Ờ Phòng Thắ nghiệm VSV Ờ Bộ môn VSV Ờ Viện Thổ nhưỡng Nông hóạ Ờ Nhà lưới Ờ Viện Thổ nhưỡng Nông hóạ
3.1.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 4 năm 2012 ựến tháng 10 năm 2013.
3.1.4. Môi trường nghiên cứu
Ờ Môi trường Hans (Môi trường kiểm tra vi khuẩn phân giải xenluloza) (g/l): K2HPO4Ờ 0,5; KH2PO4Ờ 0,5; (NH4)2SO4Ờ 1; MgSO4.7H2OỜ 0,1; CaCl2Ờ 0,1; NaClỜ 6; Cao nấm menỜ 0,1; CMCỜ 0,1; ThạchỜ 12; nước cất Ờ 1 lắt; pH=7. Ờ Môi trường Gauze I (g/l): K2HPO4Ờ 0,5; KH2PO4Ờ 0,5; MgSO4.7H2O Ờ 0,5; NaClỜ 0,5; KNO3Ờ 1; FeSO4.7H2O Ờ 0,01; XenlulozeỜ 20; thạchỜ 12; nước cất Ờ 1 lắt; pH=7.
Ờ Môi trường Gauze II (g/l): Nước chiết thịt Ờ 30ml; pepton Ờ 5; NaCl Ờ 5; glucoza Ờ 10; thạch Ờ 18; nước cất Ờ 1 lắt; pH = 7 Ờ 7,4.
Ờ Môi trường Gauze (Môi trường nuôi cấy ựể kiểm tra xạ khuẩn phân giải xenluloza) (g/l): KH2PO4 Ờ 1,0; NaNO3 Ờ 0,1; KCl Ờ 0,1; MgSO4.7H2O Ờ 0,5; FeSO4 Ờ 0,01; Bột giấy Ờ 10; Thạch Ờ 15; Nước cất Ờ 1 lắt; pH = 7.
Ờ Môi trường CMC ựặc ựể xác ựịnh hoạt tắnh phân giải xenlulo của các VSV phân lập ựược (g/l): CMCỜ 1; thạchỜ 12; nước cất Ờ 1 lắt.
Ờ Môi trường xạ khuẩn tổng số (g/l): KH2PO4 Ờ 0,5; KNO3 Ờ 1;MgSO4 Ờ 0,5; FeSO4 Ờ 0,01; NaCl Ờ 0,5; Tinh bột tan Ờ 10; Thạch Ờ20; nước Ờ 1 lắt; pH = 7.
Ờ Môi trường thạch thường glucoza (g/l): Pepton Ờ 10; NaCl Ờ 5; Cao thịt Ờ 5; Glucoza Ờ 1; Thạch Ờ 15; nước cất Ờ 1 lắt; pH = 7.
Ờ Môi trường MPA (g/l): Cao thịt Ờ 3; Pepton Ờ 10; NaCl Ờ 0,5; Thạch Ờ 20, nước cất Ờ 1 lắt; pH = 6,8 Ờ 7.
Ờ Môi trường LB (Lauria Betani) (g/l): Pepton Ờ 10; Glucoza Ờ 10, Cao nấm mem Ờ 5; NaCl Ờ 10; nước cất Ờ 1 lắt; pH =7.
Ờ Môi trường Gost (g/l): Na2HPO4 Ờ 0,7; KH2 PO4 Ờ 0,3; KNO3; MgSO4 Ờ 0.4; nước cất Ờ 1 lắt; pH = 7.
Ờ Môi trường A Ờ 4 (g/l): glucoza Ờ 10; bột ựậu tương Ờ 10; NaCl Ờ 5, CaCO3 Ờ 1; nước Ờ 1 lắt; pH = 7.
Ờ Môi trường A Ờ 4H (g/l): glucoza Ờ 15; bột ựậu tương Ờ 15; NaCl Ờ 5; CaCO3 Ờ 1; nước Ờ 1 lắt; pH = 7.
