0,005 Glucosamine (µg/ml) 126,210 126,546 125,790 126,182 0,379 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 25,242 25,309 25,158 25,236 0,076 30 1,854 1,852 1,875 1,860 0,013 Glucosamine (µg/ml) 158,647 158,479 160,412 159,179 1,071 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 31,729 31,696 32,082 31,836 0,214 35 1,541 1,510 1,498 1,516 0,022 Glucosamine (µg/ml) 132,345 129,739 128,731 130,272 1,865 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 26,469 25,948 25,746 26,054 0,373 40 0,811 0,834 0,801 0,815 0,017 Glucosamine (µg/ml) 71,000 72,933 70,160 71,364 1,422 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 14,200 14,587 14,032 14,273 0,284 97 Phụ lục 10 Ảnh hưởng pH ban đầu MT nuôi cấy đến hoạt độ enzyme chitinase Chủng Trichoderma BL2 pH ban đầu MT 24 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 48 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 72 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 96 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 120 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 144 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 0,984 85,538 17,108 1,350 116,294 23,259 1,822 155,958 31,192 1,644 141,000 28,200 1,587 136,210 27,242 1,116 96,630 19,326 Số lần đo 0,981 85,286 17,057 1,338 115,286 23,057 1,800 154,109 30,822 1,695 145,286 29,057 1,581 135,706 27,141 1,119 96,882 19,376 98 0,970 84,361 16,872 1,331 114,697 22,939 1,807 154,697 30,939 1,669 143,101 28,620 1,577 135,370 27,074 1,129 97,723 19,545 Trung bình 0,978 85,062 17,012 1,340 115,426 23,085 1,810 154,922 30,984 1,669 143,129 28,626 1,582 135,762 27,152 1,121 97,078 19,416 Sai số 0,007 0,619 0,124 0,010 0,807 0,161 0,011 0,945 0,189 0,026 2,143 0,429 0,005 0,423 0,085 0,007 0,572 0,114 Phụ lục 11 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu MT nuôi cấy đến hoạt độ enzyme chitinase Chủng Trichoderma BL2 Độ ẩm ban dầu MT (%) 50 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 55 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 60 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 65 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 70 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 75 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/ml) 0,974 84,697 16,939 1,826 156,294 31,259 2,188 186,714 37,343 1,631 139,908 27,982 0,605 53,689 10,738 0,554 49,403 9,881 Số lần đo 0,994 86,378 17,276 1,879 160,748 32,150 2,198 187,555 37,511 1,654 141,840 28,368 0,574 51,084 10,217 0,561 49,992 9,998 99 Trung Sai số bình 0,986 0,985 0,010 85,706 85,594 0,846 17,141 17,119 0,169 1,854 1,853 0,027 158,647 158,563 2,228 31,729 31,713 0,446 2,191 2,192 0,005 186,966 187,078 0,431 37,393 37,416 0,086 1,651 1,645 0,013 141,588 141,112 1,051 28,318 28,222 0,210 0,574 0,584 0,018 51,084 51,952 1,504 10,217 10,390 0,301 0,549 0,555 0,006 48,983 49,459 0,507 9,797 9,892 0,101 Phụ lục 12 Động thái trình sinh tổng hợp chitinase chủng Trichoderma BL2 pH Thời ∆OD gian ∆OD ∆OD ∆OD trung (h) bình Độ ẩm Hàm lượng Hoạt độ trung trung glucosamine chitinase bình bình của MT MT (µg/ml) (UI/ml) 12 0,524 0,543 0,548 0,538 48,087 9,62 5,54 61,80 24 0,956 0,961 0,958 0,958 83,381 16,68 5,87 61,37 36 1,133 1,137 1,142 1,137 98,423 19,68 5,91 62,23 48 1,606 1,635 1,626 1,622 139,179 27,84 6,05 63,90 60 2,386 2,398 2,332 2,372 202,176 40,44 6,10 65,11 72 2,271 2,273 2,282 2,275 194,053 38,81 7,29 65,43 84 1,942 1,953 1,945 1,947 166,434 33,29 7,41 66,05 96 1,365 1,371 1,360 1,365 117,583 23,52 7,63 67,24 108 0,936 0,939 0,921 0,932 81,168 16,23 7,18 69,01 120 0,576 0,568 0,568 0,571 50,804 10,16 7,49 70,18 132 0,595 0,587 0,591 52,485 10,50 7,57 75,93 144 0,524 0,532 0,527 0,528 47,190 9,44 7,88 75,03 156 0,445 0,431 0,443 0,440 39,796 7,96 7,56 74,87 168 0,412 0,418 0,443 0,424 38,507 7,70 7,47 72,40 0,59 100 Phụ lục 13 Ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt độ chitinase CPE Chủng Trichoderma BL2 Tác nhân tủa TL1 – 1:2 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) TL1 – 1:3 