thạch [3,30]
Xác ựịnh cường ựộ phân giải CMC, xenlulo, tinh bột, protein của các chủng VSV theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên ựĩa thạch (Wiliam, 1983).
Môi trường ựược hấp khử trùng trong nồi hấp sau ựó ựổ ra ựĩa petrị Mỗi ựĩa thạch ựổ dày khoảng 0,2cm, ựợi nguội, dùng khoan nút chai ựể khoan lỗ thạch ựường kắnh 1cm. Nhỏ dịch nuôi cấy VSV (khoảng 0,2ml) vào lỗ thạch, ựể lạnh 6h rồi ựặt vào tủ ựịnh ôn 37oC trong vòng 24h. Nhuộm màu các ựĩa thạch bằng dung dịch axit axetic khi thử hoạt tắnh proteaza, còn các hoạt tắnh khác dùng dung dịch lugol. Quan sát vòng phân giải màu sáng.
Hoạt tắnh enzym ựược xác ựịnh qua kắch thước vòng phân giải theo công thức: Hoạt tắnh enzym= D Ờ d (mm).
Trong ựó:
DỜ ựường kắnh vòng phân giải; dỜ ựường kắnh lỗ khoan.
3.3.2.8. định lượng enzym
Xác ựịnh hoạt ựộng xenlulaza
Hoạt ựộng xenluaza ựược xác ựịnh chắnh xác dựa vào lượng ựường khử tạo thành sau phản ứng bằng phương pháp ựo quang phổ theo Miller (1959).
Phương pháp này kiểm tra sự có mặt của nhóm cacbonyl tự do ựược tạo ra từ quá trình oxy hóa nhóm anựehit của ựường. Trong môi trường kiềm, nhóm cacbonyl này sẽ khử axit 3,5Ờdinitrosossalisilic thành axit 3Ờamino, 5Ờ nitrosalisilic có màu nâu ựỏ.
đơn vị hoạt ựộ: Một ựơn vị hoạt ựộ quốc tế (IU) ựược ựịnh nghĩa là lượng enzym làm thủy phân cơ chất (CMC) thành ựường khử tương ựương 1 ộmol glucoza trong một phút ở ựiều kiện thắ nghiệm.
Tiến hành:
Ờ Ống thắ nghiệp (lặp lại 3 lần): Hút vào ống nghiệm 0,1ml dịch enzym, thêm 0,4ml dung dịch 0,5% CMC trong ựệm potassium acetate 0,5M, pH tối ưụ Hỗn hợp ựược lắc ựều và ủ ở nhiệt ựộ tối ưu trong 5 phút, sau ựó bổ sung ngay 1,25ml dung dịch thuốc thử DNS và ựun sôi cách thủy 5 phút.
Ờ Ống ựối chứng: Hút vào ống nghiệm 0,1ml dịch enzym, thêm 1,25ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4ml dung dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp ựược lắc ựều và ủ ở nhiệt ựộ tối ưu trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4ml dung dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp ựược lắc ựều và ủ ở nhiệt ựộ tối ưu trong 5 phút, sau ựó lấy ra và ựun sôi cách thủy 5 phút.
Ờ Hỗn hợp sau phản ứng ựược ựo ựộ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 540nm. Kết quả ựo ựộ hấp thụ quang phổ ựược ựối chiếu với ựồ thị chuẩn nồng ựộ glucoza ựể suy ra hàm lượng ựường khử tương ựương ựược giải phóng rạ
Công thức tắnh hoạt ựộ:
(X.ựộ pha loãng).Vpu
Hự=
M.T.Vez
Trong ựó:
X: Nồng ựộ glucoza mg/ml M: Trọng lượng phân tử của glucoza T: Thời gian ủ phản ứng (phút) Vez: Thể tắch enzyme trong phản ứng (ml) Vpu: Tổng thể tắch của phản ứng (ml).