6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.3. Vin ấm gây hại trên cà chua
1.3.1. Đặc điểm sinh thái cây cà chua
Cây cà chua có tên khoa học là Lycopesium esculentum, có nguồn gốc từ Nam Mỹ, là loại rau ăn quả, họ Cà (Solanaceae) [9], [73].
Cà chua là cây dài ngày, tự thụ phấn. Quả cà chua mọng, khi chín có màu vàng hoặc đỏ, có nhiều hình dạng: tròn, dẹt, có cạnh, có múi… Một năm có thể trồng 4 vụ cà chua: vụ sớm, gieo hạt vào cuối tháng 7 đầu tháng 8; vụ chính gieo cuối tháng 9 đến đầu tháng 10; vụ muộn gieo từ tháng 11 đến giữa tháng 1; vụ xuân gieo từ tháng 1 đến đầu tháng 2. Hiện nay, nhiều giống cà chua đang được trồng ở Việt Nam. Có thể chia cà chua thành 3 loại dựa vào hình dạng [73]:
- Cà chua hồng: quả có hình dạng quả hồng, không chia múi. Thịt quả đặc, nhiều bột, lượng đường trong quả cao. Các giống thường gặp: Ba Lan, Hồng Lan của Viện cây lương thực; giống 214, HP5, HP1 của Hải Phòng…
- Cà chua múi: quả to, nhiều ngăn tạo thành múi, là giống cây sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng dài, năng suất và khả năng chống chịu khá nhưng chất lượng không bằng cà chua hồng.
- Cà chua bi: quả nhỏ, chua, giá trị thấp.
Cây cà chua có thể sinh trưởng trên nhiều loại đất khác nhau như đất sét, đất cát, đất pha cát, có độ pH = 6 – 6.5. Đất có độ ẩm cao và ngập nước kéo dài sẽ làm giảm khả năng sinh trưởng của cây cà chua. Nhiệt độ thích hợp cho cà chua để đạt năng suất cao, chất lượng tốt là khoảng 21 – 24o
C và thời tiết khô. Nhiệt độ dưới 12o
C kéo dài sẽ gây thiệt hại nghiêm trọng, nhiệt độ trên 27oC kéo dài sẽ hạn chế ra hoa, đậu quả. Các tế bào phôi và hạt bị hủy hoại khi nhiệt độ trên 38oC. Trước và sau thời gian thụ phấn nếu nhiệt độ ban đêm quá 21oC thì khả năng đậu quả kém.
Ở nước ta, việc phát triển trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng năng suất trên đơn vị diện tích, do đó cà chua là loại rau được khuyến khích
phát triển. Tuy nhiên, việc trồng cà chua chưa được phát triển mạnh theo mong muốn vì cà chua trồng trong điều kiện nóng và ẩm ở nước ta dễ mắc bệnh. Nhiều bệnh gây hại như héo cây con, héo xanh, thán thư, mốc đen lá, héo muộn, sương mai… do vi khuẩn, vi nấm gây ra. Đặc biệt ở giai đoạn cây con, cà chua dễ bị các loài vi nấm trong đất (như
Phytophthora sp., Fusarium sp., Rhizoctonia sp. …) tấn công gây bệnh.
1.3.2. Các tác nhân vi nấm gây hại chủ yếu trên cây cà chua (giai đoạn cây con)
1.3.2.1. Nấm Phytophthora sp.
Đặc điểm sinh học
Nấm Phytophthora là chi khá phổ biến thuộc lớp Oomycetes, bộ Pernoporales, họ Pythiaceae, sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thước không đồng đều [4]. Túi BT hình trứng hoặc hình quả chanh, trên đầu có núm hoặc không có núm, không màu, trong suốt. BT hình cầu có 2 roi di chuyển rất nhanh trong nước, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển là 25 - 300C, pH 6 - 7. Trong MT ẩm ướt hoặc khi nhiệt độ MT giảm, túi BT sẽ phóng thích những động BT. Những động BT sau khi được phóng thích sẽ bơi lội hàng giờ liền, cuối cùng ngừng bơi, cuộn tròn và kết kén. Sau một thời gian hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này BT gọi là kén nang. BT vách dày ở dạng hình cầu hoặc hình oval thuộc cấu trúc nghỉ vô tính. Cấu trúc hữu tính gồm túi giao tử đực và túi noãn. Túi giao tử đực và túi noãn được hình thành qua quá trình giảm phân. Đây là giai đoạn đơn bội trong vòng đời của Phytophthora. Giai đoạn lưỡng bội có vai trò chính trong chu kì sống [4], [70].