Ờ Môi trường AỜ12 (g/l): Tinh bột tan Ờ 10, rỉ ựường Ờ 10; bột ựậu tương Ờ 10; KH2PO4 Ờ 2; CaCo3 Ờ 1; NaCl Ờ 5; nước Ờ 1 lắt; pH = 7.
Ờ Môi trường ISPỜ4 (g/l): Tinh bột tan Ờ10; K2HPO4 Ờ 1,0; MgSO4.7H2O Ờ 1,0; NaCl Ờ1,0; (NH4)2SO4 Ờ 2; CaCO3 Ờ 2; dung dịch khoáng Ờ 1ml; Thạch Ờ 18; nước cất Ờ 1 lắt; pH = 7 Ờ 7,2.
Ờ Dung dịch nước muối sinh lý: NaCl: 0,85g; nước cất: 100ml.
Môi trường xác ựịnh hoạt tắnh enzym
Ờ Môi trường xác ựịnh hoạt tắnh enzym CMCỜaza (g/l): CMC Ờ 2; Thạch Ờ 15; nước cất Ờ 1 lắt.
Ờ Môi trường xác ựịnh hoạt tắnh xenlulaza (g/l): NH4NO3 Ờ 1; K2HPO4 Ờ 0,5; KH2PO4 Ờ 0,5; MgSO4.7H2O Ờ 0,5; NaCl Ờ 1; CaCl2 Ờ 0,1; FeCl3 Ờ 0,02; cao mem Ờ 0,05; bột giấy Ờ 2; pH = 7,0 Ờ 7.2.
Môi trường sản xuất chế phẩm VSV
Ờ Môi trường dịch thể (g/l): Rỉ ựường Ờ 14; Pepton Ờ 1; dung dịch muối tiêu chuẩn Ờ 10;
Ờ Dung dịch muối tiêu chuẩn (g/l): K2HPO4 Ờ 5; MgSO4 Ờ 2,5; NaCl Ờ 2,5; Fe2(SO4)3 Ờ 0,05; MnSO4 Ờ 0,05; Nước Ờ 1 lắt.
Ờ Môi trường chất mang (tỉ lệ): 21 cám gạo: 3 cám ngô: 3 bột ựậu tương: 1 rỉ ựường.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Ờ Phân lập các VSV từ mẫu ựất trồng cà phê và từ mẫu phân ủ. Ờ Lựa chọn tổ hợp VSV phân giải nhanh vỏ cà phê làm phân hữu cơ. Ờ Sản xuất chế phẩm VSV phân giải nhanh vỏ cà phê làm phân hữu cơ. Ờ Bảo quản chế phẩm (thời gian bảo quản, khả năng tồn tại và hoạt tắnh sinh học của các chủng VSV trong chế phẩm sau các thời gian bảo quản, phương pháp bảo quản).
Ờ ựề xuất quy trình ứng dụng chế phẩm VSV phân giải nhanh vỏ quả cà phê. Ờ đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi sinh ựến khả năng phân hủy vỏ quả cà phê.
3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân giải xenlulo
a) Phân lập VSV từ mẫu ựất và từ mẫu phân ủ
Các chủng VSV có khả năng phân hủy xenlulo ựược phân lập như sau: - Bước 1: Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90ml nước muối sinh lý ựã ựược khử trùng.
- Bước 2: Lắc 30 phút trên máy lắc, tốc ựộ 150 vòng/phút, ựược dung dịch pha loãng có nồng ựộ 10Ờ1, sau ựó ựể lắng.
- Bước 3: Dùng pipetman hút 1ml dịch trong cho vào ống eppendorf, pha loãng dần ựến nồng ựộ 10Ờ6.
