a) Ảnh hưởng của nguồn C
để ựánh giá khả năng ựồng hóa các nguồn cacbon khác nhau, tiến hành nuôi cấy các chủng VSV tuyển chọn trên các môi trường thắch hợp (vi khuẩn Ờ Hans, nhiệt ựộ 40oC; xạ khuẩn Ờ GauzeI, nhiệt ựộ 30oC), thay thế các nguồn cacbon trong môi trường khác nhau: tinh bột tan, glucoza, sacharoza, và CMC sử dụng ựể xác ựịnh mức ựộ ảnh hưởng của nguồn cacbon lên hoạt tắnh enzym ngoại bào của 4 chủng VSV ựã tuyển chọn.
Kết quả trình bày ở bảng 4.8 cho thấy cả 4 chủng VSV lựa chọn ựều có khả năng sử dụng nhiều loại ựường khác nhau, trong ựó tinh bột tan và glucoza là nguồn cacbon tốt nhất cho VSV. Nguyên nhân là 4 chủng VSV ựều có khả năng tiết enzym ngoại bào amylaza, proteaza, xenlulazạ có thể chuyển hóa các dạng cacbon phức tạp thành dạng ựơn giản hơn dùng cho quá trình sinh trưởng phát triển [34]. Vì vậy, khi sử dụng các chủng VSV này trong thực tế, chúng sẽ có thể sử dụng nguồn cacbon có trong vỏ cà phê ựể sinh trưởng, phát triển nhanh và tiết nhiều enzym ngoại bào phân huỷ vỏ quả cà phê nhằm rút ngắn thời gian ủ. Kết quả này cũng cho thấy: có thể sử dụng bất cứ một nguồn cacbon nào phù hợp với ựiều kiện của phòng nghiên cứu ựể sản xuất chế phẩm VSV.
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon ựến sinh trưởng và sinh enzym ngoài bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2
Nguồn cacbon Các chỉ tiêu Chủng
glucoza (1%) sacharoza (1%) tinh bột (1%) CMC (1%) P1.1 20 ổ 0,58 15 ổ 1,00 25 ổ 0,50 25 ổ 0,58 P5.1 20 ổ 0,50 12 ổ 0,87 20 ổ 0,58 20 ổ 0,87 P2.2 15 ổ 0,50 10 ổ 0,58 26 ổ 0,50 25 ổ 0,87 Hoạt tắnh xenlulaza (DỜd,mm) P3.2 20 ổ 1,00 15 ổ 0,87 16 ổ 0,50 20 ổ 0,50
b) Ảnh hưởng của nguồn N
Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và khả năng sinh enzym ngoại bào của các VSV, chúng tôi sử dụng nguồn nitơ hữu cơ là ựậu tương, cao nấm men còn nguồn nitơ vô cơ là amon sunfat, amon clorua và amon
nitrat. Kết quả nghiên cứu cho thấy, bột ựậu tương có ảnh hưởng rất mạnh ựến hoạt tắnh enzym của cả 4 chủng ựã lựa chọn. Nguyên nhân có thể là do trong bột ựậu tương có chứa 40% protein, lipit (12Ờ 25%) gluxit (10 Ờ 15%); có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S và các vitamin A, B1, B2, D, E, F các enzym, trong ựậu tương có ựủ các axitt amin cơ bản isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanine, tryptophan, valin ựặt biệt có chứa một hàm lượng ựáng kể axit amin không thay thế cần thiết cho cơ thể [3], tiếp sau ựó, môi trường nuôi cấy có pepton và cao nấm men cũng là nguồn cung cấp nitơ tốt cho 3 chủng VSV. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Korsten (1996) về Bacillus subtilis, Hiuga Saito (1958) về Treptomyces griseoflavus.
