Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý phế thải vỏ quả cà phê làm phân hữu cơ

ðể tiến ñến một nền nông nghiệp sinh thái bền vững ñòi hỏi con người phải tìm ra những giải pháp phù hợp với thiên nhiên, một trong những giải pháp ñó là sản xuất phân bón hữu cơ có nguồ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

–––––
–––––

TRẦN ðỨC HUY

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ THẢI

VỎ QUẢ CÀ PHÊ LÀM PHÂN HỮU CƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

–––––
–––––

TRẦN ðỨC HUY

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ THẢI

VỎ QUẢ CÀ PHÊ LÀM PHÂN HỮU CƠ

CHUYÊN NGÀNH: Khoa học Môi trường

MÃ SỐ: 60440301

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÊ NHƯ KIỂU

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất

kỳ luận văn nào trước ñây

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập tại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ nhiệt tình của Ban chủ nhiệm Khoa Tài nguyên và Môi trường, các thầy cô giáo, gia ñình cùng bạn bè

ñể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Nhân dịp này, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến tất cả những sự giúp ñỡ quý báu ñó

Lời ñầu tiên tôi trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Tài nguyên và Môi trường – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, các thầy cô giáo giảng dạy và hướng dẫn thực tập ñã tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian qua Tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Như Kiểu, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn VSV, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa

ñã giúp ñỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong thời gian thực tập vừa qua

Cuối cùng tôi muốn dành lời cảm ơn chân thành tới bố mẹ, gia ñình, các ñồng nghiệp và tập thể lớp MTAK20, những người ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2013

Tác giả luận văn

Trần ðức Huy

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ .viii

Chương I MỞ ðẦU 1

1.1 ðẶT VẤN ðỀ 1

1.2 MỤC TIÊU 3

1.3 YÊU CẦU 3

Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 KHỐI LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN PHẾ PHỤ PHẨM TỪ SẢN XUẤT CÀ PHÊ 4

2.2 BIỆN PHÁP XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM CÀ PHÊ 5

2.2.1 ðốt 5

2.2.2 Ủ làm phân 5

2.2.3 Ủ trực tiếp vào ñất, trên ruộng 9

2.2.4 Tái sử dụng tạo ra các sản phẩm hữu ích khác 10

2.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI PHẾ THẢI VỎ CÀ PHÊ 11

2.3.1 Hệ thống enzym vi sinh vật 11

2.3.2 Cơ sở khoa học của quá trình phân hủy 11

2.3.2.1 Phân giải xenluloza 12

2.4.2.2 Phân giải tinh bột 18

2.3.2.3 Phân giải protein 20

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình xử lý phế thải làm phân bón 21

2.3.3.1 Yếu tố phi sinh học 22

2.3.3.2 Yếu tố sinh học 25

2.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ PHẾ THẢI LÀM PHÂN BÓN 26

2.4.1 Nghiên cứu trên thế giới 26

2.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 29

2.4.2.1 Xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 30

2.4.2.2 Xử lý vỏ cà phê làm phân hữu cơ sinh học 33

Chương III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 35

3.1.1 Vật liệu 35

3.1.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 35

3.1.3 Thời gian nghiên cứu 35

3.1.4 Môi trường nghiên cứu 35

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37

3.3 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 37

3.3.1 Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân giải xenlulo 37

3.3.2 Xác ñịnh các ñiều kiện lên men nhân sinh khối của các chủng VSV 38

3.3.2.2 Xác ựịnh hình thái, kắch thước khuẩn lạc của vi sinh vật 38

3.3.2.3 Lựa chọn môi trường thắch hợp 39

3.3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ 39

3.3.2.5 Ảnh hưởng của pH 40

3.3.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ 40

3.3.2.7 Xác ựịnh hoạt tắnh enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 41

3.3.3 Bảo quản giống 42

3.3.4 Phân loại VSV bằng phương pháp sinh học phân tử 43

3.3.5 Sản xuất chế phẩm vi sinh 43

3.3.5.1 Nguyên liệu chế tạo chất mang 43

3.3.5.2 Nghiên cứu tắnh ựối kháng giữa các chủng VSV 43

3.3.5.3 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật 44

3.3.6 Các phương pháp phân tắch vi sinh vật, sinh vật 45

3.3.6.1 Kiểm tra mật ựộ tế bào vi khuẩn, xạ khuẩn 45

3.3.6.2 Kiểm tra vi sinh vật tạp 46

3.3.6.3 Kiểm tra mật ựộ Colifom 46

3.3.6.4 Kiểm tra mật ựộ Salmonella (TCVN 4829 Ờ 2005) 46

3.3.6.5 Kiểm tra mật ựộ E.coli (TCVN 6846:2007) 47

3.3.6.6 Xác ựịnh trứng giun 47

3.3.7 Phân tắch các chỉ tiêu lý tắnh, hóa tắnh của các mẫu cà phê sau ủ 47

3.3.7.1 Các chỉ tiêu lý tắnh 47

3.3.7.2 Các chi tiêu hóa tắnh 48

3.3.8 Nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật 48

3.3.8.1 Thắ nghiệm nhà lưới 48

3.3.8.2 Phương pháp Plant test (Subrao Ờ Indian, 1980) 49

3.3.9 Phương pháp phân tắch và xử lý số liệu 49

Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

4.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT PHÂN GIẢI XENLULO 50

4.1.1 Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải xenlulo 50

4.1.2 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo mạnh 51

4.2 PHÂN LOẠI VÀ đỊNH TÊN VI SINH VẬT 52

4.2.1 đặc ựiểm hình thái, kắch thước 52

4.2.2 đặc ựiểm sinh lý, sinh hóa của các chủng VSV tuyển chọn 53

4.2.2 Giải trình tự ADNr16S và phân loại vi sinh vật 54

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA đIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG đẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT LỰA CHỌN 56

4.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau 56

4.3.2 Ảnh hưởng của pH và nhiệt ựộ 58

4.3.3 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất 60

4.4 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT 61

4.4.1 Nghiên cứu tắnh ựối kháng giữa các chủng VSV ựã tuyển chọn 61

4.4.2 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật trong ựiều kiện chất mang dạng bột 62 4.4.3 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật 64

4.4.4 đánh giá chất lượng của chế phẩm vi sinh vật sau khi sản xuất và trong thời gian bảo quản 65

4.5 XỬ LÝ VỎ CÀ PHÊ BẰNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT 67

4.5.1 Thành phần chủ yếu trong vỏ cà phê 67

4.5.3 Kết quả xử lý vỏ quả cà phê bằng chế phẩm vi sinh vật 69

4.5.3.1 Diễn biến nhiệt ñộ trong ñống ủ 71

4.5.3.2 Chất lượng ñống ủ sau xử lý 72

4.5.4 Kiểm tra vi sinh vật gây bệnh trong ñống ủ 75

Chương V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHỤ LỤC 83

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

(Chương trình xạ khuẩn quốc tế)

(Phản ứng chuỗi trùng hợp)

DANH MỤC CÁC BẢNG

sinh enzym ngoại bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2

56

VSV

58

enzym ngoài bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2

59

enzym ngoài bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2

60

Bảng 4.11 Mật ñộ và hoạt tính enzym ngoại bào của các chủng P1.1,

P5.1, P2.2, P3.2 khi nuôi cấy riêng lẻ và hỗn hợp trong chất

mang cám gạo khử trùng

62

Bảng 4.14 Kết quả phân tích vỏ quả cà phê ở các công thức thí nghiệm

sau 30 ngày

68

DANH MỤC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ

sản xuất compost

25

mô diện tích, sản lượng nông sản, chúng ta cũng tạo ra một nguồn phế liệu khổng

lồ Nhưng ñến nay chúng vẫn vẫn bị bỏ phí, phần lớn bị ñốt, phần còn lại trở thành rác thải, cả hai trường hợp ñều gây ô nhiễm môi trường ðiều ñáng nói ở ñây, khi ñốt, tất cả chất thải hữu cơ biến thành CO2, H2O, các ñộc chất SO2, SO3,

H2S, NO, NO2, HCl, chỉ ñể lại một ít khoáng chất trả lại cho ñất Chúng ta ñã

và ñang lãng phí nguồn cacbon bổ dưỡng cho ñất Còn khi chất hữu cơ này trở thành rác thải khó phân hủy, lại gây ô nhiễm môi trường cho ñất, nước và không khí ðây là môi trường thuận lợi cho VSV gây bệnh phát triển và sự phân hủy của chúng tạo ra nhiều mùi hôi thối ảnh hưởng ñến môi trường sống của con người [3]

Mặt khác, hơn 50 năm qua thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng sử dụng rộng rãi ñến mức lạm dụng phân bón hóa học Giờ ñây, dần dần người ñã thấy mặt trái của nó như phá hủy hệ sinh thái ñất Phân bón hóa học tồn dư trong ñất gây vô cơ hóa ñất và gây ô nhiễm ñất Người ta cũng tìm ra nhiều ñộc chất còn ñi vào chuỗi thực phẩm (rau quả, ngũ cốc, ) là nguyên nhân của các bệnh rối loạn tiêu hóa, nội tiết, thần kinh và cả ung thư Mặt khác, quá trình sản xuất phân bón cần một sự chi phí ñầu tư rất lớn ðể tiến ñến một nền nông nghiệp sinh thái bền vững ñòi hỏi con người phải tìm ra những giải pháp phù hợp với thiên nhiên, một trong những giải pháp ñó là sản xuất phân bón hữu cơ có nguồn gốc

từ các hợp chất tự nhiên

Trong quá trình chế biến nông sản, chế biến cà phê thải ra môi trường một lượng vỏ rất lớn Hiện nay ở Việt Nam, diện tích gieo trồng cà phê có xu hướng tăng và ñã ñạt ñến con số 616.000ha [2] Sản lượng cà phê trên thế giới cũng như của Việt Nam ñều tăng qua các năm Năm 2012 sản lượng cà phê của Việt Nam

