Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý phế thải vỏ quả cà phê làm phân hữu cơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI –––––––––– TRẦN ðỨC HUY NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ THẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ LÀM PHÂN HỮU CƠ LUẬN VĂN THẠC SĨ Hµ Néi – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI –––––––––– TRẦN ðỨC HUY NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ THẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ LÀM PHÂN HỮU CƠ CHUYÊN NGÀNH: Khoa học Môi trường Mà SỐ: 60440301 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. LÊ NHƯ KIỂU Hµ Néi – 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước ñây. Người hướng dẫn Tác giả luận văn TS. Lê Như Kiểu Trần ðức Huy Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập tại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ nhiệt tình của Ban chủ nhiệm Khoa Tài nguyên và Môi trường, các thầy cô giáo, gia ñình cùng bạn bè ñể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp. Nhân dịp này, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến tất cả những sự giúp ñỡ quý báu ñó. Lời ñầu tiên tôi trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Tài nguyên và Môi trường – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, các thầy cô giáo giảng dạy và hướng dẫn thực tập ñã tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian qua. Tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Như Kiểu, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn VSV, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa ñã giúp ñỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong thời gian thực tập vừa qua. Cuối cùng tôi muốn dành lời cảm ơn chân thành tới bố mẹ, gia ñình, các ñồng nghiệp và tập thể lớp MTAK20, những người ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2013 Tác giả luận văn Trần ðức Huy Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ viii Chương I MỞ ðẦU 1 1.1. ðẶT VẤN ðỀ 1 1.2. MỤC TIÊU 3 1.3. YÊU CẦU 3 Chương II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. KHỐI LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN PHẾ PHỤ PHẨM TỪ SẢN XUẤT CÀ PHÊ 4 2.2. BIỆN PHÁP XỬ LÝ PHẾ PHỤ PHẨM CÀ PHÊ 5 2.2.1. ðốt 5 2.2.2. Ủ làm phân 5 2.2.3. Ủ trực tiếp vào ñất, trên ruộng 9 2.2.4. Tái sử dụng tạo ra các sản phẩm hữu ích khác 10 2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI PHẾ THẢI VỎ CÀ PHÊ 11 2.3.1. Hệ thống enzym vi sinh vật 11 2.3.2. Cơ sở khoa học của quá trình phân hủy 11 2.3.2.1. Phân giải xenluloza 12 2.4.2.2. Phân giải tinh bột 18 2.3.2.3. Phân giải protein 20 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình xử lý phế thải làm phân bón 21 2.3.3.1. Yếu tố phi sinh học 22 2.3.3.2. Yếu tố sinh học 25 2.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ PHẾ THẢI LÀM PHÂN BÓN 26 2.4.1. Nghiên cứu trên thế giới 26 2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam 29 2.4.2.1. Xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp 30 2.4.2.2. Xử lý vỏ cà phê làm phân hữu cơ sinh học 33 Chương III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 35 3.1.1. Vật liệu 35 3.1.2. ðịa ñiểm nghiên cứu 35 3.1.3. Thời gian nghiên cứu 35 3.1.4. Môi trường nghiên cứu 35 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37 3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 37 3.3.