nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium và protein

59 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens ..... 28 Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Út Lợt

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Út Lợt

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU

CALCIUM VÀ PROTEIN

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 60 42 40

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2012

L ỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Chiến Phương, người đã tận tình

hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài Và thầy cũng là người giúp tôi gắn kết được khoa học với thực tế

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Khoa Sinh học Trường ĐH Sư phạm

TP Hồ chí Minh đã hết lòng dạy dỗ tôi

Tôi xin giử lời cảm ơn đến các anh chị của phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học - Viện sinh học nhiệt đới và phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa, khoa

Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bà Bùi Thị Truyền, giám đốc Công ty trách nhiệm chế biến thủy sản Minh Quý - cụm công nghiệp Tân Mỹ Chánh - TP Mỹ Tho -

tỉnh Tiền Giang đã cung cấp nguyên liệu cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè và động nghiệp đã luôn bên cạnh ủng hộ tôi

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào Các tài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác thực

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Út Lợt

M ỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ x

DANH MỤC CÁC BẢNG xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về vi sinh vật nghiên cứu 3

1.1.1 Vi khuẩn Bacillus 3

1.1.2 Vi khuẩn lactic 7

1.2 Giới thiệu về cá tra 17

1.2.1 Vị trí phân loại 17

1.2.2 Đặc điểm chung 17

1.2.3 Tình hình sử dụng phụ phẩm cá tra 18

1.3 Tổng quan về TP giàu calcium và protein 19

1.3.1 Giới thiệu về calcium 19

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………25

2.1 Nguyên vật liệu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Nguyên liệu 25

2.1.3 Hóa chất 25

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 25

2.2 Môi trường nghiên cứu 26

2.3 Nội dung nghiên cứu 27

2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm 27

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 29

2.4 Phương pháp nghiên cứu 37

2.4.1 Phương pháp cấy truyền giữ giống [32] [38] 37

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn 37

2.4.3 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử [33] 40

2.4.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL [22] [29] [32] 41

2.4.5 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11]42 2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20] 44

2.4.7 Phương pháp định tính acid lactic [16] [21] 45

2.4.8 Phương pháp định lượng acid tổng [2] [21] 46

2.4.9 Phương pháp xác định độ ẩm [3] [10] 46

2.4.10 Phương pháp định lượng calcium [3] [10] 47

2.4.11 Định lượng đạm tổng số (phương pháp Kjeldahl) [3] [10] 48

2.4.12 Định lượng đạm formol (phương pháp Sorensen) [3] [10] 50

2.4.13 Phương pháp xác định đạm ammoniac [3] [10] 51

2.4.14 Phương pháp xử lý số liệu 53

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 54

3.1 Khảo sát thành phần hóa học của bột xương cá tra 54

3.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus và VK lactic 54

3.2.1 Bacillus 55

3.2.2 VK lacic 56

3.2.3 Kết quả định danh đến loài bằng sinh học phân tử 58

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease và acid của 2 chủng VK nghiên cứu 59

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens 59

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh

acid của Lactobacillus casei 69

3.4 Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens 79

3.4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước 80

3.4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy 81

3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 83

3.4.4 Ảnh hưởng của thời gian 84

3.5 Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei 85

3.5.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men 85

3.5.2 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 86

3.6 Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV 88

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90

4.1 Kết luận 90

4.2 Kiến nghị 90

TÀI LIỆU THAM KHẢO 92

PHỤ LỤC 98

DANH M ỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CCa2+ Hàm lượng calcium