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) TL1 – 1:4 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) TL1 – 1:2 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) TL1 – 1:3 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) TL1 – 1:4 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) TL1 – 50% Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) TL1 – 60% Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) TL1 – 70% Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) Số lần đo Acetone 1,287 1,296 111,000 111,756 33,300 33,527 1,033 1,043 89,655 90,496 26,897 27,149 1,042 1,031 90,412 89,487 27,124 26,846 Ethanol 960 1,098 1,084 95,118 93,941 28,535 28,182 2,365 2,354 201,588 200,664 60,476 60,199 1,429 1,436 122,933 123,521 36,880 37,056 Muối (NH4)2SO4 1,408 1,400 121,168 120,496 36,350 36,149 1,882 1,875 161,000 160,412 48,300 48,124 2,628 2,619 223,689 222,933 67,107 66,880 101 Trung bình Sai số 1,290 1,291 111,252 111,336 33,376 33,401 1,043 1,040 90,496 90,216 27,149 27,065 1,034 1,036 89,739 89,880 26,922 26,964 0,005 0,385 0,116 0,006 0,485 0,146 0,006 0,478 0,143 1,095 1,092 94,866 94,641 28,460 28,392 2,368 2,362 201,840 201,364 60,552 60,409 1,425 1,430 122,597 123,017 36,779 36,905 0,007 0,619 0,186 0,007 0,619 0,186 0,006 0,468 0,140 1,418 1,409 122,008 121,224 36,603 36,367 1,871 1,876 160,076 160,496 48,023 48,149 2,620 2,622 223,017 223,213 66,905 66,964 0,009 0,758 0,227 0,006 0,468 0,140 0,005 0,415 0,124 Phụ lục 14 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ enzyme chitinase CPE Chủng Trichoderma BL2 Nhiệt độ phản ứng (oC) 20 Số lần đo Trung bình 1,321 1,345 1,347 1,338 Sai số 0,014 Glucosamine (µg/ml) 113,857 115,874 116,042 115,258 1,216 Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 34,157 34,762 34,813 34,577 0,365 30 1,731 1,731 1,748 1,737 0,010 Glucosamine (µg/ml) 148,311 148,311 149,739 148,787 0,825 Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 44,493 44,493 44,922 44,636 0,247 50 2,444 2,426 2,431 2,434 0,009 Glucosamine (µg/ml) 208,227 206,714 207,134 207,359 0,781 Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 62,468 62,014 62,140 62,208 0,234 60 2,087 2,094 2,088 2,090 0,004 Glucosamine (µg/ml) 178,227 178,815 178,311 178,451 0,318 Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 53,468 53,645 53,493 53,535 0,095 40 1,907 1,910 1,907 1,908 0,002 Glucosamine (µg/ml) 163,101 163,353 163,101 163,185 0,146 Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 48,930 49,006 48,930 48,955 0,044 70 1,809 1,797 1,802 1,803 0,006 Glucosamine (µg/ml) 154,866 153,857 154,277 154,333 0,507 Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 46,460 46,157 0,152 102 46,283 46,300 Phụ lục 15 Ảnh hưởng pH phản ứng đến hoạt độ chitinase CPE Chủng Trichoderma BL2 pH phản ứng 4.0 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 4.5 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 5.0 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 5.5 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 6.0 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 6.5 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 7.0 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 7.5 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 1,361 117,218 35,166 1,987 169,824 50,947 2,369 201,924 60,577 2,688 228,731 68,619 2,302 196,294 58,888 1,670 143,185 42,955 1,300 112,092 33,628 1,184 102,345 30,703 Số lần đo 1,369 117,891 35,367 2,045 174,697 52,409 2,354 200,664 60,199 2,698 229,571 68,871 2,331 198,731 59,619 1,628 139,655 41,897 1,267 109,319 32,796 1,176 101,672 30,502 103 1,354 116,630 34,989 1,988 169,908 50,972 2,352 200,496 60,149 2,691 228,983 68,695 2,330 198,647 59,594 1,649 141,420 42,426 1,283 110,664 33,199 1,175 101,588 30,476 Trung bình 1,361 117,246 35,174 2,007 171,476 51,443 2,358 201,028 60,308 2,692 229,095 68,729 2,321 197,891 59,367 1,649 141,420 42,426 1,283 110,692 33,208 1,178 101,868 30,561 Sai số 0,008 0,631 0,189 0,033 2,790 0,837 0,009 0,781 0,234 0,005 0,431 