- Bước 4: Lấy 0,1ml dịch ở các nồng ựộ từ 10Ờ4 ựến 10Ờ6 nhỏ và dàn ựều trên ựĩa petri chứa môi trường Gauze I và Hans. để trong tủ ấm ở nhiệt ựộ 37oC trong 24hỜ48h sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
- Bước 5: Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau ựược tách riêng, làm thuần và giữ trong ống nghiệm ựể sử dụng cho các thắ nghiệm saụ
Kết quả xác ựịnh hoạt tắnh CMCỜaza theo Williams, 1983.
b) Tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phân giải xenlulo mạnh
Từ nguồn phân lập VSV phân giải xenlulo trong các mẫu ựất trồng cà phê và mẫu phân ủ ựã lựa chọn, tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phân giải xenlulo mạnh, sau khi phân lập sẽ ựược làm thuần, cấy truyền và ựánh giá sự ổn ựịnh hoạt tắnh. Các chủng ổn ựịnh hoạt tắnh sẽ ựược giữ lại ựể tiến hành các nghiên cứu tiếp theọ
3.3.2. Xác ựịnh các ựiều kiện lên men nhân sinh khối của các chủng VSV
3.3.2.1. Xác ựịnh thời gian nuôi cấy của các chủng vi sinh vật
Các chủng VSV ựược nuôi cấy trên môi trường thạch ựặc hiệu trong tủ ựịnh ôn ở 28 Ờ 35oC. Theo dõi khả năng mọc của VSV tại các mốc thời gian khác nhau: 16, 24, 36, 48, 72, > 72h và xác ựịnh xem chủng VSV ựó thuộc nhóm mọc nhanh (mọc trước 72 giờ), hay thuộc nhóm mọc chậm (mọc sau 72 giờ).
3.3.2.2. Xác ựịnh hình thái, kắch thước khuẩn lạc của vi sinh vật
a) Xác ựịnh hình thái, kắch thước khuẩn lạc
Nuôi cấy các chủng VSV trên môi trường thạch ựặc hiệu ở 28 Ờ 350C, trong 5 ngàỵ Xác ựịnh hình thái và kắch thước khuẩn lạc theo phương pháp quan sát và ựo trực tiếp bằng thước ựo (cm).
b) Quan sát hình thái tế bào VSV
Ờ đối với vi khuẩn: Tiến hành phương pháp nhuộm Gram ựể xác ựịnh vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hay Gram dương, quan sát bằng kắnh hiển vi ựiện tử ựể biết chắnh xác hình thái, kắch thước tế bào [30].
Ờ đối với xạ khuẩn: Xạ khuẩn ựược nuôi cấy trên môi trường Gauze Ị Trên bề mặt môi trường, sau 7 Ờ 9 ngày nuôi ở nhiệt ựộ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lanmen dưới kắnh hiển vi quang học [39]. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn sóng ký hiệu RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Ratinaculiapert) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira).
Ờ để quan sát bề mặt bào tử: Dùng màng cacbon ựặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khắ sinh có bào tử, sau ựó quan sát và chụp ảnh dưới kắnh hiển vi ựiện tử. Bào tử có hình dạng: hình cầu, ựền gần cầu, hình ovan, hạt chanh, hình elipẦ[30].
3.3.2.3. Lựa chọn môi trường thắch hợp
Các chủng VSV ựược nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt ựộ 28Ờ35oC với các loại môi trường khác nhaụ Xác ựịnh pH trước khi nuôi cấỵ Sau 5 ngày ựem xác ựịnh:
Ờ pH sau nuôi cấy;
Ờ Mật ựộ tế bào (CFU/ml) theo phương pháp Kock [3];
Ờ Hoạt tắnh enzym bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch. So sánh kết quả thu ựược ựể lựa chọn ra môi trường nuôi cấy thắch hợp nhất.
3.3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ
Các chủng VSV ựược nuôi cấy trên môi trường dịch thể trong bình nón 250ml.
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Ờ Sử dụng các nguồn cacbon khác nhau ựể bổ sung vào môi trường: tinh bột (1%); tinh bột (2%); glucoza (1%); sacharoza (1%), CMC.