HSTNđht Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

HSTP Hiệu suất thủy phân

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic 8

Hình1.2: Lactobacillus casei 10

Hình1.3: Lactobacillus bulgaricus 11

Hình 1.4: Lactobacillus brevis 12

Hình 1.5: Cá tra 7

Hình 1.6: Sữa giàu calcium 21

Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium 22

Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium 22

Hình 3.1: Bột xương cá tra 54

Hình 3.2: Hình thái KL của Bacillus (x4) 55

Hình 3.3: Hình thái tế bào của Bacillus (x100) 55

Hình 3.4: Bào tử của Bacillus (x100) 55

Hình 3.5: Bacillus có catalase dương tính 56

Hình 3.6: Vòng phân giải casein củaBacillus có hoạt tính protease 56

Hình 3.7: Hình thái KL của VK lactic (x4) 57

Hình 3.8: Hình thái tế bào của VK lactic (x100) 57

Hình 3.9: VK lactic có catalase âm tính 58

Hình 3.10: Định tính acid lactic bằng thuốc thử Uphermen 58

Hình 3.11: Vòng phân giải casein của Bacillus amyloliquefaciens khi được nuôi 60

cấy ở các khoảng thời gian khác nhau 60

Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của 60

Bacillus amyloliquefaciens 60

Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của 62

Bacillus amyloliquefaciens 62

Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của 63

Bacillus amyloliquefaciens 63

Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của 64

Bacillus amyloliquefaciens 64

Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của 66

Bacillus amyloliquefaciens 66

Hình 3.17: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens 67

Hình 3.18: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei 70

Hình 3.19: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến khả năng sinh acid của 71

Lactobacillus casei 71

Hình 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của 73

Lactobacillus casei 73

Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei 74

Hình 3.22: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei 75

Hình 3.24: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei 78

Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens 81

Hình 3.26: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến

quá trình thủy phân protein từ xương cá tra 82

Hình 3.27: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương

cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens 83

Hình 3.28: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương

cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens 85

Hình 3.29: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình

trích ly calcium từ xương cá tra 86

Hình 3.30: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá

tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei 87

Hình 3.31: Dịch xương cá tra 88

DANH M ỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Quá trình lên men lactic đồng hình (nét liền) và dị hình (nét đứt) 13

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu

TP giàu calcium và protein 28

Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng

sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens 31

Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng

sinh acid của Lactobacillus casei 33

Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein

từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens 35

Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của

xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei 36

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được 18

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của các phần phụ phẩm cá tra 19

Bảng 1.3: Hàm lượng protein trong một số loại TP thông dụng 24

Bảng 3.2: Đặc điểm sinh học của Bacillus 55

Bảng 3.3: Đặc điểm sinh học của VK lactic 56

Bảng 3.4: Mật độ tế bào Bacillus amyloliquefaciens trong giống các cấp 59

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của 60

Bacillus amyloliquefaciens 60

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của 61

Bacillus amyloliquefaciens 61

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của 63

Bacillus amyloliquefaciens 63

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của 4

Bacillus amyloliquefaciens 4

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của 65

Bacillus amyloliquefaciens 65

Bảng 3.10: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens 67

Bảng 3.11: Mật độ tế bào Lactobacillus casei trong giống các cấp 69

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei 70

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến khả năng sinh acid của 71

Lactobacillus casei 71

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của 72

Lactobacillus casei 72

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei 74

Bảng 3.16: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của Lactobacillus casei 75

Bảng 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh acid của 76

Lactobacillus casei 76

Bảng 3.18: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei 78

Bảng 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens 80

Bảng 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra 82

Bảng 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens 83

Bảng 3.22: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens 84

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình trích ly calcium t ừ xương cá tra 86

Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei 87

Bảng 3.25: Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV 88

M Ở ĐẦU

 Lí do chọn đề tài

Theo nghiên cứu của Viện dinh dưỡng Việt Nam, lượng calcium từ bữa ăn hằng ngày của người Việt Nam trung bình là 700mg Muốn cung cấp đủ calcium cho cơ thể thì lượng thức ăn phải đảm bảo từ 1.200 - 1.300mg calcium/ngày, thậm chí nhiều hơn trong một số trường hợp cần thiết Hiện nay, các thực phẩm (TP) giàu calcium chủ yếu nhập từ nước ngoài với giá thành cao Trong khi đó, các nguồn nguyên liệu TP giàu calcium tại Việt Nam rất nhiều, đặc biệt trong phế phẩm động vật như vỏ ghêu, vỏ sò, xương cá, xương gia súc, xương gia cầm, … đang bị bỏ phí, chưa được tận dụng và gây ô nhiễm môi trường (MT) Trong đó, phụ phẩm cá tra được xem như một nguồn tiềm năng cung cấp nguyên liệu giàu calcium và protein rất cần thiết cho con người Vì vậy, vấn đề xử lý phụ phẩm cá tra hiệu quả, kinh tế