ñạt 1.450.000 tấn/năm và năng suất cũng tăng lên, ñạt 2,36 tấn/ha [11] Cùng với việc gia tăng về sản lượng cà phê, ñồng thời cũng gia tăng về phế liệu vỏ cà phê Theo con số ước tính, vỏ cà phê thường chiếm khoảng 40 – 45% trọng lượng của quả cà phê Như vậy, số lượng vỏ cà phê bỏ ñi trong nước có thể lên ñến 652.500 tấn/năm, con số không nhỏ này ñòi hỏi phải có biện pháp xử lý thích hợp, ñảm bảo vệ sinh môi trường, ñem lại lợi ích cho cộng ñồng

Trên thế giới, người ta ñã biết ñây là một nguồn phế thải rất quan trọng ở các vùng nhiệt ñới Họ cũng ñã tiến hành nghiên cứu trên ñối tượng vỏ cà phê như coffein, lên men pha rắn, ủ xilo, nghiên cứu các hợp chất polyphenol và các hợp chất kháng sinh Mục tiêu của họ là xử lý nguồn phế thải ñể sản xuất thức ăn cho ñộng vật và nghiên cứu tách chất từ vỏ cà phê Ở trong nước, các nhà khoa học cũng bắt ñầu quan tâm ñến nguồn phế thải này nhưng cho ñến nay, vỏ cà phê vẫn chưa ñược xử lý hợp lý Phần lớn ñược ñổ bỏ hay phơi khô ñể ñốt Với cách làm này hàng năm, chúng ta bỏ phí một nguồn phế liệu khổng lồ và có nguy cơ gây ô nhiễm cho môi trường Vì thế, việc nghiên cứu xử lý nguồn phế liệu này là một việc làm cấp thiết hiện nay [11]

Xu thế hiện nay là phát triển nền nông nghiệp sạch, nền nông nghiệp hữu

cơ, nhu cầu về phân hữu cơ ñã thiếu lại càng thiếu vì nguồn phân hữu cơ từ chăn nuôi gia súc, gia cầm hạn chế Vì vậy, xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp trên ñồng ruộng bằng chế phẩm VSV là việc làm cần thiết, có ý nghĩa lớn ðiều này không chỉ tạo ra nguồn phân hữu cơ tại chỗ trả lại cho ñất, giải quyết sự thiếu hụt

về phân hữu cơ trong thâm canh hiện nay, giảm bớt chi phí phân bón, thuốc trừ sâu cho người nông dân, mà còn có ý nghĩa rất lớn trong việc tiêu diệt ổ bệnh trên ñồng ruộng, giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ ñồng ruộng

ðể có chế phẩm VSV tốt xử lý phế phụ phẩm ñồng ruộng thì việc phân lập, tuyển chọn chủng VSV có khả năng sản sinh ra enzym ngoại bào xenlulaza, proteaza, amylaza… ñể chuyển hóa các chất xơ sợi thành mùn hữu cơ là việc làm rất quan trọng cần thiết hiện nay Xuất phát từ thực tế trên, tôi tiến hành

thực hiện ñề tài “Nghiên cứu ứng dụng VSV xử lý phế thải vỏ quả cà phê làm phân hữu cơ”

– ðề xuất ñược quy trình ứng dụng chế phẩm vi sinh phân giải nhanh vỏ cà phê làm phân bón

Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHỐI LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN PHẾ PHỤ PHẨM TỪ SẢN XUẤT CÀ PHÊ

Chất thải của ngành công nghiệp sản xuất và chế biến cà phê gồm: nước thải, phế thải rắn

Nghiên cứu của Hajipakkos cho thấy, nước thải từ các nhà máy chế biến cà phê có hàm lượng BOD và COD rất cao (tương ứng 3.000 kg/ngày và 4.000 mg/l) Chất rắn lơ lửng 1.500 mg/l, gần gấp 3 lần hàm lượng cho phép, ngoài ra còn dầu mỡ với nồng ñộ cao gấp hai lần bình thường Sau nhiều lần thử nghiệm các phương pháp xử lý khác nhau, phương pháp xử lý yếm khí ñã ñược chọn ñể

xử lý nước thải cho ngành công nghiệp cà phê [21,25]

Thịt quả cà phê thu ñược trong quá trình chế biến cà phê chiếm khoảng 40% trọng lượng toàn bộ quả cà phê Vỏ cà phê có ñộ ẩm cao (80–85%), giàu hydratcacbon, protein, vitamin và các nguyên tố khoáng là nguyên liệu lý tưởng cho các quá trình lên men VSV Một số nông dân ñem trộn vỏ cà phê với phân chuồng ñể làm phân bón cho vụ sau nhưng không có qui trình ủ nên hiệu quả không cao Mặc dù vậy, vỏ cà phê chứa nhiều cafein và tanin có khả năng ức chế VSV, làm chậm quá trình phân hủy trong môi trường tự nhiên (chỉ phân hủy sau

2 năm) Chính vì vậy, ở những nơi không có biện pháp xử lý, phế phụ phẩm này

là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường và là nguồn mang sâu bệnh hại tích lũy cho vụ sau Hiện nay thịt quả cà phê có thể ñược xử lý chế biến ñể làm thức ăn chăn nuôi, hoặc tái chế làm phân bón trong các nông trường cà phê [25]

Việt Nam là nước xuất khẩu cà phê lớn thứ hai trên thế giới, sản lượng cà phê của Việt Nam trong những năm vừa qua dao ñộng xung quanh mức 1.450.000 tấn/năm, trong ñó 95% tổng sản lượng dành cho xuất khẩu, phế phụ phẩm của ngành cà phê chủ yếu là vỏ quả cà phê vào khoảng 652.000 tấn/năm ðây là nguồn hữu cơ dồi dào ñể sử dụng làm phân hữu cơ

Hình 2.1 Sản lượng và diện tích trồng cà phê ở Việt Nam

2.2.2 Ủ làm phân

Ủ phân (composting): Là quá trình phân hủy hợp chất hữu cơ tự nhiên (chủ yếu là ligno–xenlulo) bởi quần thể VSV (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, ñộng vật nguyên sinh ) dưới tác ñộng của ñộ ẩm, nhiệt ñộ, không khí tạo nên sản phẩm cuối cùng là chất mùn và chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể hấp thu ñược [51]

Từ xa xưa, con người ñã biết ủ lá cây, phân gia súc thành phân hữu cơ ñể bón cho cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao, ghi nhận tại Ai Cập từ 3.000 năm trước công nguyên như là một quá trình xử lý chất thải nông nghiệp ñầu tiên trên thế giới Người Trung Quốc ñã ủ chất thải cách ñây 4.000 năm, người Nhật

ñã sử dụng compost làm phân bón từ nhiều thế kỷ trước Nhưng việc sản xuất và

sử dụng phân ủ chỉ theo những kinh nghiệm dân gian, chưa có những nghiên cứu ñầy ñủ về phương pháp này

Hutchison và Richards (1921) là những người ñầu tiên nghiên cứu quá trình

ủ phân Tuy nhiên ñến năm 1943, quá trình ủ compost mới ñược nghiên cứu một cách khoa học và báo cáo bởi giáo sư người Anh – Howard thực hiện tại Ấn ðộ Howard ñã ñưa ra “phương pháp hữu cơ” tức là trộn xác hữu cơ với phân gia súc theo tỉ lệ 3:1 có ñảo trộn thường xuyên Ông ñã phát triển phương pháp ủ trên những loại nguyên liệu khác nhau theo từng lớp và có ñảo trộn ñể tạo ñiều kiện hiếu khí ðây là phương pháp mang tên nơi ông ñang làm việc

Từ năm 1926 ñến 1941, Warksman và các cộng tác viên nghiên cứu sự phân hủy hiếu khí bã thực vật, ñộng vật Ông ñã kết luận, nhiệt ñộ và VSV có ảnh hưởng ñến sự phân hủy chất thải hữu cơ

Ở Mỹ vào những năm 1940, Rodale ñã kết hợp các nghiên cứu của Howard với thực nghiệm của mình và ñã ñưa ra phương pháp hữu cơ trong trồng trọt, làm vườn Phương pháp này cũng ñã ñược rất nhiều nước trên thế giới áp dụng và thu ñược kết quả khả quan Khi áp dụng phương pháp này ở trang trại của mình, người dân Nhật, Trung Quốc, Ấn ðộ ñều nhận thấy rằng, ban ñầu năng suất có giảm ñi nhưng ñã ổn ñịnh qua vài năm và lợi nhuận tăng lên rõ rệt bởi giảm ñược chi phí ñáng kể khi không phải sử dụng hóa chất trong nông nghiệp

Golass và cộng sự (1950–1952) ñã nghiên cứu các nguyên tắc cơ bản của phân ủ hỗn hợp rác thải và bùn cống Kết quả cho thấy các tác nhân môi trường như: nhiệt ñộ, ñộ thoáng khí, kích thước cơ chất, tần số ñảo trộn, ñặc biệt là tỉ lệ C/N của nguyên liệu thô có liên quan ñến hiệu quả của việc ủ phân

ðến năm 1980, Haug ñã ñưa ra kết luận về việc làm phân ủ như sau: ủ chất thải là quá trình phân giải sinh học các chất hữu cơ dẫn tới sự ổn ñịnh khối ủ trong tồn trữ và sử dụng như một dạng phân hữu cơ

Nhìn về tổng thể, quá trình ủ là quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu

cơ xảy ra do nhóm VSV dị dưỡng như: vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và ñộng vật nguyên sinh, trong ñó vai trò của hệ sinh vật phân giải xenlulo và lignin là rất quan trọng

Nguyên liệu ñể ủ là hỗn hợp phế thải nông nghiệp, phân chuồng, lá cây Mỗi ñống sâu 1m, rộng 1,5–2m, mỗi lớp nguyên liệu dày 15cm, thêm vào 4,5kg phân, 3,5kg nước tiểu và 4,5kg phân ñã ủ ñược 15 ngày ðống ủ phải ñược tưới nước ñủ ẩm và ñược ñảo trộn 3 lần trong suốt thời gian ủ Lần thứ nhất sau 15 ngày ủ, lần thứ hai cách lần ñầu 15 ngày, lần thứ ba cách 1 tháng