0,129 0,016 1,383 0,415 0,021 1,765 0,529 0,017 1,387 0,416 0,005 0,415 0,124 Phụ lục 16 Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hoạt độ chitinase CPE Chủng Trichoderma L2 Thời gian phản ứng (phút) 10 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 20 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 30 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 40 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 50 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 60 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 70 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 80 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 90 Glucosamine (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 1,174 101,504 30,451 1,382 118,983 35,695 1,809 154,866 46,460 2,513 214,025 64,208 2,847 242,092 72,628 2,994 254,445 76,334 2,982 253,437 76,031 2,751 234,025 70,208 2,693 229,151 68,745 Số lần đo 1,176 101,672 30,502 1,379 118,731 35,619 1,785 152,849 45,855 2,518 214,445 64,334 2,897 246,294 73,888 2,991 254,193 76,258 2,975 252,849 75,855 2,759 234,697 70,409 2,677 227,807 68,342 104 1,182 102,176 30,653 1,384 119,151 35,745 1,788 153,101 45,930 2,523 214,866 64,460 2,901 246,630 73,989 2,987 253,857 76,157 2,983 253,521 76,056 2,746 233,605 70,082 2,671 227,303 68,191 Trung Sai số bình 1,177 0,004 101,784 0,350 30,535 0,105 1,382 0,003 118,955 0,211 35,687 0,063 1,794 0,013 153,605 1,099 46,082 0,330 2,518 0,005 214,445 0,420 64,334 0,126 2,882 0,030 245,006 2,528 73,502 0,759 2,991 0,004 254,165 0,295 76,250 0,089 2,980 0,004 253,269 0,366 75,981 0,110 2,752 0,007 234,109 0,551 70,233 0,165 2,680 0,011 228,087 0,956 68,426 0,287 Phụ lục 17 Bảng tỉ lệ kìm hãm tăng sinh khối vi nấm gây bệnh CPE chitinase tác nhân kháng nấm khác Trọng Lô Chủng lượng bì TN nấm trung bình (g) ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 Trọng lượng bì sinh khối trung bình (g) Trọng lượng Tỉ lệ giảm sinh sinh khối nấm khối vi nấm so bệnh trung với đối chứng bình (g) (%) VNB.1 0,780 0,917 0,137 - VNB.2 0,530 0,643 0,113 - VNB.1 0,783 0,877 0,093 31,71 VNB.2 0,527 0,603 0,076 32,35 VNB.1 0,790 0,857 0,067 51,22 VNB.2 0,523 0,600 0,077 32,35 VNB.1 0,787 0,910 0,123 9,76 VNB.2 0,517 0,600 0,083 26,47 VNB.1 0,787 0,870 0,083 39,02 VNB.2 0,520 0,583 0,063 44,12 VNB.1 0,780 0,863 0,083 39,02 VNB.2 0,523 0,590 0,067 41,18 VNB.1 0,783 0,830 0,047 65,85 VNB.2 0,523 0,570 0,047 58,82 VNB.1 0,797 0,900 0,103 24,39 VNB.2 0,527 0,583 0,056 50,00 VNB.1 0,783 0,850 0,067 51,22 VNB.2 0,520 0,580 0,060 47,06 VNB.1 0,783 0,837 0,053 60,98 VNB.2 0,523 0,577 0,044 52,94 105 Phụ lục 18 Bảng tỉ lệ bào tử vi nấm gây bệnh trồng bị tiêu hủy CPE chitinase tác nhân kháng nấm khác Lô TN Chủng vi Số lượng KL trung Tỉ lệ BT không nảy mầm nấm bệnh bình (x104 CFU/ml) trung bình so với đối chứng (%) ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 VNB.1 122 ± 10,60 - VNB.2 38 ± 7,02 - VNB.1 49 ± 3,79 60,22 VNB.2 21 ± 0,58 43,36 VNB.1 50 ± 7,23 59,40 VNB.2 23 ± 4,16 38,05 VNB.1 65 ± 7,21 46,87 VNB.2 25 ± 1,15 32,74 VNB.1 49 ± 3,21 59,95 VNB.2 18 ± 1,53 53,10 VNB.1 41 ± 3,06 66,76 VNB.2 15 ± 1,15 59,29 VNB.1 38 ± 7,77 68,66 VNB.2 10 ± 2,00 73,45 VNB.1 49 ± 3,06 60,22 VNB.2 13 ± 3,46 65,49 VNB.1 56 ± 3,00 54,50 VNB.2 15 ± 1,53 59,29 VNB.1 28 ± 6,56 77,11 VNB.2 ± 0,58 75,22 106 Phụ lục 19 Thực nghiệm khảo sát khả phòng trừ Fusarium sp Phytophthora sp cà chua CPE chitinase tác nhân kháng nấm khác Hình 19.1 Chuẩn bị bầu đất ươm Hình 19.2 Cây cà chua bắt đầu có thật 107 Hình 19.3 Cây cà chua có thật Hình 19.4 Phân lô TN 108 [...]... nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma Và bước đầu thu chế phẩm enzyme chitinase thô từ Aspergillus để phòng trừ sâu tơ và sản xuất glucosamine [12] Năm 2012, tác giả Đinh Minh Hiệp đã nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ Trichoderma spp và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh [8] 1.3 Vi nấm gây hại trên cà chua 1.3.1 Đặc điểm sinh thái cây cà chua Cây cà chua có tên khoa học... vào kết quả thu được và chế phẩm tạo ra trong đề tài có thể ứng dụng làm chế phẩm sinh học để phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây cà chua 6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: 12/2012 – 8/2013 Địa điểm: phòng Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm TP HCM 9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm Trichoderma spp 1.1.1 Vị trí phân loại Trichoderma được xem là nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong... triển Tuy nhiên, vi c trồng cà chua chưa được phát triển mạnh theo mong muốn vì cà chua trồng trong điều kiện nóng và ẩm ở nước ta dễ mắc bệnh Nhiều bệnh gây hại như héo cây con, héo xanh, thán thư, mốc đen lá, héo muộn, sương mai… do vi khuẩn, vi nấm gây ra Đặc biệt ở giai đoạn cây con, cà chua dễ bị các loài vi nấm trong đất (như Phytophthora sp. , Fusarium sp. , Rhizoctonia sp …) tấn công gây bệnh 1.3.2... 1.2.4 Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật: thực vật, động vật, vi khuẩn, vi nấm Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng Tuy nhiên trong các MT nuôi cấy VSV, người ta đều cho thêm chitin – cơ chất của enzyme chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính enzyme chitinase sau quá trình... Botrytis…[43]  Chế phẩm biocid – sự tác động cộng hưởng của hệ enzyme chitinase, các enzyme khác và các tác nhân kháng nấm Các nhà khoa học đã nghiên cứu sự phân hủy vách tế bào vi nấm bởi các enzyme chitinase, glucanase, cellulase,…và đã thử nghiệm trên đồng ruộng tác dụng của chế phẩm biocid Khi sử dụng riêng biệt chế phẩm chitinase thì hiệu quả tiêu diệt thấp chỉ có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm bệnh... 1.2.7.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng 25  Trên thế giới So với các enzyme khác như protease, amylase, pectinase thì hệ enzyme chitinase được nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn hạn chế Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào vi c phá vỡ vách tế bào nấm Năm 1978,... trình nghiên cứu về hệ enzyme thủy phân ở Trichoderma spp [41], [42], [46] Dường như Trichoderma là chi nấm được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật Đối với chi nấm Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của chúng trên MT bán rắn Những chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase. .. [66] 11 1.1.4 Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng Nấm đối kháng là những nhóm VSV phổ biến của hệ vi sinh trong đất Chúng thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh trên cây và giúp cây hồi phục, sinh trưởng phát triển Trichoderma cũng là... và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase 1.2.7.1 Khả năng ứng dụng của enzyme chitinase từ Trichoderma spp trong nông nghiệp  Cơ sở khoa học ứng dụng enzyme chitinase trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật Thành tế bào của vi nấm dày khoảng 0,2 µm, có tính phản quang rất mạnh nên có thể phân biệt rõ dưới kính hiển vi quang học Nhiều công trình đã chứng minh cấu tạo thành tế bào vi nấm vừa có cấu trúc bản... Ở vi nấm, chitinase chủ yếu được tổng hợp bởi các loại NS Các chủng NS cho enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia… Riêng đối với Trichoderma spp cơ chế cảm ứng hệ enzyme chitinase là chủ đề được nhiều nhà khoa học 19 quan tâm Sự cảm ứng enzyme ngoại bào rất hiệu quả khi nuôi cấy Trichoderma trong MT có chitin, vách tế bào nấm hoặc hệ sợi nấm [43] Các enzyme khác nhau thì cơ chế ... bào vi nấm gây bệnh trồng Từ lí trên, định chọn đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma sp để phòng trừ vi nấm gây hại cà chua Mục tiêu Tạo chế phẩm. .. VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Lịch NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THÔ TỪ CHỦNG TRICHODERMA SP PHÒNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA Chuyên ngành: Vi sinh... khả phòng trừ nấm bệnh gây hại cà chua chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp  Ý nghĩa thực tiễn Dựa vào kết thu chế phẩm tạo đề tài ứng dụng làm chế phẩm sinh học để phòng trừ vi nấm gây