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân giải xenlulo 37 3.3.2. Xác ñịnh các ñiều kiện lên men nhân sinh khối của các chủng VSV 38 3.3.2.1. Xác ñịnh thời gian nuôi cấy của các chủng vi sinh vật 38 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv 3.3.2.2. Xác ñịnh hình thái, kích thước khuẩn lạc của vi sinh vật 38 3.3.2.3. Lựa chọn môi trường thích hợp 39 3.3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ 39 3.3.2.5. Ảnh hưởng của pH 40 3.3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ 40 3.3.2.7. Xác ñịnh hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 41 3.3.3. Bảo quản giống 42 3.3.4. Phân loại VSV bằng phương pháp sinh học phân tử 43 3.3.5. Sản xuất chế phẩm vi sinh 43 3.3.5.1. Nguyên liệu chế tạo chất mang 43 3.3.5.2. Nghiên cứu tính ñối kháng giữa các chủng VSV 43 3.3.5.3. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật 44 3.3.6. Các phương pháp phân tích vi sinh vật, sinh vật 45 3.3.6.1. Kiểm tra mật ñộ tế bào vi khuẩn, xạ khuẩn 45 3.3.6.2. Kiểm tra vi sinh vật tạp 46 3.3.6.3. Kiểm tra mật ñộ Colifom 46 3.3.6.4. Kiểm tra mật ñộ Salmonella (TCVN 4829 – 2005) 46 3.3.6.5. Kiểm tra mật ñộ E.coli (TCVN 6846:2007) 47 3.3.6.6. Xác ñịnh trứng giun 47 3.3.7. Phân tích các chỉ tiêu lý tính, hóa tính của các mẫu cà phê sau ủ 47 3.3.7.1. Các chỉ tiêu lý tính 47 3.3.7.2 Các chi tiêu hóa tính 48 3.3.8. Nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật 48 3.3.8.1. Thí nghiệm nhà lưới 48 3.3.8.2. Phương pháp Plant test (Subrao – Indian, 1980) 49 3.3.9. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 49 Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT PHÂN GIẢI XENLULO 50 4.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải xenlulo 50 4.1.2. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo mạnh 51 4.2. PHÂN LOẠI VÀ ðỊNH TÊN VI SINH VẬT 52 4.2.1. ðặc ñiểm hình thái, kích thước 52 4.2.2. ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của các chủng VSV tuyển chọn 53 4.2.2. Giải trình tự ADNr16S và phân loại vi sinh vật 54 4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ðIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ðẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ SINH ENZYM NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT LỰA CHỌN 56 4.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau 56 4.3.2. Ảnh hưởng của pH và nhiệt ñộ 58 4.3.3. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất 60 4.4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT 61 4.4.1. Nghiên cứu tính ñối kháng giữa các chủng VSV ñã tuyển chọn 61 4.4.2. Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật trong ñiều kiện chất mang dạng bột 62 4.4.3. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật 64 4.4.4. ðánh giá chất lượng của chế phẩm vi sinh vật sau khi sản xuất và trong thời gian bảo quản 65 4.5. XỬ LÝ VỎ CÀ PHÊ BẰNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT 67 4.5.1. Thành phần chủ yếu trong vỏ cà phê 67 4.5.2. Thiết kế thí nghiệm nhà lưới 68 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 4.5.3. Kết quả xử lý vỏ quả cà phê bằng chế phẩm vi sinh vật 69 4.5.3.1. Diễn biến nhiệt ñộ trong ñống ủ 71 4.5.3.2. Chất lượng ñống ủ sau xử lý 72 4.5.4. Kiểm tra vi sinh vật gây bệnh trong ñống ủ 75 Chương V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 83 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết ñầy ñủ ADNr Axit deoxyribonucleic riboxom ARNr Axit ribonucleic riboxom CFU Colony forming unit (ðơn vị hình thành khuẩn lạc) CMC Cacboxyl methyl cellulose CTðC Công thức ñối chứng CTTN Công thức thí nghiệm EDTA Ethylene diamine tetra acetic ISP International Streptomyces Preject (Chương trình xạ khuẩn quốc tế) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam VSV Vi sinh vật Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 4.1. Các chủng VSV phân lập 49 Bảng 4.2. Hoạt tính sinh học các chủng VSV tuyển chọn 50 Bảng 4.3. Một số ñặc ñiểm hình thái của các chủng VSV tuyển chọn 51 Bảng 4.4. ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của các chủng VSV tuyển chọn 53 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng và sinh enzym ngoại bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2 56 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH ñến sinh trưởng và phát triển của VSV 57 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sinh trưởng và phát triển của VSV 58 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon ñến sinh trưởng và sinh enzym ngoài bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2 59 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ ñến sinh trưởng và sinh enzym ngoài bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2 60 Bảng 4.10. Khả năng tác ñộng tương hỗ giữa các chủng VSV tuyển chọn 61 Bảng 4.11. Mật ñộ và hoạt tính enzym ngoại bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2 khi nuôi cấy riêng lẻ và hỗn hợp trong chất mang cám gạo khử trùng 62 Bảng 4.12. Chất lượng của chế phẩm VSV dạng bột 66 Bảng 4.13. Các thành phần chủ yếu có trong vỏ cà phê 67 Bảng 4.14. Kết quả phân tích vỏ quả cà phê ở các công thức thí nghiệm sau 30 ngày 68 Bảng 4.15. Diễn biến nhiệt ñộ trong ñống ủ vỏ quả cà phê 71 Bảng 4.16. Kết quả phân tích vỏ quả cà phê trước và sau khi xử lý 71 Bảng 4.17. Tỉ lệ nảy mầm của hạt cải trên nền các cơ chất 74 Bảng 4.18. Vi sinh vật gây bệnh trong ñống ủ vỏ cà phê 74 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC HÌNH VẼ, ðỒ THỊ Tên hình Trang Hình 2.1. Sản lượng và diện tích trồng cà phê ở Việt Nam 5 Hình 2.2. Cấu trúc phân tử xenlulo 12 Hình 2.3. Cơ chế phân hủy xenluloza của Reese 14 Hình 2.4. Cơ chế phân hủy xenluloza của Klyosov 15 Hình 2.5. Sự biến ñổi của pH biểu diễn theo thời gian trong quá trình sản xuất compost 25 Hình 3.1. Mô hình cấy vạch nghiên cứu tính ñối kháng 43 Hình 4.1. ðường kính vòng phân giải CMC của các chủng VSV sử dụng sản xuất chế phẩm 50 Hình 4.2. Khuẩn lạc chủng P1.1 51 Hình 4.3. Tế bào chủng P1.1 51 Hình 4.4. Khuẩn lạc chủng P5.1 52 Hình 4.5. Tế bào chủng P5.1 52 Hình 4.6. Khuẩn lạc chủng P2.2 52 Hình 4.7. Tế bào chủng P2.2 52 Hình 4.8. Khuẩn lạc chủng P3.2 52 Hình 4.9. Tế bào chủng P3.2 52 Hình 4.10. Vị trí phân loại chủng P1.1 và P5.1 với các loài có quan hệ họ hàng gần 54 Hình 4.11. Vị trí phân loại chủng P2.2 và P3.2 với các loài có quan hệ họ hàng gần 55 Hình 4.12. Hình ảnh minh họa khả năng tác ñộng tương hỗ với nhau của các chủng VSV tuyển chọn 61 Sơ ñồ 4.1. Quy trình sản xuất chế phẩm VSV dạng bột 63 Sơ ñồ 4.2. Quy trình xử lý vỏ quả cà phê bằng chế phẩm VSV 69 Hình 4.13. Diễn biến nhiệt ñộ trong ñống ủ 71 [...]... qu cà phê làm phân h u cơ bón cho các lo i cây tr ng 1.3 YÊU C U – Phân l p, tuy n ch n ñư c các ch ng VSV (vi khu n và x khu n) có kh năng phân gi i m nh xenlulo ñ làm gi ng s n xu t ch ph m VSV x lý v cà phê – S n xu t ñư c ch ph m VSV có kh năng phân gi i cao và nhanh xenlulo t ñó s d ng chúng ñ phân gi i v cà phê làm phân bón – ð xu t ñư c quy trình ng d ng ch ph m vi sinh phân gi i nhanh v cà phê. .. pháp x lý khác nhau, phương pháp x lý y m khí ñã ñư c ch n ñ x lý nư c th i cho ngành công nghi p cà phê [21,25] Th t qu cà phê thu ñư c trong quá trình ch bi n cà phê chi m kho ng 40% tr ng lư ng toàn b qu cà phê V cà phê có ñ m cao (80–85%), giàu hydratcacbon, protein, vitamin và các nguyên t khoáng là nguyên li u lý tư ng cho các quá trình lên men VSV M t s nông dân ñem tr n v cà phê v i phân chu... c x lý ch bi n ñ làm th c ăn chăn nuôi, ho c tái ch làm phân bón trong các nông trư ng cà phê [25] Vi t Nam là nư c xu t kh u cà phê