và thân thiện với MT đang ngày càng trở nên cấp thiết

Những năm gần đây, việc tận dụng phụ phẩm cá tra đang được sự quan tâm đầu tư của các doanh nghiệp chế biến thủy sản nhằm chế biến ra những mặt hàng có giá trị gia tăng như: đầu, xương chế biến thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi, da

cá xuất khẩu sang châu Âu phục vụ công nghiệp TP, dược phẩm, Bên cạnh đó việc xử lý loại phụ phẩm này bằng phương pháp sinh học đang rất được quan tâm, đặc biệt là sử dụng VSV, vì đây là một trong những biện pháp thân thiện với môi trường nhằm tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng và giá trị dinh dưỡng cao

Từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật

chế biến xương cá tra thành nguyên liệu thực phẩm giàu calcium và protein”

 Mục đích của đề tài

Nghiên cứu điều kiện tối ưu để xử lý xương cá tra bằng tác dụng của VSV tạo

ra nguyên liệu TP giàu calcium và protein

 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng VK do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học – Viện Sinh học nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp

 Nhiệm vụ của đề tài

- Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra

- Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện MT nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

protease của Bacillus amyloliquefaciens và khả năng sinh acid của Lactobacillus

casei

- Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá

tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens

- Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra

(sau khi tách protein) bằng dịch lên men Lactobacillus casei

- Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra đã được xử lý bằng VSV

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 T ổng quan về vi sinh vật nghiên cứu

Bacillus cereus, Bacillus mensentericus, Loài Bacillus amylolyquefaciens có

quan hệ rất gần gũi với loài Bacilus subtilis là hai loài phụ của nó là Bacillus

licheniformis và Bacillus pumilus tạo nên nhóm Bacilus subtilis Vì vậy có khi người ta còn gọi Bacillus amyloliquenfaciens là Bacillus subtilis subsp

amyloliquefaciens Danh phá p chủng loại quốc tế của Bacillus amyloliquenfaciens

opt) từ 30 - 450C, một số chịu nhiệt lên tới 650C hoặc ưa lạnh với từ

50C - 250C nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34 – 370C Bacillus sinh

trưởng trong khoảng pH rộng từ 2 – 11 [41] Chúng sinh trưởng tốt ở pH = 7 [33] Ngoài ra, trong chi này chúng ta có thể gặp một số loài có thể phát triển ở những

MT đặc biệt khắc nghiệt như pH cực trị, nhiệt độ rất cao (một số chủng có thể sống

ở MT 1000

C trong 30 phút) [45] [65] hoặc rất thấp, và nồng độ muối rất cao mà ít sinh vật nào có thể chịu được là do chúng có khả năng hình thành nội bào tử (nha bào) tồn tại ở trạng thái “ngủ đông” trong thời gian dài [41] [52], và tái tổ hợp DNA bộ gen với DNA lạ [45] [61] Dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu trong phòng

thí nghiệm, Bacillus có thời gian thế hệ là 25phút [41]

* Về hình thái

KL khô, không màu hoặc màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra một lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi, lõm nhiều hay ít bám chặt vào môi trường thạch [5] [45] [65]

Tế bào hình que, kích thước 0.3 - 2.2 x 1.2 - 7µm [41], tế bào thường nối với nhau thành chuỗi có độ dài khác nhau hoặc tạo ra lớp riêng rẽ [45] [65] Bào tử có dạng hình cầu elip hay hình trụ tròn nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào và túi bào tử phồng hoặc không phồng, bào tử có kích thước 0.6 - 0.9 x 1.0 - 1.5µm [43] [68]