Trên nguyên lý của phương pháp Indore, phương pháp ủ ñống ra ñời (heap method) Mỗi ñống ủ theo phương pháp này có kích thước 1,5m chiều cao, 2m chiều rộng hoặc hơn Trong ñống ủ, mỗi lớp phế thải có nguồn gốc cacbon (lá,

cỏ, rơm, rạ, cành cây, lá cây ngô, cây bông) dày 20cm, 10cm nguyên liệu giàu nitơ (phân chuồng, bùn, than bùn)

Phương pháp Banglore

Phương pháp này chia làm hai giai ñoạn:

(1) Giai ñoạn ủ hiếu khí: khoảng 8–10 ngày ñể nhiệt ñộ tăng cao nhằm tiêu diệt các VSV gây bệnh và cỏ dại

(2) Giai ñoạn ủ yếm khí: sau thời gian ủ hiếu khí, dùng bùn ñắp chẹn bên ngoài ñống ủ ñể không khí không lọt vào ñược Trong giai ñoạn này, hoạt ñộng của VSV diễn ra trong ñiều kiện yếm khí

Phương pháp này ñòi hỏi thời gian dài ñể hoàn thành ñống ủ, thường từ 6–8 tháng Ưu ñiểm của phương pháp này là giữ ñược ñộ ẩm và không hao tổn nitơ

So với phương pháp Indore, phương pháp Banglore kém hiệu quả kinh tế hơn, ñiều này thể hiện thời gian ủ lâu hơn và mức ñộ phân hủy chậm hơn

Trên nền của hai phương pháp trên, Gaur ñã ñưa ra phương pháp phân ủ nhanh [24]

Phương pháp phân ủ nhanh

Thời gian ủ ảnh hưởng ñến hiệu quả quay vòng của các chất hữu cơ thông qua việc hình thành CO2 và sinh khối của VSV Thời gian ủ kéo dài từ 6–8 tháng

sẽ làm giảm tỉ lệ C/N, thường, tỉ lệ C/N khi kết thúc ủ là 20/1, nhưng với phương pháp phân ủ nhanh thì tỉ lệ C/N ñạt ñược là 15/1 hoặc 10/1

Trong phương pháp ủ nhanh, các nguyên liệu nghèo nitơ như rơm, rạ, lõi ngô, mùn cưa, cỏ khô ñược trộn thêm với các nguyên liệu giàu nitơ như phân chuồng, bèo hoa dâu, cây ñiền thanh, do ñó, chất lượng phân ñược cải thiện Hàm lượng nitơ, photpho và kali trung bình trong ñống ủ là: 0,5–1%N; 0,5% P2O5;

ñã làm tăng hàm lượng photpho trong phân hữu cơ, ñồng thời làm giảm giá thành công nghệ

Năm 1987, Gaur ñã ñưa các chủng nấm ưa ẩm vào các ñống ủ (rơm, lá khô) thì thấy hàm lượng cacbon hữu cơ giảm từ 48% xuống 25% trong tháng ñầu tiên

của quá trình ủ Aspergilus sp làm tỉ lệ C/N giảm từ 45% xuống 20,6%

Penicillium sp làm giảm xuống còn 19,6% [24]

Như vậy, trong phương pháp phân ủ nhanh, VSV ñã ñược quan tâm nghiên cứu nhiều hơn so với hai phương pháp trên Có thể khẳng ñịnh rằng việc có mặt các VSV phân giải xenlulo là một trong các yếu tố quan trọng ñể rút ngắn thời gian phân hủy các hợp chất hữu cơ và nâng cao chất lượng phân ủ

Hiện nay ở các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam ñều áp dụng phương pháp phân ủ nhanh ñể rút ngắn thời gian ủ, nâng cao chất lượng phân ủ, nhanh chóng cung cấp phân bón cho cây trồng Một loạt phương pháp và cách kết hợp giữa chúng ñã ñược sử dụng trong quá trình ủ phân compost, ví dụ như: băm nhỏ và thường xuyên quay vòng; sử dụng các chất hoạt hóa nitơ; sử dụng chế phẩm VSV hữu ích; sử dụng sâu (Philipine, Cuba, Ấn ðộ); sử dụng thông khí cưỡng bức

2.2.3 Ủ trực tiếp vào ñất, trên ruộng

Phế phụ phẩm sau thu hoạch ñược vùi trực tiếp vào ñất, sau ñó các VSV sẽ phân hủy chúng ñể cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng vụ sau, cải thiện các ñặc tính lý hóa, sinh học của ñất, nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất ñể sản xuất ổn ñịnh lâu dài ðây là việc làm không những trả lại cho ñất hầu hết các chất dinh dưỡng mà các cây trồng ñã lấy ñi từ ñất mà còn kiểm soát ñược sâu bệnh còn sót trên những phế thải này [17] Gangwar và cộng sự (1999) ñã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của rơm rạ ñến năng suất lúa mì tại cao nguyên Indo – Gangetic – Ấn ðộ từ năm 1998 –

2001 với 12 công thức thí nghiệm trên hai mức ñạm 120 và 150kg N/ha; 26kg P2O5 và 16kg K2O kết hợp với (1) không vùi rơm rạ; (2) ñốt rơm rạ tại chỗ; (3) vùi rơm rạ vào ñất với lượng 5 tấn/ha Kết quả sau 3 năm nghiên cứu cho thấy: năng suất lúa mì tại vụ thứ nhất ở mức ñạm 120kg N/ha; ở công thức (1) là 4,07 tấn/ha; ở công thức (2) là 4,20; công thức (3) là 4,59 tấn/ha Ở mức ñạm 150kg N/ha, năng suất lúa mì ở công thức (1) là 4,14 tấn/ha; ở công thức (2) là 4,33 tấn/ha; ở công thức (3) là 4,88 tấn/ha [23]

ðề tài KN 01–10–08, “Sử dụng hợp lý sản phẩm phụ nông nghiệp nhằm

tăng năng suất cây trồng và ổn ñịnh ñộ phì nhiêu của ñất bạc màu” do ðỗ Thị

Xô, Nguyễn Văn ðại thực hiện ñã chứng minh: Vùi phế phụ phẩm nông nghiệp nông nghiệp ñã làm tăng năng suất cây trồng từ 4–21% so với ñối chứng Các công thức vùi phế phụ phẩm cả 3 vụ cho năng suất cao hơn các công thức ñược vùi phế phụ phẩm một vụ; vùi phế phụ phẩm có thể tiết kiệm ñược phân khoáng Việc vùi rơm rạ vào ñất mặc dù tác dụng lên năng suất lúa vụ kế tiếp là không lớn so với việc lấy rơm rạ ra khỏi ñồng ruộng nhưng về lâu dài thì ảnh

hưởng này là thấy rõ Nếu kết hợp song song việc bón phân hàng vụ cho lúa cùng với việc vùi rơm rạ vào ñất sẽ bảo toàn ñược dinh dưỡng N, P, K và S cho lúa, nhiều khi còn làm tăng dự trữ dinh dưỡng cho ñồng ruộng Việc vùi rơm rạ vào ñất ướt sẽ gây ra tình trạng cố ñịnh tạm thời của ñạm (N) và làm tăng lượng metan (CH4) phóng thích trong ñất, gây ra tình trạng tích lũy khí nhà kính Khi vùi một lượng lớn rơm rạ tươi sẽ rất tốn lao ñộng và cần có những máy móc thích hợp cho việc làm ñất cũng như có thể gây ra những vấn ñề về bệnh cây Việc trồng trọt chỉ nên bắt ñầu sau 2 ñến 3 tuần vùi rơm rạ

Tiến hành cày khô, nông 5–10cm ñể vùi rơm rạ và tăng cường sự thoáng khí cho ñất trong thời kỳ bỏ hóa có tác dụng tốt ñến ñộ phì ñất trong hệ thống thâm canh lúa – lúa Việc cày khô, nông nên tiến hành sau 2–3 tuần sau khi thu hoạch ở những cánh ñồng mà thời kỳ bỏ hóa khô – ướt giữa hai vụ lúa tối thiểu là

30 ngày Các lợi ích gồm có: (1) Số lượng cacbon (C) quay vòng hoàn toàn sẽ ñạt ñược nhiều hơn nhờ vào sự phân giải hiếu khí (khoảng 50% C trong vòng 30–40 ngày), do ñó hạn chế ñến mức tối thiểu ảnh hưởng xấu của các sản phẩm phân giải yếm khí tổng giai ñoạn sinh trưởng ñầu của cây lúa; (2) tăng cường sự thoáng khí cho ñất, nghĩa là oxy hóa Fe2+ và những chất khử khác tích lũy trong suốt quá trình ngập nước; (3) tăng cường ñược sự khoáng hóa N và sự giải phóng

P cho cây trồng sau, cho ñến giai ñoạn phân hóa ñòng; (4) làm giảm ñược sự phát sinh cỏ dại trong suốt thời kỳ bỏ hóa; (5) làm cho quá trình làm ñất ñược dễ dàng hơn (thường không cần cày ñất lần hai); (6) sự phóng thích CH4 sẽ ít hơn so với việc vùi rơm rạ lúc làm ñất ngay trước khi gieo trồng [23]

Bên cạnh những lợi ích trên thì việc vùi rơm rạ vào ñất có một số nhược ñiểm như: tốn thêm chi phí, có thể gây ra một số bệnh cho lúa, có thể làm chậm

sự sinh trưởng và làm giảm năng suất lúa

2.2.4 Tái sử dụng tạo ra các sản phẩm hữu ích khác

Ngoài các biện pháp trên, còn có rất nhiều biện pháp khác tái sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp ñể tạo ra các sản phẩm hữu ích khác: dùng làm thức ăn gia súc [10], sản suất etanol từ rơm rạ [59], sản xuất giấy từ rơm rạ [60]

