6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.6.2.các lô gây nhiễm Fusarium sp
Sau 2 tuần các cây cà chua con xuất hiện triệu chứng là các lá cây bắt đầu bị vàng từ dưới, thân cây chuyển sang màu hơi nâu. Đến tuần thứ 3 – 4, các lá cây càng bị vàng và lan dần lên ngọn cây; thân cây, nhất là phần gốc sậm nâu. Đến đầu tuần thứ 4, khi sự vận chuyển nước trong cây bị hạn chế đã một số cây đã héo khô và chết.
Hình 3.30 Lá bị vàng ở lô ĐC sau 1 tuần
Hình 3.32 Cây bị héo khô sau và chết sau 4 tuần.
Hình 3.31 Gốc thân cây có màu nâu sậm
Cụ thể tỉ lệ nhiễm Fusarium sp. ở lô đối chứng và các lô TN1, TN2, TN3 được trình bày trong bảng 3.16 và minh họa ở hình 3.33.
Bảng 3.16 Ảnh hưởng của tỉ lệ CPE và tác nhân kháng nấm khác đến khả năng ức chế
Fusarium sp. trên cây cà chua con
Lô TN Tổng số cây biểu hiện bệnh Tỉ lệ bệnh (%) Hiệu lực đối kháng (%) ĐC 23 76,67 0,00 TN1 16 53,33 30,43 TN2 11 36,67 52,17 TN3 10 33,33 58,33
Kết quả trên cho thấy:
Ở lô đối chứng, tổng số cây có dấu hiệu bị nhiễm Fusarium sp. sau 4 tuần theo dõi là 23/30 cây, TLB là 76,67%. Ở các lô TN1, TN2, TN3 tỉ lệ cây bệnh đã giảm so với lô ĐC.
Ở TN1, khi chỉ sử dụng CPE thì TLB là 53,33%, HLĐK là 30,43% so với đối chứng. Do đó, ta co thể khẳng định CPE chitinase của chủng Trichoderma BL2 có khả năng phòng trừ Fusarium sp. gây bệnh trên cà chua con, nhưng hiệu quả đối kháng còn thấp.
Khi phối hợp CPE với các tác nhân đối kháng khác (tỉ lệ 1:1) thì hiệu quả đối kháng đã gia tăng. Ở TN2, khi phối hợp với β-gluacanase, HLĐK đã tăng lên 52,17%; ở TN3, khi phối hợp với COC85, HLĐK đã tăng lên 58,33%. Điều này chứng tỏ CPE có khả năng trong phòng trừ Fusarium sp. gây hại trên cây, nhất là khi kết hợp với các tác nhân đối kháng khác.
TN1
Hình 3.33 Cây cà chua ở các lô gây nhiễm Fusarium sp. sau 4 tuần
Khi kết hợp, so sánh kết quả của cả 2 TN trên (hình 3.34), chúng tôi có thể đưa ra kết luận sau:
Hình 3.34 Tác dụng của CPE và tác nhân kháng nấm khác đến khả năng ức chế vi nấm gây hại trên cây cà chua
Khi sử dụng riêng CPE để phòng trừ Fusarium sp., Phytophthora sp. trên cây cà chua con (45 ngày tuổi), CPE thể hiện khả năng kháng bệnh nhưng hiệu quả không cao. HLĐK dao động trong khoảng 20 – 30%. Nhưng HLĐK của CPE sẽ tăng khi sử dụng CPE như một
Đối chứng NT1 NT2 NT3 TLB - Fusarium 76,67 53,33 36,67 30,00 HLĐK - Fusarium 0,00 30,43 52,17 60,87 TLB - Phytophthora 80,00 56,67 40,00 33,33 HLĐK - Phytophthora 0,00 29,17 50,00 58,33 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 Tỉ lệ bện h (%) Hi ệu lự c đối kh án g ( % ) Lô thí nghiệm Fusarium sp. TN2 TN3 Fusarium sp. Phytophthora sp. Phytophthora sp.
tác nhân hỗ trợ, phối hợp với các biện pháp phòng trừ khác. HLĐK của CPE và các tác nhân kháng nấm với Fusarium sp. cao hơn so với Phytophthora sp.