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ ựến sinh trưởng và sinh enzym ngoài bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2, P3.2 (n = 3) Nguồn nitơ Các chỉ tiêu Chủng đậu tương (1%) đậu tương (2%) Cao nấm (1%) Pepton (1%) NH4Cl (0,1%) (NH4)2SO4 (0,2%) KNO3 (0,1%) P1.1 23 ổ 1,00 33 ổ 0,50 36 ổ 0,87 44 ổ 0,50 22 ổ 1,00 23 ổ 0,87 18 ổ 0,58 P5.1 25 ổ 1,00 32 ổ 0,58 35 ổ 0,50 42 ổ 0,58 25 ổ 1,32 25 ổ 0,58 20 ổ 0,87 P2.2 38 ổ 0,50 32 ổ 0,58 32 ổ 0,58 30 ổ 1,00 23 ổ 1,00 25 ổ 0,58 22 ổ 1,32 Hoạt tắnh xenlulaza (DỜd,mm) P3.2 35 ổ 0,50 33 ổ 0,50 30 ổ 0,58 29 ổ 0,87 24 ổ 0,58 24 ổ 0,50 21 ổ 0,87 4.4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT
4.4.1. Nghiên cứu tắnh ựối kháng giữa các chủng VSV ựã tuyển chọn
Kiểm tra tắnh ựối kháng giữa các chủng VSV ựã tuyển chọn ựể xem trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng có ức chế nhau không là việc làm rất cần thiết. Bởi vì nếu các chủng VSV không ức chế nhau thì chúng ta mới có thể dùng chúng ựể sản xuất chế phẩm [8].
Dùng phương pháp cấy vạch, các chủng VSV ựược cấy thành ựường thẳng vuông góc, mỗi chủng ựều cắt nhau tại nhiều ựiểm và xem kết quả sau 24h nuôi
cấỵ Nếu tại các ựiểm cắt nhau, các chủng vẫn phát triển bình thường thì chứng tỏ các chủng không ựối kháng nhau, còn nếu tại các ựiểm cắt nhau các chủng không phát triển thì chứng tỏ các chủng ựối kháng nhaụ
Kết quả kiểm tra cho thấy 4 chủng VSV ựã tuyển chọn không ựối kháng nhaụ Như vậy, chúng ta hoàn toàn có thể sử dụng 4 chủng VSV này ựể sản xuất chế phẩm VSV xử lý vỏ cà phê.
Bảng 4.10. Khả năng tác ựộng tương hỗ giữa các chủng VSV tuyển chọn
Chủng bị kìm hãm Chủng kìm hãm P1.1 P5.1 P2.2 P3.2 P1.1 Ờ Ờ Ờ P5.1 Ờ Ờ Ờ P2.2 Ờ Ờ Ờ P3.2 Ờ Ờ Ờ +: bị kìm hãm Ờ: không bị kìm hãm
Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn tuyển chọn không kìm hãm sinh trưởng của nhaụ
Hình 4.12. Hình ảnh minh họa khả năng tác ựộng tương hỗ với nhau của các chủng VSV tuyển chọn
4.4.2. Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật trong ựiều kiện chất mang dạng bột mang dạng bột
Sử dụng hỗn hợp chủng VSV sản xuất chế phẩm ựể xử lý vỏ quả cà phê có hiệu quả hơn so với ựơn chủng bởi vì mỗi loài VSV sẽ thực hiện một hoặc vài mắt xắch trong toàn bộ chuỗi chuyển hóa [8]. Nhằm ựánh giá khả năng tổ hợp của 4 chủng VSV lựa chọn, ựề tài tiến hành thắ nghiệm xác ựịnh khả năng tồn tại của VSV trong ựiều kiện ựơn lẻ và hỗn hợp. Với phương pháp này chúng ta có thể kiểm tra ựược mật ựộ tế bào, và hoạt tắnh enzym của các chủng VSV.
4 chủng VSV P1.1, P5.1, P2.2, P3.2 ựược nhiễm riêng lẻ và hỗn hợp vào chất mang cám gạo khử trùng. Sau 30 ngày, 60 ngày, tiến hành xác ựịnh mật ựộ tế bào VSV và hoạt tắnh enzym ngoại bào của 4 chủng VSV trên khi sống riêng lẻ và sống hỗn hợp.
Bảng 4.11. Mật ựộ và hoạt tắnh enzym ngoại bào của các chủng P1.1, P5.1, P2.2,
P3.2 khi nuôi cấy riêng lẻ và hỗn hợp trong chất mang cám gạo khử trùng (n=3)
Chủng Thời gian theo dõi (ngày) điều kiện chất mang Mật ựộ tế bào vsv (x107 CFU/g) Hoạt tắnh enzym (DỜd,mm) 0 90 40 ổ 0,50 Riêng lẻ 152 40 ổ 0,58 30 Hỗn hợp 106 37 ổ 0,58 Riêng lẻ 21 37 ổ 0,50 P1.1 60 Hỗn hợp 33 35 ổ 0,58 0 80 39 ổ 0,58 Riêng lẻ 171 39 ổ 0,87 30 Hỗn hợp 125 36 ổ 0,50 Riêng lẻ 25 36 ổ 1,00 P5.1 60 Hỗn hợp 36 35 ổ 0,50 0 2 30 ổ 0,58 Riêng lẻ 58 29 ổ 0,87 30 Hỗn hợp 17 29,5 ổ 0,50 Riêng lẻ 6 27 ổ 0,58 P2.2 60 Hỗn hợp 5 26 ổ 0,87 0 3 30 ổ 0,50 Riêng lẻ 60 30 ổ 0,50 30 Hỗn hợp 20 29 ổ 0,58 Riêng lẻ 7 26 ổ 0,58 P3.2 60 Hỗn hợp 5 26 ổ 0,50
Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.11 cho thấy:
Sau 30 ngày nuôi cấy mật ựộ tế bào các chủng VSV ựều ựạt tối ựa và tương quan với nhau trong cả ựiều kiện riêng lẻ cũng như ựiều kiện hỗn hợp.