Ờ Bổ sung giống VSV vào các bình với lượng khác nhaụ Nuôi trên máy lắc với tốc ựộ 220 vòng/phút. Sau 5 ngày xác ựịnh các thông số: pH sau nuôi cấy, sinh khối, hoạt tắnh enzym.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Ờ Sử dụng cac nguồn nitơ khác nhau ựể bổ sung vào môi trường nuôi cấy: Cao nấm men (1%); bột ựậu tương (1%); bột ựậu tương (2%); peptone (1%); (NH4)2SO4 (0,2%); KNO3 (0,1%).
Ờ Bổ sung giống VSV vào các bình với lượng bằng nhaụ Nuôi trên máy lắc với tốc ựộ 220 vòng/phút. Sau 5 ngày xác ựịnh các thông số: pH sau nuôi cấy, sinh khối, hoạt tắnh enzym.
3.3.2.5. Ảnh hưởng của pH [30]
Các chủng VSV ựược nuôi cấy lắc, tốc ựộ 220 vòng/phút, trên môi dịch thể ở các mức pH khác nhau (pH=5, pH=6, pH=7, pH= 8, pH= 9).
Sau 5 ngày xác ựịnh các thông số: pH sau nuôi cấy, sinh khối, hoạt tắnh enzym. So sánh kết quả ựể lựa chọn pH nuôi cấy thắch hợp.
Tiến hành
Ờ Sử dụng dung dịch ựệm Sorensen1 với KH2PO4 và Na2HPO4.2H2O ựược pha theo tỉ lệ các mức pH tương ứng , chuẩn ựộ bằng NaOH 0,01N và HCl 0,01N (sử dụng thang pH) trước khi ựem hấp môi trường nuôi cấy (1atm, 30 phút). Sau ựó ựổ môi trường ra các ựĩa petrị
Ờ Cấy 0,1ml dịch khuẩn chuyên tắnh (nuôi trên môi trường dịch thể trong 24h trên máy lắc 220 vòng/phút) vào các ựĩa petri trên.
Ờ VSV sau khi cấy nuôi ở tủ ựịnh ôn (nhiệt ựộ 28 Ờ 300), ựem ựếm số lượng khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấỵ
3.3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ [30]
Các chủng VSV ựược nuôi cấy trong ựiều kiện môi trường và pH thắch hợp ở các nhiệt ựộ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 600C.
Sau 5 ngày xác ựịnh các thông số: pH sau nuôi cấy, sinh khối, hoạt tắnh enzym. So sánh kết quả ựể lựa chọn nhiệt ựộ nuôi cấy thắch hợp.
+ Tiến hành:
Các chủng VSV ựược nuôi cấy trên môi trường dịch thể chuyên tắnh trong tủ ựịnh ôn (28 Ờ 300C) trong 48h, sau ựó cho vào tủ lạnh 2h.
Môi trường ựược hấp khử trùng trong nồi hấp sau ựó ựược ựổ ra ựĩa petrị Pha loãng môi trường dịch thể ựến 10Ờ5,10Ờ6. Nhỏ mỗi nồng ựộ 0,05ml vào ựĩa petrị Mỗi nồng ựộ nhắc lại 3 lần. Dùng que chang chang ựềụ
đem nuôi cấy các chủng VSV ở các mức nhiệt ựộ 200C, 300C, 400C, 500C, 600C, 700C. đếm số lượng khuẩn lạc mọc sau hai ngày nuôi cấỵ
3.3.2.7. Xác ựịnh hoạt tắnh enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [3,30] thạch [3,30]
Xác ựịnh cường ựộ phân giải CMC, xenlulo, tinh bột, protein của các chủng VSV theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên ựĩa thạch (Wiliam, 1983).
