Giải trình tự gen mã hóa phần tử 16S ARN ribosom là phương pháp hiện ựại và chắnh xác ựể có thể phân loại chắnh xác ựến loàị Các chủng VSV ựược nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy chuyên tắnh, ly tâm 1,5ml dịch nuôi cấy VSV lấy sinh khối tế bào và tách chiết qua nhiều bước (phương pháp tách chiết ADN tổng số). Trong ADN tổng số ựược tách chiết có gen mã hóa ADNr16S của các chủng nghiên cứụ Vì vậy, thực hiện phản ứng PCR với các mồi ựược tổng hợp nhân tạo ựể nhân gen ARNr16S, với mỗi cặp mồi ựược thiết dựa trên trình tự bảo thủ của gen ARNr16S của Ẹcoli thì theo lý thuyết sản phẩm PCR thu ựược phải có ựộ dài xấp xỉ 1.500bp. Kiểm tra các sản phẩm PCR bằng ựiện di trên gen agarcza 1% cho các băng có kắch thước khoảng 1.500bp ựúng như lý thuyết. Chọn mẫu có băng duy nhất và tinh sạch bằng kắt QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Sau ựó, tiếp tục kiểm tra ựộ tinh sạch của mẫu và xác ựịnh nồng ựộ ADN. Các sản phẩm PCR tinh sạch ựược khếch ựại với các mồi và hóa chất của bộ kắt ABI PRISM Cycle sequencing ựể chuẩn bị xác ựịnh trình tự nucleotit bằng máy xác ựịnh trình tự gen ABI 3100 trình tự, tự ựộng 3100 Avant. Sau ựó kết quả trình tự ựược so sánh với các trình tự nucleotit của các loài ựã ựược xác ựịnh sẵn trong ngân hàng gen (GenBank) ựể xác ựịnh tên loài bằng cách sử dụng giao diện tìm
kiếm "nuleotitdeỜnucleotide BLAST" của Trung tâm Tin Ờ Công nghệ sinh học Quốc giạ
Sau khi phân tắch trình tự ADNr 16S, lai ADNỜADN và xây dựng cây phát sinh chủng loạị Dựa vào kết quả trình tự nucleotit ựoạn ADNr 16S, phần mềm CLUSTAL 1.83 và các trình tự có sẵn thuộc tắnh chi Bacillus và Streptomyces
trong ngân hàng gen (GenBank) chúng tôi xây dựng ựược cây phát sinh chủng loại cho các chủng vi khuẩn P1.1, P5.1 (hình 4.9.) và xạ khuẩn P2.2, P3.2 (hình 4.10.)
0.01
Bacillus nematotocita_AY820954
Bacillus velezenis_AY603658
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus amyloliquefaciens_X60605
Bacillus polyfermenticus_DQ659145
Bacillus subtilis_AJ276351
P1.1
Bacillus mojavensis_AB021191
Brevibacterium halotolerans_AM747812
Bacillus axaquiensis_DQ993671
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus licheniformis_X68416
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus isabeliae_AM503357
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus simplex_AJ439078
Bacillus megaterium_D16273
P5.1
Staphylococus aureus_X68417
Hình 4.10. Vị trắ phân loại chủng P1.1 và P5.1 với các loài có quan hệ họ hàng gần
Trình tự gen rARN16S của chủng P1.1 tương ựồng 99,8% với ựoạn 16S của vi khuẩn Bacillus subtilis AJ276351 và P5.1 tương ựồng 99,5% với ựoạn 16S của vi khuẩn Bacillus megaterium D16273. Như vậy, dựa vào ựặc ựiểm hình thái, kắch thước và trình tự nucleotit ựoạn ADNr 16S, chủng P1.1 ựược xác ựịnh là
Bacillus subtilis, chủng P5.1 là Bacillus megaterium.
Trình tự gen rARN 16S của chủng P2.2 tương ựồng 99,6% với ựoạn 16S của xạ khuẩn Streptomyces griseoflavus UV741217 và P3.2 tương ựồng 99,9% với ựoạn 16S của xạ khuẩn Streptomyces griseorubens AB184139. Như vậy, dựa
52 58 52 59 69 55 94 100 98 96 98 56 55 95
vào các ựặc ựiểm hình thái, sinh hóa và trình tự nucleotit ADN 16S, chủng P2.2 là Streptomyces griseoflavus và chủng P3.2 là Streptomyces griseorubens.
Streptomyces almquistii_AY999782 0.01 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Streptomyces althioticus_AY999791
Streptomyces griseoflavus_EU741217
P2.2
Streptomyces griseoincarnatus_AJ781321
Streptomyces aureofaciens_AY289116
Streptomyces labedae_AB184704
Streptomyces vinaceus_AB184763
Streptomyces erythrogriseus_AJ781328
Streptomyces griseorubens_AB184139
P3.2
Streptomyces variabilis_DQ442551
Streptomyces heliomycini_AB184712
Kitasatosporia setalba_U93332
Hình 4.11. Vị trắ phân loại chủng P2.2 và P3.2 với các loài có quan hệ họ hàng gần