Kết quả này tương đồng với kết quả của tác giả Đinh Minh Hiệp (2012) khi sử dụng chế phẩm enzyme chitinase để phòng trừ Rhizoctonia solani trên cây cải ngọt.
Từ các kết quả trên, chúng tôi khẳng định CPE chitinase thô từ Trichoderma BL2 có khả năng ứng dụng trong phòng trừ vi nấm Fusarium sp. và Phytophthora sp. gây hại trên cà chua trong giai đoạn cây con.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được những kết quả sau:
- Tuyển chọn được chủng Trichoderma BL2 có khả năng tổng hợp enzyme chitinase hoạt độ cao trong các chủng khảo sát.
- Đã khảo sát và xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng Trichoderma BL2 tổng hợp enzyme chitinase hoạt độ cao: Trấu 50 g; cám 40 g; pepton 0,5 g, cao nấm men 0,5 g; glucose 1 g; KH2PO4 0,3 g; K2HPO4 0,7 g; MgSO4.H20 0,5 g; FeSO4.H20 0,5 g; ZnSO4 0,001 g; chitin huyền phù 1,0%; pH ban đầu của MT là 5.0; độ ẩm ban đầu của MT là 60%. - Tạo được CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 với hoạt độ là 60,418 (UI/gCPE). - Đã xác định các điều kiện phản ứng thích hợp để CPE chitinase từ chủng Trichoderma
BL2 hoạt động tốt là: nhiệt độ phản ứng 40oC, pH phản ứng 5.5, thời gian phản ứng 60 phút, nhiệt độ bảo quản 4 – 8oC trong điều kiện không bổ sung thêm cơ chất là khoảng 3 tháng. - CPE từ chủng Trichoderma BL2 bước đầu có khả năng phòng trừ vi nấm Fusarium sp. và
Phytophthora sp. gây hại trên cà chua trong giai đoạn cây con (45 ngày tuổi). Đặc biệt có hiệu quả cao hơn khi phối hợp với β-glucanase (50%) và COC85 (60%).
Kiến nghị: Tiếp tục theo dõi sự ổn định hoạt tính của CPE chitinase từ chủng Trichoderma BL2 và khả năng phòng vi nấm gây hại cây trồng của CPE với các tác nhân kháng nấm khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm, Nxb Khoa học và Kĩ Thuật, Hà Nội, tr. 5-8.
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học (tập 1, 2), Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, tr. 88-109.
3. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 3), Nxb Khoa học và kĩ thuật Hà Nội, tr. 115-140.
4. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Văn Huy (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nxb Khoa học và Kĩ thuật.
5. Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS-Excel, Nxb Giáo dục, tr. 21-29.
6. Phan Thúy Hiền, Lester W. Burgess, Timothy E. Knight, Len Tesoriero (2009), Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam, Nxb Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp quốc tế Australia, tr. 88-92, 116-132.
7. Đinh Minh Hiệp (2001), Nghiên cứu các đặc tính của enzyme chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus Fimentarius và một số ứng dụng, Luận án thạc sĩ khoa học, trường Đại học Khoa học tự nhiên.
8. Đinh Minh Hiệp (2012), Nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm bệnh gây hại, Luận án Tiến sĩ, Viện Sinh học Nhiệt đới.
9. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, tr 764-765.
10. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kĩ thuật sinh hóa, Tủ sách trường Đại học Khoa học tự nhiên, tr. 98-115.
11. Phạm Thị Ánh Hồng (chủ biên), Trần Mỹ Quan, Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Quang Tâm (2004), Thực tập sinh hóa cơ sở, Nxb Đại học quốc gia TP. HCM.
12. Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ sinh học, trường Đại học Sư phạm TP.HCM.
13. Tô Duy Khương (2007), Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichodermaspp. và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp.HCM.
14. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học – tập 2 Thí nghiêm vi sinh vật, Nxb Đại học Quốc gia TP.HCM, tr. 105-112, 446-447.
15. Phạm Thị Nhất (2000), Sâu bệnh chính hại một số cây thực phẩm và biện pháp quản lí,
Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 19-39.
16. Lương Đức Phẩm (2011), Sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học trong nông nghiệp, Nxb Giáo dục Việt Nam, tr 209-215.
17. Nguyễn Thị Uyên Thảo (2007), Nghiên cứu tạo chế phẩm xylanase từ vi nấm
Trichoderma, Luận văn Thạc sĩ sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên.
18. Đồng Thị Thanh Thu (2008), Giáo trình Sinh hóa cơ bản, tủ sách Đại học Khoa học tự nhiên, tr. 43-70.
19. Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tr. 62-70. 20. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), Bảo vệ cây trồng bằng các
chế phẩm từ vi nấm, Nxb Nông nghiệp, tr. 144-153.
21. Lê Ngọc Tú (1998), Hóa sinh công nghiệp, Nxb Khoa học và Kĩ thuật, tr. 32-32; 409- 422.
22. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm nghiệp trên máy vi tính, Nxb Nông nghiệp, tr. 37-52.
23. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr. 38- 39; 41-42, 52-54.
24. Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2003), Một số dịch hại chính trên cây trồng tại TP. Hồ Chí Minh, TP. HCM, tr. 124-136.
Tiếng Anh
25. Agosin E., Volpe D., Äoz G. Mun, Martin R. San and Crawford A. (1997), “Effect of culture conditions on spore shelf life of the biocontrol agent T. harzianum”, World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 13, pp. 225-232.
26. Ashwin G. Lunge and Anita S. Patil (2012), “Characterization of efficient chitinolytic enzyme producing Trichoderma species: a tool for better antagonistic approach”,
27. Baek Jong-Min, C. R. Howell, Charles M. Kenerley (1998), “The role of an extracellular chitinase from Trichoderma virens Gv29-8 in the biocontrol of
Rhizoctonia solani”, Curr Genet, Vol. 35, pp. 41-50.
28. Baker K. F., Cook r. J. (1974), “Biological control of plant pathogens”, The American Phytopathological Society, St. Paul.
29. Brown W.M. (2004), “The Effect of the Trichoderma harzianum Strains on the Growth of Tomato”, Seedlings Acta Hort, 635, pp. 131-135.
30. Brameld A. Ken, William D. Shrader, Imperiali Barbara and Goddard III A. (1998), “Substrate assistance in the mechanism of family 18 chitinase: Theoretical studies of potential intermediates and inhibitors”, J. Mol. Biol, vol 280, pp. 923-923.
31. Crispinus A. Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), “Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride”, The Journal of Genaral anh Applied Microbiology, 47(2), pp. 53-61.
32. Daizo Koga (2005), “Application of chitinase in agriculture”, Journal of Metals, Materials and Minerals, 15(1), pp. 33-36.
33. Domsch K. H. et al. (1980), “Compendium of the soil fungi”, Academic Press, 1, pp. 263-255.
34. Druzhinina S. I. et al. (2006), “The first 100 Trichoderma species characterized by monecular data”, Mycoscience, 47, pp. 55-64.
35. Elad Y., Barak R, Chet I., Henis Y. (1982), “Ultrastructural studies of the interaction between Trichoderma spp. and plant pathogenic fungi”, Phytoph. Z., 107, pp. 168- 175.
36. El-Katatny et al (2000), “Production of Chitinase and -1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for control of the phytopathogenic fungus Sclerotium rolfsii”, Food technol. Biotechnol, 38(3), pp. 173–180.