Môi trường ựược hấp khử trùng trong nồi hấp sau ựó ựổ ra ựĩa petrị Mỗi ựĩa thạch ựổ dày khoảng 0,2cm, ựợi nguội, dùng khoan nút chai ựể khoan lỗ thạch ựường kắnh 1cm. Nhỏ dịch nuôi cấy VSV (khoảng 0,2ml) vào lỗ thạch, ựể lạnh 6h rồi ựặt vào tủ ựịnh ôn 37oC trong vòng 24h. Nhuộm màu các ựĩa thạch bằng dung dịch axit axetic khi thử hoạt tắnh proteaza, còn các hoạt tắnh khác dùng dung dịch lugol. Quan sát vòng phân giải màu sáng.
Hoạt tắnh enzym ựược xác ựịnh qua kắch thước vòng phân giải theo công thức: Hoạt tắnh enzym= D Ờ d (mm).
Trong ựó:
DỜ ựường kắnh vòng phân giải; dỜ ựường kắnh lỗ khoan.
3.3.2.8. định lượng enzym
Xác ựịnh hoạt ựộng xenlulaza
Hoạt ựộng xenluaza ựược xác ựịnh chắnh xác dựa vào lượng ựường khử tạo thành sau phản ứng bằng phương pháp ựo quang phổ theo Miller (1959).
Phương pháp này kiểm tra sự có mặt của nhóm cacbonyl tự do ựược tạo ra từ quá trình oxy hóa nhóm anựehit của ựường. Trong môi trường kiềm, nhóm cacbonyl này sẽ khử axit 3,5Ờdinitrosossalisilic thành axit 3Ờamino, 5Ờ nitrosalisilic có màu nâu ựỏ.
đơn vị hoạt ựộ: Một ựơn vị hoạt ựộ quốc tế (IU) ựược ựịnh nghĩa là lượng enzym làm thủy phân cơ chất (CMC) thành ựường khử tương ựương 1 ộmol glucoza trong một phút ở ựiều kiện thắ nghiệm.
Tiến hành:
Ờ Ống thắ nghiệp (lặp lại 3 lần): Hút vào ống nghiệm 0,1ml dịch enzym, thêm 0,4ml dung dịch 0,5% CMC trong ựệm potassium acetate 0,5M, pH tối ưụ Hỗn hợp ựược lắc ựều và ủ ở nhiệt ựộ tối ưu trong 5 phút, sau ựó bổ sung ngay 1,25ml dung dịch thuốc thử DNS và ựun sôi cách thủy 5 phút.
Ờ Ống ựối chứng: Hút vào ống nghiệm 0,1ml dịch enzym, thêm 1,25ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4ml dung dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp ựược lắc ựều và ủ ở nhiệt ựộ tối ưu trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4ml dung dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp ựược lắc ựều và ủ ở nhiệt ựộ tối ưu trong 5 phút, sau ựó lấy ra và ựun sôi cách thủy 5 phút.
Ờ Hỗn hợp sau phản ứng ựược ựo ựộ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 540nm. Kết quả ựo ựộ hấp thụ quang phổ ựược ựối chiếu với ựồ thị chuẩn nồng ựộ glucoza ựể suy ra hàm lượng ựường khử tương ựương ựược giải phóng rạ
Công thức tắnh hoạt ựộ:
(X.ựộ pha loãng).Vpu
Hự=
M.T.Vez
Trong ựó:
X: Nồng ựộ glucoza mg/ml M: Trọng lượng phân tử của glucoza T: Thời gian ủ phản ứng (phút) Vez: Thể tắch enzyme trong phản ứng (ml) Vpu: Tổng thể tắch của phản ứng (ml).
3.3.3. Bảo quản giống [3,30]
Các chủng VSV ựã ựược lựa chọn ựược cấy lên môi trường chuyên tắnh thạch nghiêng ở nhiệt ựộ phòng. Sau 2Ờ7 ngày khi các chủng VSV mọc tốt, các ống giống ựược bảo quản trong tủ lạnh ở 4Ờ6oC. Sau 2Ờ3 tháng cấy truyền một lần. Ngoài ra giống còn ựược giữ trong ống cát, trong parafin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong lycerin ở Ờ80oC hoặc ựông khô. Phương pháp này có thể bảo quản giống VSV ựược từ 6 tháng ựến 2 năm.