Triệu chứng vàtác hại
Ở cà chua, Phytophthora tấn công trên tất cả các bộ phận của cây. Đặc biệt, trên lá vết bệnh thường xuất hiện đầu tiên ở đầu lá, mép lá hoặc gần cuống lá. Vết bệnh lúc đầu có màu xanh đậm như úng nước, sau đó vết bệnh có màu nâu đen, vết bệnh lớn dần, nếu trời ẩm trên bề mặt vết bệnh có lớp tơ màu trắng bao phủ, bệnh nặng sẽ làm thối nhũn, nếu thời tiết khô, vết cũng khô dòn dễ vỡ. Ở rễ Phytophthora làm thối rễ, làm cho cây gặp khó khăn trong việc hút nước và muối khoáng. Các triệu chứng sẽ dần tồi tệ hơn cho đến khi cây chết [6], [15], [24].
1.3.2.2. Nấm Fusarium sp.
Đặc điểm sinh học
Fusarium là chi lớn nhất trong họ Tuberculariaceae. Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Fusarium sinh sản vô tính bằng
BT gồm: BT đính lớn, BT đính nhỏ và BT vách dày. BT đính lớn dài, nhiều nhân, hình liềm hoặc cong được sinh ra từ cuống BT. Đầu và cuối BT lớn, thuôn và nhọn. Một vài loại BT lớn tách rời và không gắn trên cuống BT, những tế bào sinh BT lớn gọi là thể bình. BT đính nhỏ thường đơn nhân, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ một thể bình hay những cuống BT phân nhánh hoặc không phân nhánh. Tiểu BT đính thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu BT đính của Fusarium rất giống BT của Cephalosporium. BT vách dày hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả. Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra và mọc các ống mầm nếu BT gặp điều kiện thuận lợi. Hậu BT hay BT vách dày rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài [4], [70].
Triệu chứng và tác hại [15]
Fusarium chủ yếu tấn công vào rễ, gốc thân, lá của cây cà chua. Khi cà chua bị nhiễm Fusarium, cây thường bị còi cọc, kém phát triển, sau đó bị chết. Cây trưởng thành bị bệnh các lá phía gốc thường bị vàng, ban đầu là lá chét của một bên cây, sau đó lan ra toàn cây; lá héo rũ, màu vàng, không bị rụng. Vết bệnh ở trên thân sát mặt đất hoặc ở cổ rễ thường có màu nâu, vết bệnh lớn dần làm khô tóp cả đoạn thân sát mặt đất, bộ rễ phát triển kém, rễ bị thối dần. Khi cây bị nhiễm bệnh sẽ biểu hiện ra bên ngoài là chiều cao và hệ thống rễ sẽ bị ngắn lại. Mức độ bệnh nặng hay nhẹ tùy thuộc vào thời gian mà rễ bị nhiễm bệnh cũng như giai đoạn sinh trưởng của cây. Nếu cây ở giai đoạn nhỏ mà bị nhiễm bệnh thì sẽ bị ảnh hưởng nghiêm trọng hơn khi so sánh với cây bị nhiễm ở các giai đoạn sau. Triệu chứng héo rũ hoặc biến vàng có thể xuất hiện một vài cành trên cây hay cả cây, cây bị nhiễm bệnh các lá bị vàng, héo sau khoảng 1 – 2 tuần cây sẽ chết hoàn toàn [6], [15], [24].
1.3.3. Biện pháp phòng trừ vi nấm trên cây cà chua
1.3.3.1. Biện pháp canh tác
Những biện pháp canh tác như thời vụ, làm đất, tưới nước, chăm sóc, luân canh, xen canh... mà bất cứ hệ thống canh tác nào cũng thường xuyên thực hiện. Nếu được trang bị những hiểu biết người ta có thể thực hiện các biện pháp này một cách có ý thức sẽ mang lại hiệu quả phòng trừ, hiệu quả kinh tế cao. Biện pháp canh tác có tác dụng [15], [73]:
- Làm thay đổi điều kiện sinh thái, thay đổi ký chủ, nguồn dinh dưỡng của ký sinh vật gây bệnh.
- Tiêu diệt hoặc làm hạn chế sinh vật gây bệnh, cản trở sự lây lan và tồn tại của sinh vật gây bệnh.