37. Eman Fathi Sharaf, Abd El-Aziz Qablan El-Sarrany and Mai El-Deeb (2012), “Biorecycling of shrimp shell by Trichoderma viride for production of antifungal chitinase”, African Journal of Microbiology Research, 6(21), pp. 4538-4545.
38. Ghanem K. M, Al-Garni S. M and Al-Makishah N. H (2010), “Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus terreus”, African Journal of Biotechnology, Vol. 9(32), pp. 5135-5146.
39. Gomathinayagam S., Persaud Sherena Amela and Rekha M. (2012), “Comparative study of biological agents, Trichoderma harzianum and Trichoderma viride for controlling brown spot disease in rice”, JBiopest, 5, 28-32, pp 28-32.
40. Guoqing et al. (2001), “A novel chitinase having a unique mode of action from
Aspergillus fumigatus YJ-407”, Eur. J. Biochhem, 268, pp. 4079-4085.
41. Harman G. E. (2006), “Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp.”,
Phytopathology, 96(2), 190-194.
42. Harman G E, Howell C R, Viterbo A, Chet I and Lorito M (2004), “Trichoderma
species – opportunistic, avirulent plant symbionts”, Nature Reviews Microbiology, 2, pp. 43-56.
43. Harman E. G., Kubicek, Christian P. (1998), “Trichoderma and Gliocladium”, 1, pp. 57-181.
44. Harran S., Oppenheim A., Chet I. (1998), “Induction of the Trichoderma harzianum
chitinolytic system is triggered by the chitin monomer, N-acetyl glucosamine”,
Mycological Reseach, 102, pp. 1224-1226.
45. Hirohi Ihui, Hirano S., Kosaki H., Uno Y., Toda T. (1994), “Biotechnology and bioactive polymers”, 2, pp. 34-35.
46. Howell C. R. (2002), “Mechanisms employed by Trichoderma spp. in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts”, Plant Diseases, 87(1), pp. 4-10.
47. Jayalakshmi S.K, Raju S, Usha Rani S, Benagi V.I and Sreeramulu K (2009), “Trichoderma harzianum L1 as a potential source for lytic enzymes and elicitor of defense responses in chickpea ( Cicer arietinum L.) against wilt disease caused by Fusarium oxysporum f. sp. cicero” , Australian Journal of Crop Science Southern Cross Journals, 3(1), pp. 44-52.
48. Jennifer L. Guthrie, Sagal Khalif, Alan J. Castle (2005), “An improved method for detection and quantification of chitinase activities”, Canadian Journal of Microbiology, 51(6), pp. 491-495.
49. Jeuniaux C. (1963), “Chitinase – Methods of Enzymology”, 4, pp. 644-650.
50. Jolles P., Muzzaralli A. R. (1999), “Chitin and chitinase”, Birkhauser verlag, Basel, Switzerland, pp. 125-133.
51. Kapat A., Panda T., Rakshit S. K. (1996), “Parameters optimation of chitin hydrolysis by Trichoderma harzianum chitinase under assay conditions”, Bioprocess Engineering ,14, pp. 275-279.
52. Kim Kyoung-Ja, Yang Yong-Joon and Kim Jong-Gi (2002), “Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20”, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 36(2), pp. 185-189.
53. Li Duo-Chuan (2006), “Review of fungal chitinases”, Mycopathologia, Vol 161, pp 345–360.
54. Lorito et al. (1993), “Antifungal synergistic interaction between chitinolytic enzymes from Trichoderma harzianum and Enterobacter cloacae”, Phytopathology, 83, pp. 721-728.
55. Mastouri Fatemeh, Björkman Thomas, Harman Gary E. (2010), “Seed Treatment with
Trichoderma harzianum Alleviates biotic, abiotic, and physiological stresses in germinating seeds and seedlings”, Biological Control, Vol. 100(11), pp. 1213-1221. 56. Matroudi et al. (2009), “Antagonistic effects of three species pf Trichoderma sp. on
Slerotinia slerotiorum, the causal agent of canola stem rot”, Egytian Journal of Biology, 11, pp. 37-44.
