6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.2.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase
1.2.7.1. Khả năng ứng dụng của enzyme chitinase từ Trichoderma spp. trong nông nghiệp
Cơ sở khoa học ứng dụng enzyme chitinase trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật
Thành tế bào của vi nấm dày khoảng 0,2 µm, có tính phản quang rất mạnh nên có thể phân biệt rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhiều công trình đã chứng minh cấu tạo thành tế bào vi nấm vừa có cấu trúc bản mỏng vừa có cấu trúc sợi.
Bảng 1.1. Cấu tạo chính của thành tế bào ở các nhóm nấm chủ yếu [1], [72]:
Nhóm phân loại Cấu tạo chính của thành tế
bào
Plasmodiophore Chitin
Nấm noãn Oomycetes Cellulose – Glucan
Nấm cổ Hyphochytridiomycetes
Chytridiomycetes
Cellulose – Chitin Chitin – Glucan
Nấm tiếp hợp Zygomycetes Chitin – Chitosan
Nấm nang Nấm đảm Nấm bất toàn Ascomycetes Basidiomycetes Deuteromycetes Chitin – Glucan
Ngoại lệ Saccharomycetaceae Rhodotorulaceae Glucan – Mannan
Chitin – Mannan
Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chứa chitin. Chitinase và β-1,3-glucanase được tạo ra trong mô thực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của bệnh. Sự kích thích hoạt tính enzyme chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải ammoniac, phenylalanine làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật [45].
Bên cạnh đó các nhà khoa học cũng đã chứng minh quá trình chống lại các mầm bệnh thực vật có liên quan đến việc sản xuất ra enzyme chitinase. Theo các thí nghiệm invitro gần đây cho biết: trong quá trình sống kí sinh với nấm bệnh, Trichoderma tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin. Bao gồm phức hợp với 6 enzyme khác biệt nhau, hai enzyme β- 1,4-N-acetyl glucosaminidase có trọng lượng phân tử lần lượt là 102, 73 kDa và bốn enzyme endochitinase có trọng lượng phân tử lần lượt là 52, 42, 33, 31 kDa. Trong đó, endochitinase (42 kDa) có khả năng phân hủy vách tế bào Botrytis cinerea in vitro. Quá trình kháng nấm muốn đạt hiệu quả cao nhất cần có sự phối hợp hoạt động bổ sung cho nhau của cả 6 enzyme [30], [50].
Phối hợp chitinase và chủng vi khuẩn Enterobacter cloeace kháng nấm
Đây là sự kết hợp giữa enzyme phân hủy thành tế bào nấm mốc với vi khuẩn kháng nấm Enterobacter cloeace (vi khuẩn thường thấy trên bề mặt hạt và vùng rễ của thực vật). Sự kết hợp này nhằm mục đích kìm hãm sự tăng trưởng và phát triển của các loài nấm mốc thông qua sự tác động kép: chitinase phân giải chitin thành tế bào nấm mốc tạo MT dinh dưỡng cho Enterobacter cloeace tăng sinh trong tự nhiên, đồng thời tăng khả năng kiểm
soát sinh học nhờ tăng khả năng gắn vào thành khuẩn ty của nấm mốc (nếu dùng các loại đường cơ bản như D-glucose, saccharose…trong MT nuôi cấy Enterobacter cloeace sẽ hạn chế sự gắn vào thành khuẩn ty của nấm mốc của chủng vi khuẩn này). Các nhà khoa học đề nghị tỉ lệ endochitinase/chitin 1,4-β-chitobiosidase là 1/1 và tỉ lệ kết hợp hiệu quả với
Enterobacter cloeace trong khoảng 1 tế bào/1µg – 200.000 tế bào/1µg. Hiện nay, người ta sử dụng hỗn hợp này để bảo vệ hạt giống, lá, rễ, quả, vùng đất xung quanh hạt… Hỗn hợp này có thể dùng để kháng các loài nấm mốc gây bệnh thực vật như: Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, Botrytis…[43].
Chế phẩm biocid – sự tác động cộng hưởng của hệ enzyme chitinase, các enzyme khác và các tác nhân kháng nấm
Các nhà khoa học đã nghiên cứu sự phân hủy vách tế bào vi nấm bởi các enzyme chitinase, glucanase, cellulase,…và đã thử nghiệm trên đồng ruộng tác dụng của chế phẩm biocid. Khi sử dụng riêng biệt chế phẩm chitinase thì hiệu quả tiêu diệt thấp chỉ có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm bệnh. Vì thế khi kết hợp với chế phẩm enzyme protease phối trộn với 1 số tác nhân khác có hiệu quả tiêu diệt nấm mốc, côn trùng cao. Khi phối trộn 2 chế phẩm này theo tỉ lệ 1:1 thì thu được hiệu quả cao hơn. Đây có thể là do sự cộng hưởng hoạt tính của 1 hệ sinh hóa phức tạp đa nhân tố. Ngoài ra, người ta còn tìm cách tăng cường hoạt tính kháng nấm thông qua tác động cộng hưởng giữa hỗn hợp chế phẩm trên với các tác nhân kháng nấm [8].
Thu nhận và ứng dụng enzyme chitinase từ T. harzianum
Enzyme chitinase được thu nhận từ chủng T. harzianum P1 (ATCC 74058). Chủng này được nuôi cấy trong môi trường Richard cải tiến; sau 4 ngày, sinh khối NS được loại bỏ bằng cách ly tâm và thu dịch nổi bên trên, đem thẩm tích để loại bỏ những phân tử có trọng lượng nhỏ. Dịch MT lỏng được đem đi sắc kí để thu nhận 1 phân đoạn có hoạt tính exochitinase và 1 phân đoạn có hoạt tính endochitinase.
Những enzyme được tinh khiết này sẽ ức chế nấm và côn trùng chứa chitin. Nấm chứa chitin bị ức chế bởi những enzyme chitinase bao gồm: Fusarium, Rhizotonia, Sclerotium,… Ở đây việc ức chế bằng những enzyme chitinase được thực hiện bằng cách cho enzyme tiếp xúc với nấm hay côn trùng. Enzyme chitinase được sử dụng như là 1 dung dịch và có nồng độ xác định (50 – 100 ppm) và được ứng dụng trong thuốc xịt hoặc được dùng như 1 loại thuốc bột [42].
Trên thế giới
So với các enzyme khác như protease, amylase, pectinase ... thì hệ enzyme chitinase được nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn hạn chế.
Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces. Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm.
Năm 1978, P.A. Carroad và R. A. Tom có nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I. G. Cosio, R. A. Fisher, P. A. đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin.
Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi
Trichoderma. Năm 1991, Ulhoa nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của T. harzianum [67].
2004 – 2006, Harman và Howell đã có nhiều công trình nghiên cứu về hệ enzyme thủy phân ở Trichoderma spp. [41], [42], [46].
Dường như Trichoderma là chi nấm được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật. Đối với chi nấm
Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của chúng trên MT bán rắn. Những chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là A. carneus, A. fumigatus…[59].
Trong nước
Nhìn chung những nghiên cứu về enzyme chitinase còn rất hạn chế cho dù tiềm năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận.
Năm 2001, tác giả Đinh Minh Hiệp có công trình nghiên cứu đặc tính của enzyme chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dược [7].
Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichodrema.
Năm 2007, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh [13].
Năm 2010, tác giả Lê Thị Huệ đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma. Và bước đầu thu chế phẩm enzyme chitinase thô từ Aspergillusđể phòng trừ sâu tơ và sản xuất glucosamine [12]. Năm 2012, tác giả Đinh Minh Hiệp đã nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ
Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh [8].