- Biện pháp canh tác có giá trị phòng bệnh rất cao và không gây hại MT.
1.3.3.2. Biện pháp hóa học
Biện pháp hóa học là một trong những biệt pháp phòng trừ bệnh cây tích cực, nhanh chóng, hiệu quả, do đó được ứng dụng rộng rãi, đem lại nhiều lợi ích kinh tế. Tuy nhiên, biện pháp hóa học có một số nhược điểm lớn như [15], [73]:
- Thuốc hóa học là những thuốc độc ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người và gia súc.
- Phần lớn thuốc hóa học có khả năng tiêu diệt nấm bệnh nhưng đồng thời cũng tiêu diệt vi sinh vật có ích, làm phá vỡ cân bằng sinh học, đặc biệt gây khó khăn cho những vùng áp dụng biện pháp sinh học.
- Nấm và vi khuẩn gây bệnh thường thích nghi quen dần với thuốc, vì thế phải tăng liều lượng thuốc sử dụng ảnh hưởng đến tăng trưởng của cây.
1.3.3.3. Biện pháp sinh học
Biện pháp sinh học phòng trừ dịch hại rất đa dạng dựa trên nguyên tắc chung: sử dụng VSV có ích để hạn chế sinh vật có hại [13]. Trong phạm vi đề tài này chỉ giới thiệu biện pháp sinh học bằng cách sử dụng các CPSH.
Các CPSH là những sản phẩm dạng bột, viên, lỏng...có nguồn gốc trực tiếp từ VSV hoặc từ các sản phẩm trao đổi của VSV [8]. Những sản phẩm này có vai trò trong kiểm soát bệnh hại cây trồng.
CPSH không ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng, không gây ô nhiễm MT sinh thái. Có tác dụng cân bằng hệ sinh thái trong MT đất nói riêng và MT nói chung. Không làm hại kết cấu đất, không làm chai đất, thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất. CPSH có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông sản phẩm. Tiêu diệt sinh vật gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến MT như các loại thuốc có nguồn gốc hóa học. Bên cạnh đó, CPSH còn tăng khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu cơ bền vững, các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch MT [71].
Các CPSH ứng dụng cho cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm sản phẩm với các tính năng khác nhau: nhóm CPSH ứng dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng; nhóm CPSH dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất
kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng; nhóm CPSH dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp. Trong đó, nhóm CPSH ứng dụng cho phòng trừ sâu – bệnh hại là nhóm sản phẩm được ứng dụng khá rộng rãi và được ứng dụng sớm nhất trong lĩnh vực cây trồng.
Hiện nay, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học…với sự canh tác trên đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ VSV trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không dự báo trước.
Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng CPSH, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu hướng chung của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng nấm Trichoderma nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới và phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp. HCM.
- Chủng Fusarium sp. nhận từ Bộ môn Bảo vệ thực vật – Khoa Nông học Đại học Nông Lâm.
- Chủng Phytophthora sp. nhận từ Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam.
2.1.2. Hóa chất - Nguyên liệu
- Các loại đường chuẩn: glucose, succrose.
- Các loại hóa chất khác: KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, KCl, NaNO3, HCl, H2SO4, NaOH, (NH4)2SO4, KCl, CaCO3, MnSO4, CaCl2, ZnSO4, NH4NO3, urea, tween 80, thuốc thử DNS (Trung Quốc).
- Cao nấm men, pepton, bột chitin, agar.
- Giống cà chua bi (cherry) F1 (Green field seeds).
- Đất sạch Tribat: 54% chất hữu cơ, 8% mùn, 1,7% N tổng hợp, 0,4% K2O tổng số, 0,2% P2O5 tổng số, vi lượng Mg, Mn, Zn, B, Cu, Mo, Fe.
- Chế phẩm trừ nấm sinh học: Vi-ĐK (chế phẩm Bào tử Trichoderma spp. – công ty cổ phần thuốc sát trùng Việt Nam), enzyme β-glucanase (Viện Sinh học Nhiệt Đới)
- Các thuốc trừ nấm hóa học: Anvil, COC85.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
- Nồi hấp cao áp ALP (Nhật Bản). - Tủ sấy Memmert (Đức).
- Kính hiển vi quang học (Nhật Bản). - Máy đo pH Hanna (Mỹ).