57. Montealegre Jaime, Valderrama Luis, Sánchez Soledad, Herrera Rodrigo, Besoain Ximena, María Pérez Luz (2010), “Biological control of Rhizoctonia solani in tomatoes with Trichoderma harzianum mutants”, Electronic Journal of Biotechnology, 13(2), pp. 0717-3458.
58. Naher Laila , Tan Soon Guan , Yusuf Umi Kalsom, Ho Chai Ling, and Siddiquee Shafiquzzaman (2012), “Activities of chitinase enzymes in the oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) in interactions with pathogenic and non-pathogenic fungi”, Plant Omics Journal 5(4), pp. 333-336.
59. Nopakarn R. et al. (2002), “Ultilization of shrimp Shellfish waste as a substrate for solid – state cultivation of Aspergillus sp. S1-13: evaluation of a culture base on chitinase formation which is necessary foa chitin-assimilation”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 93(6), pp. 550-556.
60. Papavizas G. C. (1985), “Trichoderma and Gliocladium: biology, ecology and potential for biocontrol”, Annu Rev. Phytopathology, 23, pp. 473-483.
61. Patil S. Reetarani, Ghormade Vandana, Deshpande V. Mukund (2000), “Chitinolytic enzymes: an exploration”, Enzyme and Microbial Technology, Vol 26, pp. 473–483. 62. Prasun K. and R. Kanthadai (1997), “Effect of temperature an ortagonistic and
biocontrol potential of Trichoderma spp. on Scerotium rolfsii”, Mycopathology, 139, pp. 151-155.
63. Roiger D. J, Jeffers S. N., Caldwell R. W. (1991), “Occurrence of Trichoderma species in apple orchard and wooland soil”, Soil. Biol. Biochems, 23, pp. 353-359.
64. Samuels G. J. (2000), “Trichoderma systematic, the sexual state and ecology”,
Phytopathology, 96, pp. 195-206.
65. Seyis I. et al. (2005), “Investigation of factors affecting xylynase acting from
Trichoderma harzianum”, Brazilian archives of Biology and Technology, 48(2), pp. 187-193.
66. Toyama, Hideo (1995), “Intra species karyoduction in Trichoderma reesei QM 9414 using the smaller nuclei”, Journal of Biotechnology, 39(1), pp. 35-40.
67. Ulhoa C. J., Peberdy J. F. (1991), “Regulation of chitinase synthesis in Trichoderma harzianum” , Journal of General Microbiology, 137, pp. 2163-2169.
68. Weindling R. (1932), “Trichoderma lignorum as a parasite of other fungi”,
Phytopathology, 22, pp. 837-845.
69. Yedidia et el. (2001), “Effect of Trichoderma harzianum on microelement concentratuons and increased growth of cucumber plants”, Plant Soil, 235, pp. 235- 242. Trang Web 70. http://phytophthora.pppmb.cals.cornell.edu/biology.html 71. http://www.biocontrol.entomology.cornell.edu/pathogens/trichoderma.html 72. http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vinam01a.htm 73. http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A0_chua
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Quy trình tách chiết bột chitin từ vỏ tôm, cua. Xử lí nguyên
liệu ban đầu
- Rửa sạch, phơi khô, giã nhỏ
Loại bỏ khoáng, tạp
chất
- Ngâm trong dung dịch HCl 12%, tỉ lệ 1/10 (m/v) ở nhiệt độ phòng, thời gian 48h.
- Sau đó rửa nước nhiều lần.
Loại protein
- Ngâm trong dung dịch NaOH 12%, tỉ lệ 1/15 (m/v) ở nhiệt độ 100o
C, trong 2h.
- Sau đó rửa nước nhiều lần.