* Về sinh lý, sinh hóa

Bacillus là loại trực khuẩn Gram dương, phản ứng Gram của Bacillus có thể

thay đổi trong chu trình sống của nó, chỉ những tế bào còn non mới chắc chắc là Gram dương Chúng có sinh bào tử [43], khác với tế bào dinh dưỡng, vách bào tử mỏng, không bắt màu phẩm nhuộm được bao bọc bởi vỏ trong có cấu tạo từ glycan peptid và vỏ ngoài nên nó bị khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu, bền với nhiệt và các yếu tố phá hủy khác Tế bào khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao [1]

Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện Là

những sinh vật hóa dị dưỡng thu năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ, chúng có khả năng sử dụng chất hữu cơ do nhiều nguồn cơ chất khác nhau cung cấp như tinh bột, đường, protein đến chất béo, một số VK tự dưỡng không bắt buộc

(Bacillus schlegelli) Chúng có khả năng phát triển trong MT chỉ có CO2 và tạo ra ATP thông qua quá trình lên men butandiol cũng như amon hóa nitrate [36] [46]

Chu trình sống của Bacillus được chia ra làm 3 giai đoạn: tăng trưởng sinh dưỡng,

hình thành bào tử và nảy mầm Tăng trưởng tế bào sinh dưỡng xảy ra khi các chất dinh dưỡng dồi dào và tăng trưởng theo hàm số mũ Khi chất dinh dưỡng cạn kiệt chúng bắt đầu hình thành bào tử Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo một bào tử, bào tử này có khả năng chịu nhiệt, chịu tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm Vì vậy,

Bacillus có thể chịu được nhiều sinh cảnh khắc nghiệt như cát sa mạc, suối nước nóng, môi trường đất ở Bắc Cực và có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm [43] Tuy nhiên sự phát triển bào tử không phải là sự phát triển tùy chọn của tế bào sinh dưỡng mà nó cũng có thể theo những trình tự thay đổi khác nhau, việc biểu hiện các gen là cần thiết để đáp ứng lại các điều kiện bất lợi của MT hoặc tìm kiếm các chất dinh dưỡng khác và tăng cường khả năng cạnh tranh chống lại

các loài khác [39] Việc hình thành bào tử là một quá trình phức tạp tiêu tốn nhiều năng lượng, tế bào cần giảm nhu cầu sử dụng chất dinh dưỡng để đảm bảo đủ chất dinh dưỡng cho quá trình hình thành bào tử (Gonzalez – Pastor et al, 2003) Trong điều kiện đó, chúng có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme như amylase,

chitinase, hemicellulase, glucanase, lipase, protease, [43] [37] và các chất chuyển hóa sơ cấp như chất kháng sinh, inosinic acid, guanilic acid, nucleotide acid, các hợp chất thứ cấp, [1]

1.1.1.2 Một số ứng dụng và tác hại của Bacillus

* Ứng dụng của Bacillus

Bacillus được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như:

- Trong công nghiệp:

+ Bacillus có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme nên được ứng dụng nhiều trong sản xuất nhiều loại enzyme công nghiệp như được ứng dụng nhiều trong α - amylase, protease, phytase, có vai trò trong công nghệ thực phẩm như

amylase dùng để đường hoá tinh bột hay hệ enzyme của Bacillus subtilis được ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa và sản xuất enzyme công nghiệp Bacillus

subtilis có khả năng tổng hợp lysine khá cao (15 - 20%) từ tinh bột nên được ứng

dụng để sản xuất lysine, lên men đậu nành [38] Bacillus amyloliquefaciens được

thế giới sử dụng để sản xuất α – amylase và protease ở quy mô công nghiệp

+ Ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da Việc xử lý da bằng cách sử dụng enzyme là tốt nhất vì nó mang lại nhiều lợi thế: dễ kiểm soát, nhanh chóng và giảm được chất thải Xử lý bằng enzyme sẽ tiêu hủy các sắc tố không mong muốn,

từ đó có được da sạch [42] George và cộng sự (1995) sử dụng protease kiềm của

B amyloliquefaciens cho việc làm rụng lông và da

- Trong nông nghiệp: Do Bacillus có khả năng tạo bào tử, sinh các loài enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus

pyogenes, E coli, Salmonella, Vibrio sp, nên được sử dụng làm probiotic [25]

