6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.10. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ
Yếu tố MT ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của NS như thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, MT nuôi cấy, loại cơ chất cảm ứng ... Khảo sát các yếu tố trên nhằm chọn ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng NS nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase có hoạt độ cao nhất.
Khảo sát ảnh hưởng của thành phần MT nuôi cấy
Thành phần MT có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của NS. Tiến hành nuôi chủng NS nghiên cứu trong 3 MT bán rắn đề xuất MT 7, MT 8 và MT 9 trong 168h. Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168h nuôi cấy tiến hành thu dịch lên men và xác định hoạt độ chitinase.
Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng
Chất cảm ứng trong MT nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sự tổng hợp enzyme của NS. Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT cảm ứng sinh chitinase, trong đó sử dụng nguồn cơ chất cảm ứng lần lượt là bột chitin, chitin huyền phù 1%, bột vỏ tôm, bột vỏ cua. Sau 72h nuôi cấy, thu dịch enzyme thô, tiến hành xác định hoạt độ enzyme chitinase.
Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng
Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT 9, lần lượt bổ sung chitin huyền phù với các nồng độ 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0%. Sau 72h nuôi cấy, tiến hành thu dịch chiết enzyme, xác định hoạt độ chitinase.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cấy
Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT 9, ủ trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 200C, 250C, 300C, 350C, 400C. Sau 72h nuôi cấy, thu dịch enzyme thô, tiến hành xác định hoạt độ enzyme chitinase.
Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu của MT nuôi cấy
Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT 9, sử dụng NaOH 1N và HCl 1N để điều chỉnh pH ban đầu của MT nuôi cấy để đạt các giá trị pH là 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5. Thanh trùng MT, để nguội, cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện, nguồn cơ chất, nồng độ cơ chất, nhiệt độ đã xác định ở trên. Sau 72h nuôi cấy, thu dịch enzyme tiến hành xác định hoạt độ chitinase.
Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của MT nuôi cấy
Sử dụng MT9, bổ sung các lượng nước khác nhau để đạt được độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70, 75%. Thanh trùng MT, để nguội, rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện, nguồn cơ chất, nồng độ cơ chất, nhiệt độ đã xác định ở trên. Sau 72h nuôi cấy, thu dịch enzyme tiến hành xác định hoạt độ chitinase.
Khảo sát động học quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng NS nghiên cứu
Nuôi chủng NS nghiên cứu trong MT 9 ở các điều kiện đã khảo sát ở trên trong 168h. Sau 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168 giờ nuôi cấy tiến hành xác định hoạt độ chitinase; pH và độ ẩm MT nuôi cấy.