Sau 60 ngày nuôi cấy, mật ựộ tế bào VSV giảm ựi, mật ựộ tế bào trong ựiều kiện riêng lẻ nhiều hơn một chút so với ựiều kiện hỗn hợp, nguyên nhân là do khi có chủng VSV ựã mọc ở một vị trắ nào rồi thì chủng khác sẽ không mọc ựược lên vị trắ ựó nữạ Như vậy, trong ựiều kiện hỗn hợp 4 chủng thì xác suất 1 chủng bắt
gặp vị trắ nào ựó ựã có chủng khác sinh sống rồi sẽ cao hơn trong ựiều kiện riêng lẻ. Tuy nhiên, ựiều ựáng quan tâm là 4 chủng này không ức chế nhau, do ựó hoạt tắnh enzym trong cả hai ựiều kiện ựều ngang bằng nhaụ
Từ những kết quả trên, nhận thấy trong ựiều kiện chất mang cám gạo thanh trùng thì mật ựộ tế bào và hoạt tắnh enzym ngoại bào của 4 chủng VSV ựã lựa chọn không có sự thay ựổi ựáng kể khi nuôi cấy riêng lẻ hoặc hỗn hợp. điều này chứng tỏ, bốn chủng ựã chọn có thể tổ hợp lại ựược với nhau ựể sản xuất chế phẩm xử lý vỏ quả cà phê.
4.4.3. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật
Sơ ựồ 4.1. Quy trình sản xuất chế phẩm VSV dạng bột
Vi khuẩn ựược nuôi cấy lắc 150 vòng/phút trên môi trường Hans ở nhiệt ựộ 28 Ờ 300C, sau 48 giờ ựược cấy vào môi trường cám trấu ủ ở nhiệt ựộ 300C, sau 7 ngày kiểm tra tạp nhiễm.
Cấy giống P1.1, P5.1
Nhân giống cấp 1
(Môi trường Hans)
Kiểm tra chất lượng
Chế phẩm
(ựóng gói)
Cấy giống P2.2, P3.2
Nhân giống cấp 1
(Môi trường Gauze)
Trộn giống với chất mang
Kiểm tra chất lượng
Kiểm tra chất lượng Nhân giống cấp 2
(Môi trường Gauze)
Nhân giống cấp 2
Xạ khuẩn ựược nuôi cấy lắc 150 vòng/phút trên môi trường Gauze ở nhiệt ựộ 370C sau 48 Ờ72 giờ ựược cấy vào môi trường cám trấu ủ ở nhiệt ựộ 370C, sau 7 ngày kiểm tra tạp nhiễm.
Sau ựó các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ựược trộn lẫn với nhau theo tỉ lệ 1:1. Mật ựộ các chủng VSV trong chế phẩm cần ựạt 109 Ờ 1010 CFU/g.
Chuẩn bị chất mang, ựem khử trùng ở 1atm trong 1 giờ. Trộn ựều giống cấp 1 với chất mang ựã khử trùng trong phòng vô trùng với tỉ lệ 10%, ựem ủ trong 7 ngàỵ
Kiểm tra ựộ ẩm, ựộ xốp, pH, số lượng tế bào VSV tuyển chọn và VSV tạp theo TCVN 134BỜ1996 và TCVN 6168Ờ2002. Sau ựó ựóng gói ựể bảo quản và sử dụng.