2.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI PHẾ THẢI

Tế bào VSV chứa nhiều loại enzym khác nhau, enzym có thể ñược sản xuất

từ ñộng vật và thực vật như amylaza từ hạt ñại mạch nảy mầm, dứa hoặc từ dạ dày, tụy tạng Nhưng quá trình sản xuất này còn gặp nhiều khó khăn và giá thành rất cao Cách ñây 30 năm, người ta tìm thấy nguồn enzym mới vô cùng phong phú, ñó là enzym VSV

Tế bào VSV có khả năng tạo ra cho mình một tập hợp enzym xúc tác các phản ứng sinh học xảy ra trong và ngoài tế bào nhằm thỏa mãn các ñặc ñiểm sinh hóa, nhu cầu sinh lý của tế bào Tế bào sản xuất ra hai loại enzym: enzym nội bào và enzym ngoại bào [37]

(1) Enzym nội bào có tác dụng hoạt hóa các enzym ở dạng chưa hoạt ñộng thành các enzym hoạt ñộng, phân giải các hợp chất bị sai hỏng trong tế bào như một phân tử protein bị tổng hợp sai cần phải ñược phân hủy, ñồng thời có khả năng ñồng hóa, sử dụng những cái cũ ñể tổng hợp nên cái mới

(2) Enzym ngoại bào là enzym sau khi ñã tổng hợp thì ñược tiết ra bên ngoài qua màng tế bào, chủ yếu thuộc họ hydrolaza Khi lên men trên một môi trường xác ñịnh, enzym ngoại bào ñược tiết ra mạnh mẽ khi quá trình sinh trưởng giảm xuống

2.3.2 Cơ sở khoa học của quá trình phân hủy

Vỏ cà phê chiếm trọng lượng khoảng 40 - 50% trọng lượng quả cà phê Thành phần chính của vỏ cà phê là xenluloza, protein, tinh bột và pectine

2.3.2.1 Phân giải xenluloza

 Khái quát về xenluloza

Hàng năm, có khoảng 30 tỷ tấn chất hữu cơ ñược cây xanh tổng hợp trên trái ñất, 30% trong số ñó là xenlulo Xenlulo chiếm 90% trong cây bông, 40 – 50% trong gỗ Xenlulo là thành phần chính của tế bào thực vật, kết hợp với hemixenlulo

và lignin tạo nên ñộ cứng cho thành tế bào Xenlulo là polysaccarit mạch thẳng gồm 1.400 ñến 12.000 gốc β– D glucopyranoza liên kết với nhau bằng liên kết β –

nhóm hydroxyl (–OH) ñều nằm trên ñường thẳng xích ñạo [8] Nhờ phân tích Rơnghen, người ta ñã biết rằng xenlulo có cấu tạo sợi Các sợi liên kết với nhau bằng các liên kết hydro và các liên kết Vanñervan tạo thành các bó nhỏ gọi là micro fibrin có cấu trúc không ñồng nhất và tạo nên cấu trúc mixen của xenluloza Các sợi micro fibrin có chiều rộng từ 100–300A0 và có chiều dài 40–100A0(Conovalov– 1972)

Cấu trúc mixen của xenluloza bao gồm hai vùng chính:

- vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao, cấu trúc sợi ñậm ñặc và chặt chẽ như tinh thể và chiếm khoảng ¾ cấu trúc xenluloza Do có mạng lưới liên kết hydrogen dày ñặc ngăn cản sự hấp thụ nước và trương lên nên vùng kết tinh rất khó bị tác dụng ngay cả với enzym xenlulaza (enzym xenlulaza chỉ có thể tác dụng lên bề mặt các sợi) Vùng vô ñịnh hình có cấu trúc kém chặt chẽ hơn vùng kết tinh nên dễ bị tác ñộng hơn Vùng này có thể hấp thụ nước và trương lên tạo ñiều kiện thuận lợi giúp cho enzym xenlulaza tấn công dễ dàng

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử xenluloza

Trong tự nhiên, xenluloza là một trong những hợp chất khá bền vững, chúng không tan trong nước mà chỉ bị trương lên do hấp thụ nước (phần vô ñịnh hình) Xenluloza bị thủy phân khi ñun nóng với axit hoặc kiềm ở nồng ñộ cao, bị thủy phân ở nhiệt ñộ 40 – 500C bởi enzym xenlulaza [16]

 Xenlulaza

Enzym xenlulaza do hoạt ñộng sống của VSV tiết ra ñể phân hủy chuyển hóa xenluloza ðây là phức hệ enzym thủy phân xenluloza tạo ra các ñường ñủ nhỏ ñể ñi qua vách tế bào VSV Ở một số VSV, enzym oxy hóa khử và enzym phân giải protein cũng tham gia vào quá trình trên Phức hệ xenlulaza bao gồm 3 enzym chủ yếu sau [16, 37]:

- Endoglucanaza hay CMC–aza (endo–1,4,–β–D–glucan–glucanohydrolaza) tấn công chuỗi xenluloza một cách tùy tiện và phân hủy liên kết β–1,4–glucozit giải phóng xenlobioza và glucoza, thủy phân CMC hoặc xenluloza phồng theo kiểu tùy tiện, làm giảm nhanh chiều dài chuỗi và tăng chậm các nhóm khử, emzym này cũng tác dụng lên xenlodextrin Ở vùng vô ñịnh hình enzym này hoạt ñộng mạnh nhưng lại yếu ở vùng kết tinh và không phân giải ñược xenlobioza

- Exoglucanaza hay xenlobiohydrolaza (exo–1,4–D–glucaza–4–xenlobiohydrolaza) giải phóng xenlobioza hoặc glucoza từ ñầu không khử của xenluloza, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng rất mạnh lên xenluloza vô ñịnh hình hoặc xenluloza ñã bị phân giải một phần Tác dụng lên xenluloza kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanaza thì có tác dụng hiệp ñồng rõ rệt

- β–glucozidaza hay xenlobiaza thủy phân xenlobioza và các xenlodextrin khác hòa tan trong nước cho glucoza, nó có hoạt tính cực ñại trên xenlobioza, còn ở xenlodextrin thì hoạt tính giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên Tùy theo

vị trí mà β–glucozidaza ñược coi là nội bào, ngoại bào hoặc liên kết màng tế bào Chức năng của β–glucozidaza có lẽ là ñiều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của xenlulaza Mỗi enzym thành phần lại có thể gồm một hay vài izozim khác nhau về trọng lượng phân tử, ñiểm ñẳng ñiện và hàm lượng polisaccarit liên kết Người ta cho rằng tính ña hình của xenluloza là nhằm phù hợp với cấu trúc phức tạp của mạch phân tử xenluloza, gồm nhiều vùng có ñặc tính thủy phân

khác nhau Tùy thuộc vào loài VSV và ñiều kiện nuôi cấy, tỉ lệ các enzym thành phần trong phức hệ xenlulaza và hiệu lực phân giải xenluloza của xenlulaza là khác nhau Nhưng ñể phân giải hoàn toàn xenluloza tự nhiên cần có sự tác dụng hiệp ñồng của cả 3 thành phần trong phức hệ xenlulaza [16]

 Cơ chế tác dụng

Các thành phần riêng rẽ trong phức hệ xenlulaza không có khả năng thủy phân xenluloza kết tinh mà phải có sự hiệp ñồng của cả 3 thành phần Cơ chế tác dụng của các enzym này như sau [16, 33]:

Trong ñó:

C1 – tương ứng với exoglucanaza; Cx – tương ứng với endoglucanaza

Hình 2.3 Cơ chế phân hủy xenluloza của Reese

Theo Reese, C1 là "tiền nhân tố thủy phân" hay là enzym không ñặc hiệu,

nó làm trương xenluloza tự nhiên biến thành các chuỗi xenluloza hoạt ñộng có

cùng thành glucoza Tác giả cho rằng VSV phát triển trên xenluloza hòa tan: Cacboxymetyl xenluloza (CMC), cacboxyetyl xenluloza (CEC) chỉ tạo ra Cx, trong khi ñó VSV phát triển trên xenluloza có trật tự cao thì có cả C1 và Cx.Khi hoạt ñộng trên xenluloza, C1 làm biến ñổi xenluloza nhưng khi tách riêng thì tác dụng này không còn biểu hiện nữa Trên thực tế C1 có khả năng hạn chế việc sản sinh ñường khử từ CMC và không có khả năng tấn công các xenluloza có trật tự [48]

Tiếp ñó, nghiên cứu của Erikkson và cộng sự cho ta hiểu rõ hơn về quá trình thủy phân xenluloza của phức hệ xenlulaza Các vùng vô ñịnh hình trên bề mặt xenluloza bị endoglucana cắt các liên kết β–1,4–glucozit tạo ra các ñầu mạch

tự do và exoglucanaza tấn công cắt thành từng ñoạn hai ñơn vị glucoza (xenlobioza) từ các ñầu mạch tự do ñó Kết quả tác ñộng của endo và exoglucanaza là làm xuất hiện các xenlo–oligosaccarit mạch ngắn, xenlobioza và

Xenluloza

tự nhiên

Xenluloza hoạt ñộng

ðường hòa tan

glucoza Từ ñây enzym β–glucozidaza mới bắt ñầu hoạt ñộng, chúng thủy phân tiếp các mạch xenlo–oligosaccarit và xenlobioza thành glucoza Như vậy, cơ chế này nêu rõ ñược vai trò của từng loại enzym thành phần và giải thích ñược tác ñộng hợp ñồng giữa chúng trong quá trình thủy phân xenluloza [19]

Tuy nhiên, Klyosov và các cộng sự lại cho rằng quá trình chuyển hóa xenluloza có thể xảy ra do nhiều phức hệ enzym xenlulaza, các enzym xenlulaza thành phần hoạt ñộng ở vùng nào của xenluloza, ở giai ñoạn nào của quá trình là tùy thuộc vào cấu trúc phân tử của cơ chất, mức ñộ polyme hóa, ñiều kiện thủy phân, thành phần phức hợp xenlulaza và các yếu tố khác Theo tác giả, quá trình thủy phân xenluloza diễn ra theo sơ ñồ hình 2.4

E 1 – Endoglucanaza E 3 – Xenlobiaza

Hình 2.4 Cơ chế phân hủy xenluloza của Klyosov

hợp còn có cả E1 hay E2 có khi cả hai enzym này cùng xúc tác với E4; con ñường (5) ngoài E1 còn có E2 cùng xúc tác [36]