3.3.4. Phân loại VSV bằng phương pháp sinh học phân tử
Phân loại vi sinh vật bằng phương pháp Sequence: (1) Sử dụng chương trình BLASTN ựể phát hiện những trình tự tương ựồng với các trình tự nucleotit nghiên cứu ựã ựược công bố trong ngân hàng gen, nhằm xác nhận trình tự ựắch và chọn một số trình tự có ựộ tương ựồng cao ựể so sánh và phân tắch. (2) Sử dụng chương trình phần mềm máy tắnh MEGA2 ựể ựối chiếụ Phân tắch và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tối thiểu (Maximum Parsimony- MP method) và phương pháp tiến hoá tối thiểu (Minimum Evolution - ME method) trên cơ sở khoảng cách di truyền theo mô hình Kimura, dựa vào cây phả hệ, người ta xác ựịnh ựược mối quan hệ của các chủng vi sinh vật cần kiểm trạ [15, 20, 42,52, 55]
3.3.5. Sản xuất chế phẩm vi sinh
3.3.5.1. Nguyên liệu chế tạo chất mang
Chất mang là môi trường sống cho VSV tồn tại và phát triển, chất mang phải ựảm bảo không ựộc hại ựối với VSV, môi trường và người sử dụng. Chất mang cần có những ựiều kiện tối thiểu như: ựộ ẩm, pH, các thành phần dinh dưỡng phù hợp cho VSV tồn tại và phát triển trong một thời gian nhất ựịnh.
Chắnh vì lý do ựó mà các nhà khoa học thường sử dụng cám gạo, trấu, mùn cưa, bột ngô, ựậu tương... làm chất mang cho VSV. đây là các chất mang tốt nhất vì ngoài việc cung cấp các ựiều kiện tối thiểu cho sinh trưởng của VSV, các chất mang này còn cung cấp các nguyên tố dinh dưỡng ựa lượng, vi lượng, cũng như vitamin và chất kắch thắch sinh trưởng. Ngoài ra trong thực tế, các nhà khoa học có thể tận dụng than bùn, rác thải hữu cơ sau xử lý, bùn hoạt tắnh sau xử lý làm chất mang cho các chủng VSV trong quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh ựa chức năng bón cho cây trồng [8].
3.3.5.2. Nghiên cứu tắnh ựối kháng giữa các chủng VSV
a) Phương pháp cấy vạch
Sử dụng phương pháp cấy vạch ựể ựánh giá tốt mối quan hệ của các chủng vật ựược lựa chọn, xem chúng có ựối kháng nhau hay không? Các chủng sinh vật
ựược cấy thành các ựường thẳng vuông góc, mỗi chủng ựều cắt nhau tại nhiều ựiểm. Nuôi cấy ở 280C trong vòng 24h ựến 48h.
Hình 3.1. Mô hình cấy vạch nghiên cứu tắnh ựối kháng
b) Khả năng tồn tại của các chủng VSV khi nuôi cấy riêng lẻ và hỗn chủng trong ựiều kiện chất mang dạng bột
Các chủng VSV ựược nhiễm riêng rẽ và hỗn hợp vào chất mang cám gạo khử trùng.
Sau thời gian bảo quản 30 ngày, 60 ngày ở ựiều kiện nhiệt ựộ phòng, tiến hành xác ựịnh mật ựộ VSV, hoạt tắnh enzym ngoại bào của từng chủng VSV trong ựiều kiện riêng rẽ và hỗn hợp.
Mật ựộ VSV ựược xác ựịnh theo phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch chuyên tắnh theo phương pháp kiểm tra mật ựộ tế bào vi khuẩn, xạ