4.4.4. đánh giá chất lượng của chế phẩm vi sinh vật sau khi sản xuất và trong thời gian bảo quản trong thời gian bảo quản
Chế phẩm VSV sau khi sản xuất và trong thời gian bảo quản, sử dụng ựược tiến hành kiểm tra chất lượng. Kết quả trình bày trong bảng 4.12.
a) độ ẩm
độ ẩm của chế phẩm VSV dạng bột là 35%, ở ngày thứ 30 là 34,2%, sau ựó cứ cách 30 ngày kế tiếp ựộ ẩm của mỗi lần ựo giảm ựi từ 2,5% ựến 3,5% so với lần ựo trước và ở ngày thứ 180, ựộ ẩm của chế phẩm ựo ựược là 20% giảm ựi khá nhiều so với khi sản xuất rạ Mặc dù ựộ ẩm giảm ựi theo thời gian nhưng theo TCVN thì chỉ tiêu ựộ ẩm của chế phẩm VSV dạng bột sau khi sản xuất và sau 6 tháng bảo quản ựều ựạt tiêu chuẩn Việt Nam TCVN13BỜ1996 và TCVN7185:2002. độ ẩm của chế phẩm sau khi sản xuất và trong thời gian bảo quản vẫn ựạt TCVN là một trong những chỉ tiêu quan trọng vì ựộ ẩm ổn ựịnh sẽ ựảm bảo sự tồn tại của các VSV vật hữu ắch trong chế phẩm và không tạo ựiều kiện cho các vi khuẩn tạp nhiễm trong chế phẩm phát triển mạnh
b) độ xốp
độ xốp của chế phẩm VSV dạng bột sau thành phẩm là 71%, sau 3 tháng ựầu ựộ xốp tăng dần lên, và từ tháng thứ 4 ựến tháng thứ 6 ựộ xốp giữ nguyên là
74%. Như vậy, so với lúc vừa sản xuất ra ựộ xốp của chế phẩm tăng lên không ựáng kể.
c) pH
pH của chế phẩm VSV dạng bột sau thành phẩm ựạt 6,7, tại các tháng tiếp theo pH tăng dần lên, và sau 6 tháng bảo quản pH ựo ựược 7,8. pH của chế phẩm trong thời gian bảo quản tăng dần lên là do các VSV có trong chế phẩm trong quá trình sống ựã làm kiềm hóa môi trường. Tuy nhiên, nồng ựộ pH này vẫn nằm ở mức cho phép theo TCVN 7185:2002 (pH 6 Ờ 8).
d) VSV
Theo TCVN, mật ựộ tế bào VSV tuyển chọn trong chế phẩm có chất mang thanh trùng không nhỏ hơn 1,0 x 108 CFU/gam hoặc mililit. Mật ựộ tế bào VSV tuyển chọn sau khi sản xuất ở chế phẩm dạng bột có chất mang thanh trùng là 6930 x 108 CFU/g. Mật ựộ này lớn hơn nhiều lần so với TCVN và ựây cũng là ựiều kiện cần thiết ựể ựảm bảo trong quá trình bảo quản mật ựộ này có giảm ựi nhưng vẫn ựạt TCVN. Có thể thấy rằng cứ sau một tháng thì mật ựộ tế bào VSV tuyển chọn trong chế phẩm lại giảm ựi, ựặc biệt càng về sau thì mật ựộ càng giảm ựi một cách nhanh chóng. Ở ngày thứ 180, mật ựộ tế bào VSV tuyển chọn trong chế phẩm dạng bột là 3,68 x 108CFU/g. So với lúc vừa sản xuất ra thì mật ựộ tế bào VSV hữu ắch ựã giảm ựi từ hàng trăm ựến hàng nghìn lần, tuy nhiên so với TCVN thì mật ựộ này vẫn ựạt TCVN ựưa rạ Nguyên nhân là do trong thời gian bảo quản môi trường sống ựã bị thay ựổi: pH tăng lên, ựộ ẩm giảm xuống, chất dinh dưỡng cạn dần, xuất hiện các sản phẩm trao ựổi chất của VSV. Sự suy giảm mạnh nhất là ở vi khuẩn, sau ựó xạ khuẩn và cũng khuyến cáo nên sử dụng chế phẩm khi vừa sản xuất thì sẽ có hiệu quả cao hơn.
e) VSV tạp
Theo TCVN, mật ựộ tế bào VSV tạp trong chế phẩm có chất mang thanh trùng không lớn hơn 1,0 x 102 CFU/gam hoặc mililit, và không quy ựịnh với chế phẩm có chất mang không thanh trùng. Sự xuất hiện các VSV tạp nhiễm trong chế phẩm là không thể tránh khỏi, nhưng nếu lượng VSV này quá nhiều sẽ cạnh tranh, ức chế
các VSV tuyển chọn phát triển do ựó làm hỏng chế phẩm. Khác với quy luật về sự thay ựổi số lượng VSV tuyển chọn, ựối với chế phẩm có chất mang thanh trùng, mật ựộ tế bào VSV tạp sau khi sản xuất là 1,3 CFU/g, sau 6 tháng là 57,2 CFU/g ựều nhỏ hơn TCVN ựưa ra với chế phẩm có chất mang thanh trùng.