 VSV phân hủy xenluloza [53]

Việc tích lũy trong môi trường ngày càng nhiều các chất ô nhiễm, ñòi hỏi phải tăng cường quá trình phân giải chuyển hóa các chất ô nhiễm này nhờ VSV, ñặc biệt là các hợp chất khó phân hủy như: xenluloza, hemixenluloza, lignin Trong tự nhiên, khu hệ VSV phân giải xenluloza rất phong phú và ña dạng bao gồm cả vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm và cả các nguyên sinh ñộng vật Tuy nhiên,

E1

(5)

E1Xenluoza

ban ñầu (1) oligosaccariXenlo (2) Xenlobioza (3)

E4(4)

Glucoza

nếu chỉ sử dụng các VSV tự nhiên có sẵn trong ñất, trong phế thải thì quá trình phân hủy thường diễn ra chậm ðể thúc ñẩy nhanh các quá trình lên men phân giải các chất hữu cơ, người ta thường bổ sung thêm các VSV có hoạt tính phân giải xenluloza cao

Xenlulaza là một phức hệ enzym rất phức tạp, các VSV thường không có khả năng tạo ñược tỉ lệ giữa các hợp phần một cách tương ñối Có loài tạo ñược nhiều enzym này, có loài tạo ñược nhiều enzym khác, ví dụ vi khuẩn thường không có khả năng tổng hợp exoglucanaza, trong khi ña số các loài nấm lại có

khả năng này Giống nấm Trichoderma có khả năng tổng hợp mạnh các enzym endoglucanaza và exoglucanaza, giống Aspergillus niger lại tổng hợp mạnh

xenlulobiaza, chúng thường kết hợp với nhau trong mối quan hệ sinh hỗ

Nấm: Có rất nhiều loài nấm phân giải xenluloza mạnh, trong ñó nấm sợi là

nhóm có khả năng tiết ra môi trường một lượng lớn enzym với ñầy ñủ các thành phần nên có khả năng phân giải mạnh xenluloza Nấm có hoạt tính phân giải

xenluloza ñáng chú ý là Trichoderma bao gồm hầu hết các loại sống hoại sinh trong ñất, những ñại diện tiêu biểu là Trichoderma reesei, Trichoderma virvide,

chúng phân hủy tàn dư thực vật trong ñất góp phần chuyển hóa lượng hữu cơ khổng lồ Một loài nấm khác cũng có hoạt tính phân giải xenluloza khá cao là

Aspergillus niger, A.oryzae, Fusarium solani, Penicillium pinophinum và Sclerotium rolfsii

pH trong khoảng 3,5–6,6 Các loài nấm ưa nhiệt sinh trưởng và phân giải nhanh xenluloza nhưng có hoạt tính xenlulaza trong dịch nuôi cấy lại thấp

Mỗi loài nấm khác nhau thì khả năng phân giải xenluloza mạnh, yếu khác nhau Theo như nghiên cứu của Mandels và cộng sự, nhận thấy có ảnh hưởng của

nguồn cacbon ñối với nấm T.virvide Nguồn cacbon thích hợp cho tổng hợp xenlulaza ở Aspergillus fumigatus ưa ấm và ưa nhiệt là giấy lọc hay rơm nghiền

ở A tereus là giấy lọc, còn ở T.virvide là hỗn hợp cám và củ cải ñường Bổ sung

các chất dễ ñồng hóa như glucoza, xenlobioza vào môi trường nuôi cấy có thể làm cho pH của môi trường giảm nhanh chóng và do ñó hoạt tính xenlulaza của

các chủng nấm Trichoderma giảm [41,53]

Vi khuẩn: Năm 1785, lần ñầu tiên Popov ñã phát hiện ra rằng các vi khuẩn

yếm khí tham gia vào quá trình lên men xenluloza Thế kỷ thứ XIX, các nhà khoa học ñã phân lập ñược một số VSV yếm khí có khả năng phân giải xenluloza từ phân và dạ cỏ của ñộng vật nhai lại Năm 1902, Omelianski ñã thuần khiết và mô

tả giống vi khuẩn phân giải xenluloza và nêu lên hai kiểu lên men xenluloza: lên

men hydro do loài Bacillus cellulosac hydrogenicus và lên men metan Bacillus

cellulosac methanicus Chúng ñều là những vi khuẩn ưa ấm với nhiệt ñộ sinh

khí, người ta phân lập ñược các vi khuẩn hiếu khí ưa ấm, ưa nhiệt có khả năng phân giải xenluloza Bên cạnh ñó, khả năng phân giải xenluloza và hemixenluloza của các nhóm vi khuẩn tăng lên trong môi trường có ñộ ẩm cao

So với nấm sợi thì khả năng phân giải xenluloza của vi khuẩn không cao bằng do lượng enzym tiết ra môi trường ít hơn và số enzym cũng không ñầy ñủ Do vậy,

ñể phân giải xenluloza tự nhiên, các loài vi khuẩn khác nhau phải phối hợp với nhau ñể cùng phân giải trong mỗi quan hệ sinh hỗ

Các vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân giải xenluloza khá mạnh như:

Bacillus, Cellulomonas, Vibrio, Archomobacter Niêm vi khuẩn cũng có khả

năng này, ñáng chú ý là: Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium

Các vi khuẩn yếm khí thuộc các chủng ưa ấm và ưa nhiệt thuộc giống

Bacillus và Clostridium có khả năng phân giải xenluloza Chúng phát triển trên

môi trường ñường ñơn Người ta gọi quá trình phân giải xenluloza yếm khí là quá trình lên men xenluloza ðiển hình là khu hệ VSV trong dạ cỏ của ñộng vật nhai lại, ở ñây tồn tại các loại VSV có khả năng phân giải xenluloza là

Ruminococcus flavefaciens, R albus, Butivibrio fibiosolvens, Bacterroides succinogenes [53]

Xạ khuẩn: Bên cạnh nấm và vi khuẩn, xạ khuẩn cũng có khả năng phân

giải xenluloza khá cao, ñáng chú ý là Streptomyces, Actinomysces, Nocardia,

Micromonospora Xạ khuẩn phân giải xeluloza ñược phân lập từ các mẫu ñất,

mùn rác, mẫu bùn, những nơi có chứa xenluloza Người ta thường sử dụng xạ

khuẩn ñặc biệt là Streptomyces trong việc phân hủy rác sinh hoạt Những xạ

khuẩn này thường thuộc nhóm ưa nhiệt, sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt ñộ 45–

50oC, rất thích hợp với quá trình ủ rác thải [53]

2.4.2.2 Phân giải tinh bột

 Khái quát về tinh bột

Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật, trong tế bào thực vật, tinh bột tồn tại dưới dạng các hạt tinh bột Hạt tinh bột có kích thước hình dạng thay ñổi tùy loại thực vật Thường kích thước biến ñổi từ 0,02–0,12mm Lượng tinh bột ở hạt ngô và lúa mì khoảng 60–75%, trong hạt lúa 75–80% Tinh bột cũng có nhiều

ở các loại củ như: khoai tây, sắn, củ mài Một lượng tinh bột ñáng kể cũng thấy ở các loại quả như chuối và nhiều loại rau xanh

Tinh bột có vai trò dinh dưỡng lớn vì trong quá trình tiêu hóa, chúng bị thủy phân thành ñường glucoza là chất tạo nên nguồn calo chính của thực phẩm cho con người

Tinh bột gồm hai thành phần khác nhau: amilo và amilopectin

Amilo thường chiếm khoảng 15–27% trọng lượng tinh bột của thực vật Amilo là những chuỗi không phân nhánh ñược cấu tạo bằng các gốc D glucoza, liên kết với nhau bằng dây nối α–1,4 glucozit tạo nên chuỗi dài khoảng 200–1.000 gốc glucoza và phân tử amilo có một ñầu khử Amilo tan trong nước nóng tạo ra dung dịch có ñộ nhớt không cao

Trong phân tử amilopectin, các gốc glucoza ñược gắn với nhau không chỉ bằng liên kết α–1,4 glucozit mà còn bằng liên kết α–1,6 glucozit Vì vậy, phân tử amilopectin có cấu trúc nhánh, có một ñầu khử

tinh bột bị thủy phân dưới tác dụng của enzym amylaza hoặc axit tạo thành phân

tử có trọng lượng thấp hơn gọi là dextrin

 Amylaza và cơ chế thủy phân tinh bột

Quá trình phân giải tinh bột có sự tham gia của nhiều loại enzym khác nhau

và mỗi enzym có một phương thức tác dụng ñặc hiệu riêng Người ta biết ñến 4 loại enzym amylaza sau [37]:

(1) α–amylaza: ðây là enzym thủy phân tinh bột ñược hiểu biết kĩ nhất Nó

có trong nước bọt, dịch tiêu hóa, nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn α–amylaza tác ñộng ñồng thời lên nhiều dây nối (α–1–4) kể cả các dây nối bên trong ñại phân

tử (vì vậy còn gọi là enzym endoamylaza) α–amylaza làm dịch hóa một cách nhanh chóng tinh bột Sản phẩm quá trình phân giải này ngoài mantoza còn có các oligo chứa 3–4 gốc glucoza Nếu thời gian tác dụng dài trên amilo thì sản phẩm thủy phân của α–amylaza chứa khoảng 13% glucoza và 87% maltoza Với amilopectin khi bị thủy phân bởi α–amylaza, ngoài maltoza và oligosaccarit, trong sản phẩm còn có dextrin phân tử thấp và khoảng 5–10% glucoza

(2) β–amylaza: Khác với α–amylaza, men β–amylaza chỉ tác ñộng vào phần ngoài ñại phân tử (vì vậy enzym này còn có tên gọi là exoamylaza) Dưới tác ñộng của β–amylaza, tinh bột vẫn giữ khá lâu

(3) Amila 1–6glucozidaza: ðây là enzym tác ñộng vào các liên kết 1–6glucozit ở chỗ phân nhánh