[35] Ví dụ như Bacillus subtilis bổ sung trong thức ăn chăn nuôi nhằm cải thiện tiêu

hóa, sức tăng trưởng, giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi [38] Yerra

Koteswara Rao và cộng sự (2006) đã nghiên cứu và chứng minh được

chủng Bacillus amyloliquefaciens B128 là một tác nhân kiểm soát sinh học đối với Botrylis elliptica (mầm bệnh màu xám mốc trên hoa huệ)

- Bảo vệ môi trường: Một số loài thuộc chi này có khả năng sinh protease và

cellulase với hoạt tính khá cao như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacien,

Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, người ta sử dụng chúng làm phân bón hữu cơ để thủy phân protein thực vật và động vật có trong rác hữu cơ hoặc sử dụng để xử lý rác thải [38][23] Ngoài ra, chúng còn là một trong những thành phần của sản phẩm dùng để xử lý môi trường nuôi tôm và thức ăn bổ sung cho tôm Thành phần của các sản phẩm này là các VSV (Pseudomonas

fluorescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Lactic bacteria,

Rhodotorula mucilaginosa, Rhodosporidium toruloides) mà trong đó mỗi loại giữ một chức năng riêng và tổng của các sản phẩm là hệ VSV có ích, giúp cho con tôm phát triển khoẻ mạnh, chống lại được một số bệnh và điều kiện khắc nghiệt [50]

- Trong y dược: Bacillus được ứng dụng tạo ra nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu như: Bacillus subtilis được đóng thành từng ống 10ml hoặc gói dạng bột gọi là

subtilin (Humfeld and Feustel, 1943) để điều trị bệnh tiêu chảy cho người do Coliforms gây ra, bệnh đường ruột do lị trực trùng hoặc dùng để đắp vết thương ngoài da [38] Từ Bacillus subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh như Subtilin

(Humfeld and Feustel, 1943), Eulycin (Johnson and Durdon, 1946), Bacillomin

(Shtikell and Poplavskii, 1955)

* Tác hại của Bacillus

- Đa số các loài thuộc chi Bacillus là vô hại, một số có hại là do chúng có khả

năng tạo bào tử Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là:

+ Bacillus subtilis có thể sống sót trong độ nóng rất cao đó là tác nhân chính làm bánh mì bị hư, gây hỏng một số thực phẩm đồ hộp làm thực phẩm đồ hộp có mùi thối chua rất khó chịu, là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa bánh ngọt,

chocolate, kẹo có nhân được bảo quản khi khí hậu nóng, gây bệnh “chảy nhớt khoai tây” và “chảy nhớt bánh mì” được Laurent phát hiện đầu tiên 1885 [52]

+ Bacillus coagulans có thể phát triển ở mức pH = 4.2 và gây ra vị chua nặng

ở thức ăn đóng hộp và các thức ăn có tính acid mà bình thường khống chế sự phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất

- Ngoài ra bào tử của loài Bacillus cereus phân bố khắp nơi trong đất, không

khí, thường phát triển trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm [26]

Giống: Enterococcus

Họ: Leuconoscaceae

Giống: Leuconostoc

Ho: Streptococcaceae

Giống: Streptococcus, Lactococcus

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic [47]

* Môi trường sống

Trong tự nhiên, VK lactic thường gặp trong đất, nước, không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật (rau, quả, ) và các sản phẩm lên men (sữa chua, nem chua, dưa muối chua, .) Chúng tồn tại trong đường ruột (có nhiều VK lactic thuộc

Enterococcus và Lactobacillus , trong đó VK Lactobacillus chiếm số lượng nhiều

nhất) và miệng của cơ thể người và động vật [20]

VK lactic không thể phát triển được trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose, NH4+ Đa số chúng cần hàng loạt vitamin và các acid amin

Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của VK lactic ưa ấm là 25 - 350C, ưa nhiệt 40 -

