6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.2.1. Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán
Nguyên tắc
Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải trong suốt quanh KL [3].
Cách tiến hành phương pháp khoan lỗ thạch
- Thu dịch enzyme: Cho 1ml huyền phù BT nấm sợi vào mỗi bình tam giác chứa 10g MT đã chuẩn bị, sao cho mật độ BT là 105đến 106
bào tử/1 gam MT. Nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp thu dịch nuôi cấy.
- Tiến hành lọc để loại bỏ cơ chất (trấu, cám…), sau đó ly tâm dịch nuôi cấy 5000 v/phút trong 10 phút. Lọai bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng ta thu được dịch enzyme thô.
- Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 9 mm) khoan các lỗ thạch trên MT nghiên cứu tương ứng trong các đĩa.
- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml dịch enzyme thô vào các lỗ khoan trên vào MT thử hoạt tính tương ứng. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 4 - 6 giờ. Sau đó chuyển sang tủ ấm 28 - 300C ủ từ 2 đến 3 ngày.
- Nhỏ thuốc thử lugol lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo KL. Kiểm tra kết quả
Nếu NS có hoạt tính chitinase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan chứa dịch enzyme. Vùng chitin chưa bị phân giải có màu nâu đỏ nhạt.
Đánh giá kết quả
- Đặt sấp hộp petri, dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đường kính lỗ thạch (d = 9mm)
- Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzyme của các chủng NS [3]. Quy ước:
D-d ≥ 25 mm: hoạt tính enzyme mạnh. D-d ≥ 20 mm: hoạt tính enzyme khá mạnh. D-d ≥ 15 mm: hoạt tính enzyme trung bình. D-d ≤ 10 mm: hoạt tính enzyme yếu.