(4) Glucoamylaza: Enzym này phân giải tinh bột ñể tạo thành các glucoza

và các α–oligosaccarit Một số thực nghiệm cho biết, ngoài việc phân cắt dây nối α–1–4, men glucoamylaza còn có thể cắt cả dây nối α–1–6 Glucoamylaza có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amilopectin, dextrin giới hạn, maltoza tới glucoza ðây là ưu thế tuyệt ñối của glucoamylaza so với các amylaza khác, vì vậy quá trình phân giải tinh bột của glucoamylaza còn ñược gọi

là quá trình ñường hóa

 VSV phân giải tinh bột

Nhiều nhóm VSV có khả năng thủy phân tinh bột như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm Trong số các loài VSV thì nấm mốc là nhóm có khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất Các giống nấm mốc ñiển hình có khả năng phân giải tinh bột mạnh

ñó là: Aspergillus (Aspergillus acdidus, A.niger, A.oryzae ), Rhizopus (R.oryzae,

R delemar, R.niveus ), ñặc biệt A.oryzae có khả năng tiết ra ñược ñầy ñủ hệ

enzym cho quá trình phân giải tinh bột Xạ khuẩn cũng là một nhóm VSV có khả

năng sinh amylaza mạnh, trong ñó Streptomyces là nhóm giữ vị trí tiên phong sinh amylaza như S.limosus, S.aurefaciens, S.praecox Một số chủng nấm men

cũng có khả năng tổng hợp amylaza như Candida antaritica, Saccharomyces

cerevisiae, Streptomyces bovis

Trong các vi khuẩn thì vi khuẩn gram dương ñặc biệt là Bacilus thường tạo

ra nhiều α–amylaza hơn các vi khuẩn gram âm (Fogarty & Kelly, 1990) Ngoài α–amylaza ra, vi khuẩn còn tạo ra β–amylaza Ví dụ β–amylaza lần ñầu tiên

ñược phát hiện ở vi khuẩn B.polymyxa, khi thủy phân tinh bột có thể tạo ra 92–

94% maltoza Sau này, người ta tìm thấy β–amylaza ở một số vi khuẩn khác như

Acetobacter, B.megaterium, B.cereus

2.3.2.3 Phân giải protein

 Khái quát về protein

Protein là thành phần không thể thiếu ñược của tất cả các cơ thể sinh vật, nhưng lại có tính ñặc thù cao cho từng loài, từng cá thể của cùng một loài Protein rất ña dạng về cấu trúc và chức năng, là nền tảng về cấu trúc và chức năng cho cơ thể sống

Protein là các polime phân tử lớn chủ yếu bao gồm các L–axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit Liên kết peptit (–CO–NH–) ñược tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm cacboxil của một axit amin này với nhóm amin của một axit amin khác và loại ñi một phân tử nước Theo cách kết hợp này, các liên kết peptit nằm trên một mạch thẳng không phân nhánh, có ñầu N (có nhóm amin tự do) và ñầu C (có nhóm acbonxil tự do) Trình tự sắp xếp các gốc axit amin trong mạch polipeptit tạo nên cấu trúc bậc I của protein Tiếp theo là cấu trúc bậc II, III, IV với sự phức tạp dần trong tương tác không gian [56]

 Protein và cơ chế thủy phân protein

Enzym proteaza là nhóm enzym xúc tác quá trình phân giải protein theo cơ

Quá trình phân giải protein là một quá trình thủy phân tương ñối phức tạp

và có sự tham gia của nhiều enzym khác nhau Proteaza gồm hai loại chính: Endoproteaza và exoproteaza, cả hai loại này có thể lấy từ nhựa ñu ñủ, dạ dày, tụy tạng nhưng nhiều nhất vẫn là từ VSV [56]

 VSV phân hủy protein

Nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh proteaza như Bacillus subtilis,

Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus wenti, Mucor delemar và một

số loài thuộc chi Penicillium

Các proteaza có thể ở trong tế bào (proteaza nội bào) hoặc ñược tiết vào môi trường nuôi cấy (proteaza ngoại bào) Các proteaza ngoại bào phân giải protein và các chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các phân tử có trọng lượng phân tử thấp ñể VSV có thể dễ dàng hấp thụ Proeaza nội bào thường là các peptidaza và một số proteinaza Proteinaza phân hủy phân tử protein thành polipeptit, peptone Peptidaza chuyển các hợp chất này thành axit amin, nó có tác dụng lên cả ñầu cacbonxil và ñầu amin [56] ðặc biệt là cả hai loại endopeptidaza và exopeptidaza có thể ở dạng tự do trong tế bào chất hoặc liên kết với riboxom và chỉ tìm thấy ở môi trường xung quanh khi tế bào bị phá hủy Proteaza của ñộng vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại hoặc endoproteaza hoặc exoproteaza VSV có khả năng sinh ra cả hai loại enzym trên,

do ñó proteaza của VSV có tính ñặc hiệu khác thường, chúng có thể phân hủy tới 80% các liên kết peptit có trong phân tử protein Nó không những phá hủy hoàn toàn và nhanh chóng các liên kết peptit mà còn có khả năng phá hủy chậm một số liên kết không ñặc trưng khác Như vậy, trong từng trường hợp cụ thể của sự thủy phân protein, cần nghiên cứu chọn lọc loài VSV thích hợp và những ñiều kiện tối ưu cho hoạt ñộ proteaza của nó [8,56]

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình xử lý phế thải làm phân bón

Quá trình ủ phân compost là quá trình phân hủy sinh học các nguyên liệu hữu cơ, vì vậy có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng ñến như: bản chất của nguyên liệu

ủ, ñặc biệt là tỉ lệ C/N, nhiệt ñộ ñống ủ, ñộ ẩm, và VSV trong ñống ủ

Từ năm 1969, các kĩ thuật và phương pháp mới ra ñời ñã giúp các nhà khoa học nghiên cứu, ñiều khiển các nhân tố trong quá trình ủ phân ñể ñẩy nhanh và nâng cao chất lượng của quá trình ủ [18]

2.3.3.1 Yếu tố phi sinh học

a) ðộ ẩm

ðộ ẩm của ñống ủ là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng ñến số lượng, thành phần và hoạt ñộng của VSV, vì vậy ñộ ẩm ảnh hưởng ñến nhiệt ñộ và thời gian kết thúc quá trình ủ Trong quá trình ủ, VSV cần ñộ ẩm ñể phân hủy chuyển hóa các chất dinh dưỡng thành các chất mới, mặt khác khi hoạt ñộng, các VSV cũng tạo ra nước [18]

ðộ ẩm cao quá 65% sẽ ngăn cản dòng khí thổi vào ñống ủ do nguyên liệu quá ướt, các khe hổng sẽ bị lấp ñầy nước làm giảm diện tích tiếp xúc của phế thải với không khí, các VSV hiếu khí không phát triển ñược Nếu ñộ ẩm quá thấp dưới mức 40% sẽ không ñủ nước cho các hoạt ñộng trao ñổi chất của các VSV,

do ñó quá trình ủ sẽ chậm lại Nếu ñộ ẩm dưới mức 20% thì chỉ còn rất ít VSV hoạt ñộng ðộ ẩm thích hợp nhất cho quá trình ủ là 40–60% [18]

b) pH

ðộ pH của ñống ủ thông thường thay ñổi theo thời gian Hình 2.5 biễu diễn, giai ñoạn ñầu của quá trình sản xuất compost, ñộ pH thường bị giảm xuống, tuy nhiên chẳng bao lâu sau nó bắt ñầu tăng lên ñến pH cao như pH = 9 Sở dĩ ban ñầu pH giảm xuống là do những phản ứng tạo thành axit hữu cơ, những axit này

sẽ ñóng vai trò là cơ chất cho quần thể VSV kế tiếp

ðường biểu diễn ñộ pH sau ñó tăng lên tương ứng với việc VSV sử dụng những axit vừa sinh ra trong giai ñoạn trước

Việc khống chế pH trong ủ hiếu khí là không quan trọng lắm, nhưng nếu xảy ra quá trình yếm khí sẽ sinh ra nhiều axit hữu cơ do ñó làm giảm pH của ñống ủ ðể nâng pH cho cacbonat, vôi và các chất có tính kiềm khác vào trong ñống ủ có vai trò chất ñệm nhưng nếu bổ sung quá nhiều vào ñống ủ ñể pH chạm 9 sẽ gây ra hiện tượng thất thoát nitơ dưới dạng khí ammoniac bay lên do

ñó làm mất nguồn nitơ cho VSV, vì vậy mà quá trình phân hủy các chất sẽ chậm lại [31]

Hình 2.5 Sự biến ñổi của pH biểu diễn theo thời gian trong quá trình

sản xuất compost

c) ðộ thông khí

Không khí nhằm cung cấp oxy cho các VSV hiếu khí tiến hành quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ nhanh chóng, không gây mùi khó chịu là hai ñặc ñiểm nổi bật của quá trình ủ hiếu khí so với ủ yếm khí, ñồng thời làm giảm ñộ

ẩm ban ñầu cao trong ñống ủ, có tác dụng tản nhiệt trong ñống ủ [51]

Oxy ñược cung cấp thông qua hai con ñường chính ñó là qua sự khuếch tán của không khí và thổi khí cưỡng bức Lượng oxy cung cấp bởi khuếch tán không ñáng kể, chiếm 0,5 – 5% tổng lượng oxy nhu cầu, do vậy, thổi khí cưỡng bức là nguồn cung cấp khí chủ yếu của phương pháp ủ hiếu khí

d) Tỉ lệ C/N

ðể quá trình ủ thực sự hiệu quả thì VSV cần ñược cung cấp ñầy ñủ các chất dinh dưỡng thiết yếu với lượng ñầy ñủ và tỉ lệ thích hợp VSV ñòi hỏi lượng lớn các chất dinh dưỡng như: cacbon, nitơ, photpho và kali VSV dùng cacbon như một nguồn cung cấp năng lượng, ngoài ra VSV dùng cacbon và nitơ ñể tổng hợp nên protein, xây dựng tế bào và sinh sôi nảy nở Photpho và kali cũng rất cần thiết cho quá trình trao ñổi chất và sinh sản của tế bào Trong quá trình ủ, cacbon hoặc nitơ sẽ là nhân tố hạn chế quá trình phân hủy diễn ra nhanh [46, 50]