l n th hai trên th gi i, s n lư ng cà phê c a Vi t Nam trong nh ng năm v a qua dao ñ ng xung quanh m c 1.450.000 t n/năm, trong ñó 95% t ng s n lư ng dành cho xu t kh u, ph ph ph m c a ngành cà phê ch y u là v qu cà phê vào kho ng 652.000 t n/năm ðây là ngu n h u cơ d... s n sinh ra enzym ngo i bào xenlulaza, proteaza, amylaza… ñ chuy n hóa các ch t xơ s i thành mùn h u cơ là vi c làm r t quan tr ng c n thi t hi n nay Xu t phát t th c t trên, tôi ti n hành th c hi n ñ tài Nghiên c u ng d ng VSV x lý ph th i v qu cà phê làm phân h u cơ Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 2 1.2 M C TIÊU Nghiên c u ng d ng ñư c vi sinh v t x lý ph... lư ng qu cà phê Trong khi các nư c trên th gi i ñã có nh ng công trình x lý v cà phê ñ s n xu t th c ăn cho gia súc gia c m, ng d ng lên men t o phân bón; s n xu t hương thơm t nhiên, nghiên c u ng d ng nhi t năng thì nư c ta, r t ít công trình nghiên c u ñ n vi c ng d ng ch ph m này V cà phê ch m phân h y do nó có hai thành ph n khó phân h y là lignin và xenlulo Hàm lư ng xenlulo trong v cà phê chi... cơ d i dào ñ s d ng làm phân h u cơ Trư ng ð i H c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p 4 Hình 2.1 S n lư ng và di n tích tr ng cà phê 2.2 BI N PHÁP X Vi t Nam LÝ PH PH PH M CÀ PHÊ 2.2.1 ð t Ngư i nông dân thư ng ñem ñ t v cà phê thành tro gây ô nhi m môi trư ng So v i các ph ph m nông nghi p khác, ch t th i này phân h y lâu hơn và gây ô nhi m môi trư ng V cà phê chi m tr ng lư... ñ t V i cách làm này hàng năm, chúng ta b phí m t ngu n ph li u kh ng l và có nguy cơ gây ô nhi m cho môi trư ng Vì th , vi c nghiên c u x lý ngu n ph li u này là m t vi c làm c p thi t hi n nay [11] Xu th hi n nay là phát tri n n n nông nghi p s ch, n n nông nghi p h u cơ, nhu c u v phân h u cơ ñã thi u l i càng thi u vì ngu n phân h u cơ t chăn nuôi gia súc, gia c m h n ch Vì v y, x lý ph ph ph m... t cũng tăng lên, ñ t 2,36 t n/ha [11] Cùng v i vi c gia tăng v s n lư ng cà phê, ñ ng th i cũng gia tăng v ph li u v cà phê Theo con s ư c tính, v cà phê thư ng chi m kho ng 40 – 45% tr ng lư ng c a qu cà phê Như v y, s lư ng v cà phê b ñi trong nư c có th lên ñ n 652.500 t n/năm, con s không nh này ñòi h i ph i có bi n pháp x lý thích h p, ñ m b o v sinh môi trư ng, ñem l i l i ích cho c ng ñ ng Trên... H cũng ñã ti n hành nghiên c u trên ñ i tư ng v cà phê như coffein, lên men pha r n, xilo, nghiên c u các h p ch t polyphenol và các h p ch t kháng sinh M c tiêu c a h là x lý ngu n ph th i ñ s n xu t th c ăn cho ñ ng v t và nghiên c u tách ch t t v cà phê trong nư c, các nhà khoa h c cũng b t ñ u quan tâm ñ n ngu n ph th i này nhưng cho ñ n nay, v cà phê v n chưa ñư c x lý h p lý Ph n l n ñư c ñ b... nh ng gi i pháp ñó là s n xu t phân bón h u cơ có ngu n g c t các h p ch t t nhiên Trong quá trình ch bi n nông s n, ch bi n cà phê th i ra môi trư ng m t lư ng v r t l n Hi n nay Vi t Nam, di n tích gieo tr ng cà phê có xu hư ng tăng và ñã ñ t ñ n con s 616.000ha [2] S n lư ng cà phê trên th gi i cũng như c a Vi t Nam ñ u tăng qua các năm Năm 2012 s n lư ng cà phê c a Vi t Nam Trư ng ð i H c Nông Nghi . học 25 2.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ PHẾ THẢI LÀM PHÂN BÓN 26 2.4.1. Nghiên cứu trên thế giới 26 2.4.2. Nghiên cứu ở Vi t Nam 29 2.4.2.1. Xử lý phế phụ phẩm nông. tài Nghiên cứu ứng dụng VSV xử lý phế thải vỏ quả cà phê làm phân hữu cơ . Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 3 1.2. MỤC TIÊU Nghiên cứu ứng dụng. NỘI –––––––––– TRẦN ðỨC HUY NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ PHẾ THẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ LÀM PHÂN HỮU CƠ LUẬN VĂN THẠC SĨ Hµ Néi