6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase
Nguyên tắc: Hoạt độ enzyme chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng glucosamine trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan [3], [56].
Cách tiến hành thí nghiệm
Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1%
- Do chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin: Lấy 5 g chitin hòa tan trong 50 ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong vòng 3 phút ở 400C. Sau đó cho nước cất lạnh 50C từ từ tới 500 ml, chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa.
- Dịch huyền phù sẽ được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Rửa nước cất nhiều lần để pH đạt trung tính.
- Sau đó bảo quản dịch huyền phù ở tủ lạnh (4 - 60
C).
Bước 2:Xác định hoạt độ enzyme chitinase Với enzyme làm thí nghiệm
- Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày.
- Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: 1 ml huyền phù chitin 1% và 1 ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp này được ủ ở 400
C trong vòng 60 phút.
- Ngừng phản ứng bằng 1 ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút. - Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút hoặc lọc, thu dịch nổi.
- Cho 1 ml dịch nổi và 1ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh.
- Thêm 5 ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sóng 535nm. Với dịch enzyme làm đối chứng
Cho 1 ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 1 ml NaOH 1N, sau đó cho thêm 1 ml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên. Lượng glucosamine tạo thành sau phản ứng thủy giải bởi enzyme chitinase được xác định theo phương pháp Elson- Morgan.
Cách tính kết quả
Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μg glucosamine từ chitin huyền phù trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ phản ứng 400C [56].
Hoạt tính chung (đvht/g CPE ) = Trong đó
a: hàm lượng glucosamine (μg /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng n: hệ số pha loãng
v1: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml)
v2 : thể tích enzyme TN (ml) t : thời gian phản ứng (phút) m : khối lượng enzyme (g)