Tỉ lệ C/N là tỉ lệ giữa tổng lượng cacbon và tổng lượng nitơ có trong thành phần phế thải Nếu tỉ lệ C/N<30 thì quá trình ủ phân diễn ra nhanh Nếu tỷ C/N>50

sẽ ức chế sự sinh trưởng của các VSV, do ñó làm chậm quá trình phân giải Nếu tỉ

lệ C/N<30 nghĩa là nồng ñộ C thấp và nồng ñộ N cao thì giai ñoạn ñầu của quá trình ủ sự sinh trưởng của VSV và sự phân hủy sẽ diễn ra rất nhanh Vì vậy, lượng

oxy có thể dùng nhanh chóng hết và quá trình ủ chuyển sang giai ñoạn yếm khí, do

ñó nếu ñống ủ không ñược thông khí thì mùi hôi sản phẩm của quá trình yếm khí

sẽ xuất hiện Khi lượng nitơ quá nhiều thì nitơ sẽ bị mất dưới dạng khí N2 hoặc

quá trình ủ Ngoài ra, nếu tỉ lệ C/N quá thấp thì khi sản phẩm ñược bón vào ñất có thể gây hại cho cây trồng gây hiện tượng thiếu nitơ của cây [31]

Gotass nghiên cứu về qui trình ủ có mặt của VSV và ñưa ra kết luận: (1) Khi lượng cacbon trong phế thải có ít thì một lượng lớn các khí NxOy và

NH3 sẽ thoát ra ngoài không khí;

(2) Tỉ lệ C/N thích hợp cho VSV sử dụng thì nitơ mất ñi không ñáng kể; (3) Khi lượng nitơ có ít hơn lượng cacbon thì một số VSV sẽ chết và nitơ chứa trong tế bào của chúng sẽ tái sử dụng

hoặc bị hạn chế sinh trưởng phát triển, sự ña dạng của VSV giảm xuống, do ñó, dẫn ñến tốc ñộ của quá trình phân hủy sẽ chậm ñi [44]

Nấm và vi khuẩn sinh axit xuất hiện ở giai ñoạn nhiệt ñộ khoảng 25 –

300C ðây là những chủng ưa ấm và vai trò quan trọng của chúng là làm tăng nhiệt ñộ của ñống ủ tạo ñiều kiện cho VSV ưa nhiệt phát triển Ngoài ra, vi khuẩn ưa ấm phát triển mạnh trong thời gian ngắn ñã sinh ra enzym thủy phân phần lớn protein và hydratcacbon dễ phân hủy Khi nhiệt ñộ tăng tới 400C các vi khuẩn ưa ấm ñược thay thế bởi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt, vi khuẩn có

trọng trong việc phân hủy các hợp chất hữu cơ: vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng

phân hủy mạnh protein, lipit, hemixenluloza… và làm giảm ñáng kể hàm lượng nước trong ñống ủ, còn nấm ưa nhiệt có khả năng phân hủy mạnh xenluloza và hemixenlulo ðạt ñược nhiệt ñộ cao trong quá trình ủ phân có thể giết chết ñược VSV có hại trong ñống ủ, giảm lượng nước có nhiều trong nguyên liệu phế thải tươi, thúc ñẩy quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ nhanh Khi nhiệt ñộ ñống

ủ hạ xuống dưới 400C thì nấm và vi khuẩn ưa ấm lại xuất hiện trở lại và tiếp tục phân hủy các chất hữu cơ ñể hoàn thiện quá trình ủ [22]

2.3.3.2 Yếu tố sinh học

Quá trình ủ phân là kết quả nối tiếp của hoạt ñộng VSV trong ñó môi trường sống ñược tạo ra bởi một nhóm VSV này sẽ tạo ñiều kiện cho hoạt ñộng của một nhóm VSV kế tiếp Trong quá trình ủ phế phụ phẩm, không một VSV ñơn lẻ nào có thể phân hủy nhanh chóng và triệt ñể các chất hữu cơ bằng một quần thể VSV ña dạng và phong phú Vì vậy, các nhóm VSV khác nhau sẽ hoạt ñộng vào các thời ñiểm khác nhau trong ñống ủ [18,31,51]

Vi khuẩn luôn là hệ thống năng ñộng, chiếm ưu thế ở tầng ñáy và bề mặt ñống ủ, hoạt ñộng mạnh mẽ vào giai ñoạn trước và sau khi ủ, phân hủy dễ dàng các chất dễ thủy phân như: protein, hydratcacbon và ñường Xạ khuẩn và nấm ñóng vai trò quan trọng kế tiếp trong quá trình ủ khi mà ñống ủ trở nên khô hơn, bởi vì nấm có khả năng chịu ñựng ñược môi trường có ñộ ẩm thấp tốt hơn vi khuẩn Ngoài ra, một số chủng nấm có nhu cầu về nguồn dinh dưỡng nitơ rất thấp, do ñó, chúng có thể phân hủy xenluloza và các nguyên liệu khó phân hủy khác [31,53]

Trong ñiều kiện hiếu khí, các VSV có khả năng sử dụng oxy sẽ phân hủy các hợp chất hữu cơ, ñồng hóa một số cacbon, nitơ, photpho, sunphua và một số chất dinh dưỡng khác ñể tổng hợp lên sinh khối

Trong ñiều kiện thích hợp, VSV có thể phân hủy các hợp chất hữu cơ theo các phương trình sau:

(ñường, xenluloza, hemixenluloza) (CH2O)x + O → xCO2 + H2O + E

Photphat dạng hữu cơ (Phitin, lecitin) H3PO4→Ca(HPO4)2

Ngược lại, trong ñiều kiện yếm khí, ñầu tiên vi khuẩn sinh axit sẽ phân hủy chất hữu cơ thành các axit béo và các sản phẩm trung gian khác Sau ñó, nhóm vi khuẩn khác sẽ chuyển tiếp thành khí metan, ammoniac, cacbonic và hydro Oxy cũng cần cho quá trình ủ yếm khí nhưng ở các dạng chất hóa học Các VSV cũng

sử dụng nitơ, photpho và các chất dinh dưỡng khác ñể xây dựng cơ thể với lượng sinh khối ít hơn Trong quá trình ủ yếm khí, sự phân hủy các hợp chất hữu cơ là

gian như axit hữu cơ, ammoniac, sự ñồng hóa cacbon của VSV giảm, do vậy, sinh ra khí metan và H2S Trong quá trình ủ yếm khí, năng lượng sinh ra ít hơn so với ủ hiếu khí Các phản ứng sinh hóa diễn ra trong quá trình ủ yếm khí ñược tóm tắt bởi phương trình sau:

2H2S + CO2 + ánh sáng → (CH2O)x + S2 + H2O Các sinh vật có kích thước lớn khác nhau cũng ñóng vai trò quan trọng trong quá trình ủ Giun tròn, bọ, ve, bọ cánh cứng… làm giảm kích thước, khối lượng ñống ủ bằng cách di chuyển, sục sạo trong ñống ủ, tiêu thụ các nguyên liệu của quá trình ủ… Những hành ñộng ñó ñã giúp phân hủy các chất trong ñống ủ

và tạo diện tích bề mặt và vị trí tốt hơn cho các VSV phân hủy hoạt ñộng [18]

2.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG XỬ

LÝ PHẾ THẢI LÀM PHÂN BÓN

2.4.1 Nghiên cứu trên thế giới

Năm 1946, Hungate ñã phân lập ñược loài xạ khuẩn tên là Micromonospora

propionici có khả năng thủy phân xenluloza cao Sau ñó, năm 1966, Hungate và

Prévot tiếp tục phân lập ñược 9 chủng vi khuẩn yếm khí có hoạt tính xenlulaza

thuộc chi: Bactecroides, Butyrivibrio, Clostridium, Ruminococcus và

Cillobacterium [29]

Nối tiếp các nghiên cứu của Hungate và Shuval (1981), Veeken (2001), năm 2007, Hesham khi ñi nghiên cứu về khả năng xử lý rơm rạ của 3 chủng xạ

khuẩn thuộc chi: Micromonospora, Streptomyces và Nocardiodes ñã kết luận

rằng: việc bổ sung xạ khuẩn vào ñống ủ ñã giúp ñẩy nhanh quá trình phân hủy rơm rạ và làm giảm thể tích của ñống ủ; sau 3 tháng ở ñống ủ có bổ sung xạ khuẩn thể tích ñống ủ giảm xuống 38,6–64% so với ban ñầu, trong khi ñó ở các ñống ủ ñối chứng thể tích ñống ủ giảm xuống 13,6% so với ban ñầu; việc bổ sung xạ khuẩn vào ñống ủ còn làm tăng các chất hữu cơ lên 34,9% và hàm lượng nitơ lên 0,59 mg/g, trong khi ñó ở ñống ủ ñối chứng không bổ sung xạ khuẩn chất hữu cơ là 20% và hàm lượng nitơ chỉ ñạt 0,21 mg/g [26]

Veiga và cs (1983) ñã phân lập ñược 36 chủng xạ khuẩn từ bùn ở vịnh La Corufia (Tây Ban Nha), trong ñó có 19 chủng có khả năng tổng hợp xenlulaza và sinh trưởng tốt trong môi trường có chứa 3,5% NaCl [43]

Stutzemberger (1971) ñã nuôi cấy Thermonospara curyata trên môi trường

chứa xenluloza và cao nấm men có bổ sung 0,1% bông nghiền nhỏ thì thấy chúng

có khả năng tích lũy enzym phân hủy xenluloza [54]

Jeris và Regan (1973) thấy trong ñống ủ có các loài vi khuẩn phân giải

xenluloza sau: Achromobater, Clostridium, Cellulomonas, Cytophaga,

Cellvibrio, Bacillus, Preudomonas, Sorangium, Sporocytophara, và các loài

nấm phân giải xenluloza như: Alternaria, Aspergillus, Polyponus, Rhizoctonia,

Rhozopus, [32]