Như vậy sau 6 tháng bảo quản và sử dụng chế phẩm VSV vẫn ựạt các tiêu chuẩn của Việt Nam ựưa rạ Vì vậy, chế phẩm này ựược phép sử dụng và lưu hành trên thị trường ựể xử lý phế thải vỏ quả cà phê.
Bảng 4.12. Chất lượng của chế phẩm VSV dạng bột Thời gian Chi tiêu Chế phẩm 30 ngày 60 ngày 90 ngày 120 ngày 150 ngày 180 ngày độ ẩm (%) 35,0 34,2 31,0 28,5 25,0 23,5 20,0 độ xốp (%) 71 71 72 73 74 74 74 pH 6,7 6,9 7,2 7,4 7,5 7,8 7,8 P1.1 (x108 CFU/g) 510 320 150 42 16 3,5 1,7 P5.1 (x108 CFU/g) 620 375 180 75 25 5,5 1,9 P2.2 (x108 CFU/g) 2650 1540 246 83 26 2,3 0,03 P3.2 (x108 CFU/g) 3150 1860 298 95 35 3,2 0,05 Tổng số vsv hữu ắch (x108 CFU/g) 6930 4095 874 295 102 14,5 3,68 VSV tạp (CFU/g) 1,3 1,5 1,8 6,0 12,5 32,8 57,2 4.5. XỬ LÝ VỎ CÀ PHÊ BẰNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT 4.5.1. Thành phần chủ yếu trong vỏ cà phê
Vỏ cà phê có thành phần chủ yếu là chất hữu cơ gồm xenlulo, pectine, tinh bột, protein... Trong ựó hai thành phần pectine và xenlulo chiếm tỉ lệ khá lớn và chúng là những thành phần cứng, khó phân giảị Thành phần xenlulo chiếm 27,65%, pectin 15,21% so với vỏ cà phê. Chắnh hai thành phần khó phân hủy này mà vỏ cà phê bền trong tự nhiên, vì vậy vấn ựề ựặt ra là phải phân hủy chúng tạo thành những chất dễ tiêu nhằm ựẩy nhanh vòng chu chuyển vật chất chúng trong tự nhiên không ựể tồn ựọng trong tự nhiên gây ô nhiễm môi trường. Mặt khác biến chúng thành phân hữu cơ phục vụ cho nông nghiệp.
Bảng 4.13. Các thành phần chủ yếu có trong vỏ cà phê
STT Thành phần Phần trăm chất khô so với khối lượng vỏ (%)
1 đường tổng số hòa tan 5,18 2 Hàm lượng tro 6,42 3 Hàm lượng carbon tổng số 93,56 4 Hàm lượng nitơ tổng số 1,56 5 Hàm lượng protein thô 11,02 6 Hàm lượng xenlulo 27,65 7 Hàm lượng tinh bột 12,62 8 Hàm lượng pectine 15,21 9 pH 5,46 10 độ ẩm 9,54 Nguồn từ thực nghiệm
4.5.2. Thiết kế thắ nghiệm nhà lưới
Tiến hành ủ vỏ quả cà phê trong thùng ủ. Thắ nghiệm gồm 7 công thức: CT1: đối chứng (vỏ cà phê không bổ sung vsv, N/P/K, vôi)
CT2: Vỏ cà phê ựược xử lý vôi
CT3: Vỏ cà phê bổ sung phân khoáng N/P/K CT4: Vỏ cà phê bổ sung phân khoáng N/P/K + vôi CT5: Vỏ cà phê bổ sung chế phẩm vi sinh
CT6: Vỏ cà phê bổ sung chế phẩm vi sinh + phân khoáng N/P/K CT7: Vỏ cà phê bổ sung chế phẩm vi sinh + phân khoáng N/P/K + vôi Liều lượng chế phẩm vi sinh: 10g chế phẩm vi sinh, mật ựộ tế bào VSV 108Ờ 109 CFU/g trong 5kg vỏ cà phê;
Liều lượng phân khoáng NPK ựược bổ sung dựa vào kết quả phân tắch tỉ lệ C/N (60:1) của nguyên liệu vỏ cà phê trước ủ: phân khoáng 10g urê, 25g supe lân, 10g kaliclorua /5kg vỏ cà phê;