- Máy li tâm (Rotina, Đức).
- Tủ cấy vô trùng Box laminer (Việt Nam). - Tủ lạnh (National- Nhật Bản).
- Tủ giử mẫu (Sanyo- Nhật Bản). - Máy lắc (Gerhardt- Đức).
- Cân điện (Sartorius -Đức).
- Máy quang phổ (Amersham – Thụy Điển). - Tủ ấm (Sanyo- Nhật Bản).
2.1.4. Các MT nghiên cứu đã sử dụng
MT nuôi cấy, giữ giống, bảo quản NS nghiên cứu
MT1 - (Môi trường YEA): Cao nấm men 4 g; glucose 20 g; agar 20 g; nước cất 1000 ml; pH = 5.5 – 6.0 [3].
MT2 - (Czapek – Dox cải tiến): NaNO3 3,5 g; KH2PO4 1,5 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; KCl 0,5 g; FeSO4.7H2O 0,01 g (vết); glucose 20 g; agar 20 g; nước cất 1000 ml; pH = 6.5 [23].
MT nuôi cấy, giữ giống NS gây bệnh
MT3 - (Môi trường PDA): Khoai tây 300 g; glucose 50 g; agar 20 g, nước cất 1000 ml [14].
Cách chế dịch khoai tây: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 300 g, thái nhỏ, thêm 1000 ml nước, đun sôi, nhỏ lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong [14].
MT4 - (MT carrot ): Carrot 200 g; glucose 20 g; agar 20 g; 1 ít CaCO3; nước cất 1000 ml [14].
Cách thực hiện: Carrot gọt vỏ, rửa sạch. Cân 200 g, cắt nhỏ, say nhuyễn, thêm 1000 ml nước cất, đun sôi trong 30 phút, sau đó cho 1 ít CaCO3vào .Lọc lấy dịch trong, cho thêm glucose, agar, nước cất cho đủ 1000 ml.
MT5 - (môi trường CYA): NaNO3 3 g; K2HPO4 1 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; KCl 0,5 g; FeSO4.7H2O 0,01 g (vết); succrose 30 g; agar 20 g; nước cất 1000 ml; pH = 6.5 [13].
MT cảm ứng NS sinh enzyme chitinase
MT6 - Dùng [MT2] để thử hoạt tính enzyme ngoại bào với cơ chất tương ứng chitin thay đường glucose với hàm lượng tương đương [3].
Môi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy phân chitinase từ các chủng NS
MT7: Trấu 50 g; cám 40 g; MgSO4.7H20 0,2 g; K2HPO4 1 g; KCl 0,2 g; NH4NO3 1,0 g; FeSO4.7H2O 0,002 g; MnSO4 0,002 g; bột chitin 10 g; pH = 5 – 6, nước cất 50 - 60% [36].
MT8: Trấu 50 g; cám 40 g; pepton 1 g; urea 0,3 g; KH2PO4 0,2 g; CaCl2 0,3 g; Tween 80 1,2 g; (NH4)2SO4 0,4 g; MgSO4.7H20 0,3 g; bột chitin 10 g; pH = 5 – 6; nước cất 50 - 60% [45].
MT9: Trấu 50 g; cám 40 g; pepton 0,5 g, cao nấm men 0,5 g; glucose 1 g; KH2PO4 0,3 g; K2HPO4 0,7 g; MgSO4.7H20 0,5 g; FeSO4.7H20 0,5 g; ZnSO4 0,001 g; bột chitin 10 g; pH = 5 – 6; nước cất 50 - 60% [40].
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch khuếch tán trên MT thạch
Nguyên tắc
Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải trong suốt quanh KL [3].
Cách tiến hành phương pháp khoan lỗ thạch
- Thu dịch enzyme: Cho 1ml huyền phù BT nấm sợi vào mỗi bình tam giác chứa 10g MT đã chuẩn bị, sao cho mật độ BT là 105đến 106
bào tử/1 gam MT. Nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp thu dịch nuôi cấy.
- Tiến hành lọc để loại bỏ cơ chất (trấu, cám…), sau đó ly tâm dịch nuôi cấy 5000 v/phút trong 10 phút. Lọai bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng ta thu được dịch enzyme thô.
- Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 9 mm) khoan các lỗ thạch trên MT nghiên cứu tương ứng trong các đĩa.
- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml dịch enzyme thô vào các lỗ khoan trên vào MT thử hoạt