Lamot, Voets (1979) ñã dùng 7 chủng VSV phân giải xenluloza ñể phân

hủy xenlophan Aspergillus.sp, Penicillium.sp, 2 loài Chactamium, 1 loài

Sderotium roflssi, 2 loài xạ khuẩn Streptomyces Xenlophan là chất không tan

trong tất cả dung môi hữu cơ, chứa 10% nitroxenluloza và clorua polivinyliden, 90% xenlophan (trong ñó 70% là xenluloza) Tác giả nhận thấy: nếu ñể từng VSV tác dụng thì sự phân giải hầu như không diễn ra, còn khi hỗn hợp các chủng nói trên thì sự phân giải xenluloza mới diễn ra Khi dùng 7 chủng thì sau 100 ngày, 85% xenlopha bị phân hủy, sản phẩm cuối cùng dùng làm phân bón gồm có: 30% protein, 60% ñường hòa tan, 10% các gốc còn lại [38]

Tại New Delhi – Ấn ðộ, từ năm 1985 ñến 1987, Gaur và Bhardwaj ñã phân lập và tuyển chọn ñược rất nhiều chủng VSV có khả năng phân hủy xenluloza và

lignin Sau ñó, Gaur ñã sử dụng các chủng nấm Trichurus, Spiralis, Trichoderma

viride, Paecilomyces fusisporus, Aspergillus sp, ñể ñưa vào ñống ủ và kết quả

cho thấy: hàm lượng cacbon hữu cơ giảm từ 48% xuống 25% trong vòng một tháng ñầu tiên của quá trình ủ; và chỉ trong 8 ñến 10 tuần rơm rạ ñã phân hủy hoàn thành một loại phân hữu cơ có chất lượng tốt Trong phân này chứa khoảng 1,7% N, tỉ lệ C/N là 12:3 [24]

Ở Trung Quốc cũng có rất nhiều nghiên cứu về việc phân lập VSV và ứng dụng trong xử lý phế thải hữu cơ Năm 2005 Wen–Jing Lu và cs ñã phân lập ñược 5 chủng vi khuẩn ưa ấm phân giải xenluloza cao từ phế thải rau quả và thân

lá hoa thuộc giống Bacillus, Halobacillus, Aeromicroblum, Brevibacterium [57]

Khi ứng dụng các chủng VSV này ñể ủ phế phụ phẩm rau quả và thân lá hoa cho thấy: bổ sung 1% các chủng VSV vào ñống ủ ñã làm tăng quá trình phân hủy sinh học các nguyên liệu lên 23,64% so với ñống ủ không bổ sung thêm VSV, do

ñó, rút ngắn thời gian ủ và tăng chất lượng của phân ủ [28,40]

Ở Cuba, nghiên cứu thành công trong phạm vi thí nghiệm sử dụng một số

loài vi khuẩn có khả năng phân giải xenluloza thuộc giống Cellulomonas ñể chế

biến thành chế phẩm có sinh khối vi khuẩn giàu protein và giàu vitamin ((Osmanetal, (1972 - 1974))

Năm 1980, Teruo Higa – Trường ðại học Tổng hợp Ruykuya Okinawa – Nhật Bản ñã phân lập, tuyển chọn ra một hỗn hợp các VSV có ích thuộc nhóm yếm khí và hiếu khí gồm: vi khuẩn quang hợp, nấm men, vi khuẩn lactic, xạ khuẩn, nấm lên men và chế tạo ra một chế phẩm VSV hữu hiệu –EM EM ñã ñược chứng minh là có tác dụng tốt ở nhiều lĩnh vực của ñời sống và sản xuất như: trong trồng trọt, chăn nuôi, trong bảo vệ môi trường Khi sử dụng EM ñể xử

lý rác cho thấy làm giảm mùi hôi thối của quá trình phân hủy, rút ngắn thời gian

xử lý xuống còn 30 – 40 ngày và góp phần nâng cao chất lượng của phân ủ [27] Hiện nay, các nước trên thế giới rất quan tâm ñến việc xử lý ô nhiễm môi trường, ñồng thời có rất nhiều loại chế phẩm xenlulaza dùng trong xử lý phế thải

và sản xuất phân bón sinh học xuất hiện

Từ năm 2005, chính phủ Hồng Kông ñã thành lập dự án quản lý phế thải rắn giai ñoạn 2005–2014 với tiêu chí: dùng lại; tái sử dụng và tái chế; giảm thiểu

Ở Pháp, người ta sản xuất nước uống sạch từ nước bị ô nhiễm, trong ñó sử dụng khu hệ VSV trong nước thải ñể xử lý các chất hữu cơ

Ở Nga, có nhiều nhà máy xử lý rác, vừa thu hồi kim loại nhờ máy móc, vừa sản xuất ra phân bón hữu cơ thông qua các loại VSV phân giải các chất hữu cơ Một loại chế phẩm xenlulaza ở Nga là chế phẩm "Cellolignorin" ñược nuôi cấy

từ Trichoderma lignorum ñã sấy khô ñến ñộ ẩm 13%, chứa từ 1 ñến 50 ñơn vị

xenlulaza trên 1g Ngoài các enzym C1, Cx, còn có cả hemixenlulaza, pectinaza

và xylanaza

Chế phẩm "Biosin" của Mỹ ñược sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy bề

mặt Aspergillus oryzae chứa 26 enzym khác nhau trong ñó có xenlulaza,

amylaza, proteaza, pectinaza

Nhìn chung, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kĩ thuật thì các nước trên thế giới ñã phân lập tuyển chọn ñược rất nhiều giống VSV có khả năng phân hủy phế thải hữu cơ Các kết quả nghiên cứu ñều cho thấy rằng, việc bổ sung VSV vào ñống ủ phế thải hữu cơ ñã rút ngắn thời gian ủ, làm giảm thể tích và tăng hàm lượng dinh dưỡng của ñống ủ, do ñó, góp phần bảo vệ môi trường Sau ñây là một số kết quả nghiên cứu về việc sử dụng VSV trong xử lý phế thải hữu

cơ ở Việt Nam

2.4.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Việt Nam là một nước nông nghiệp với khoảng 80% dân số làm nghề nông,

do vậy, phế thải nông nghiệp rất lớn và thích hợp cho việc làm phân ủ Có nhiều phương pháp làm phân ủ có thể áp dụng, từ phương pháp ủ ñống tĩnh ñơn giản nhất ñến hệ thống lên men trong các thiết bị phức tạp Việt Nam có khí hậu nóng

ẩm nên các quá trình phân hủy phế thải xảy ra mạnh mẽ, vì thế việc xử lý phế thải làm phân ủ là biện pháp thích hợp Tuy nhiên, việc xử lý phế thải ở Việt Nam gặp một số khó khăn: vốn ñầu tư cho xử lý phế thải còn thiếu thốn; ñòi hỏi phải có các biện pháp kĩ thuật ñơn giản, dễ vận hành, dễ bảo quản và sửa chữa; ý thức người dân chưa cao

Hiện nay, có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công VSV trong việc xử

lý rác thải, phế thải hữu cơ Trong ựó, các ựề tài cấp Nhà nước KHCNỜ02Ờ04, cấp Bộ B99Ờ32Ờ46, B2001Ờ32Ờ09 và các nghiên cứu khác về xử lý phế thải hữu

cơ như: lá, bã mắa, vỏ thải cà phê, rác thải nông nghiệp thành phân bón hữu cơ sinh học ựã khẳng ựịnh VSV bổ sung vào các ựống ủ phế thải hữu cơ góp phần rút ngắn thời gian ủ và nâng cao chất lượng phân ủ

2.4.2.1 Xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp

Phạm Văn Ty và cộng sự ựã phân lập ựược hàng trăm chủng VSV có khả năng phân giải xenluloza, hemixenluloza, lignin Xây dựng ựược quy trình sản xuất chế phẩm VSV phân giải chất hữu cơ ựạt huy chương vàng Hội chợ triển lãm Kinh tế Kĩ thuật toàn quốc năm 1987 Kết quả thử nghiệm cho thấy chế phẩm ựã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 45Ờ60 ngày thay vì 6 tháng ựến 1 năm ủ trong ựiều kiện tự nhiên [12]

đề tài cấp Nhà nước KHCN 02Ờ04 (1998) ựã phân lập ựược 585 chủng xạ khuẩn, 327 chủng vi khuẩn và 58 chủng nấm sợi có khả năng phân giải CMC

Trong ựó tuyển chọn ựược một số chủng có hoạt lực cao gồm: Streptomyces

gougero, Streptomyces macrosporreus, Cellulomonas sp., Corynebacterium sp., Aspergillus japonicus, A Unilateralis Thrower Các chủng lựa chọn có khả năng

sinh tổng hợp xenlluaza hoạt lực cao, tổng hợp các enzym ngoại bào như: amylaza, proteaza, pectinaza [13]

Năm 2001, Lê Văn Nhương ựã phân lập tuyển chọn ựược 11 chủng nấm sợi, 7 chủng vi khuẩn, 6 chủng xạ khuẩn có hoạt lực cao xenllulaza cao đã xác ựịnh khi các VSV này ựược phối trộn với nhau theo một tỉ lệ thắch hợp sẽ cho hiệu suất phân giải cao nhất, ựã tạo ra ựược 3 bộ phối trộn các chủng VSV thắch ứng với phân giải lá mắa, rác nông thôn và vỏ cà phê Khi xử lý rác thải nông thôn bằng EMUNI, ựảm bảo ựộ ẩm 50Ờ60%, 7 ngày ựảo trộn một lần thì sẽ cho hiệu quả xử lý nhanh nhất [6]

Năm 2004, Nguyễn Xuân Thành và cộng sự ựã nghiên cứu xử lý rác thải hữu cơ và phế thải công nghiệp bằng VSV bón cho cây trồng Kết quả cho thấy:

xử lý phế thải bằng chế phẩm VSV hạn chế mùi hôi; rút ngắn thời gian ủ xuống