450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C Khi gia nhiệt khoảng 60 - 800C thì hầu hết chúng

bị chết sau 10 - 30phút

* Đặc điểm hình thái

KL tròn, nhỏ, màu trắng sữa, nhẵn bóng, lồi trên bề mặt thạch, có mép đều hoặc rìa xung quanh bám vào môi trường thạch [17]

Tế bào có dạng hình que (trực khuẩn) kích thước 1 - 8µm, xếp thành cặp hay chuỗi với chiều dài khác nhau; hoặc hình cầu (cầu khuẩn) kích thước 0.5 - 1.5 µm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi [20]

* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

VK lactic là VK Gram dương (tế bào còn non cho kết quả Gram dương, và trở thành Gram âm khi về già, không sinh bào tử (tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số giống trong họ VK lactic có khả năng tạo bào tử) và hầu hết không có khả năng di động

VK lactic không hô hấp do không có cytochrom và catalase âm tính Là VK có khả năng sống được trong MT có oxy và không có oxy Trong điều kiện hiếu khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2,

H2O và tạo ra 36 hoặc 38 ATP; trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP, do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng sinh Trong điều kiện hiếu khí sinh khối của VK phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí LAB có khả năng tổng hợp peroxydase rất mạnh, chúng phân giải

H2O2 để tạo H2O và O2 để phát triển

1.1.2.2 Phân loại

Việc phân loại VK lactic khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái học, chế độ

và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm hoặc phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được

sử dụng trong phân loại

VK lactic trao đổi chất chủ yếu bằng quá trình lên men VK lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, disaccharid, protein tan, pepton, Phần lớn chúng không lên men tinh bột và các polisaccharid khác Khi nghiên cứu về khả năng lên men lactic từ nguyên liệu chứa đường, người ta thấy có hai nhóm VK

lactic chuyển hóa đường hoàn toàn khác nhau: VK lactic đồng hình và VK lactic dị

hình [20]

* VK lactic đồng hình

- Lactobacillus casei [6] [20] [67]

+ Là những trực khuẩn nhỏ, có kích

thước rất ngắn Chúng có thể tạo thành chuỗi,

không chuyển động, Gram dương

+ Yếm khí tuỳ tiện; lên men tốt glucose,

maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8% -

1% axit lactic; và không tạo catalase

- Lactobacillus bulgaricus [6] [20] [51]

+ Là trực khuẩn có kích thước rất dài, liên

kết với nhau tạo thành chuỗi, Gram dương, không

có khả năng di chuyển

+ Nhiệt độ phát triển tối ưu t0

opt từ 45 -

620C

+ Chúng có khả năng lên men glucose,

lactose tạo độ axit cao (3,7% axit lactic) Không

lên men được xylose, arabinose, sorbose, dulcitol,

mannitol, dextrin, inulin

+ Thường phát triển t0

opt từ 250

C - 300C

+ Lên men glucose, galactose Khi lên men sinh ra rất ít hoặc không sinh

CO2 và có thể tạo ra một lượng đáng kể ethanol, acid acetic, acid formic, … (Gunsalus and Niven, 1942)

* VK lactic dị hình

- Lactobacillus pasteurianus [20]

+ Là trực khuẩn Gram dương có kích thước 0.5 - 1.0µm x 7.0 - 35µm Trong

tự nhiên chúng tồn tại riêng rẽ, không di động

+ Nhiệt độ thích hợp là 290

C - 330C

+ pH thích hợp 8.0

+ Có khả năng lên men được arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, rafinose, trehalose, mannitol, dextrin Trong quá trình lên men tạo một loạt sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic

- Lactobacilus brevis [20] [54]

+ Là trực khuẩn Gram dương, kích

thước 0.7 - 1.0µm x 2.0 - 4.0µm, chúng liên

kết với nhau thành chuỗi, không di động

+ Chúng có nhiều trong sữa, kefia,

dưa chua Trong quá trình phát triển, chúng

có thể sử dụng lactat calcium như nguồn

+ Chúng không phát triển được ở nồng độ NaCl 4%

+ Khi lên men đường tạo acid acetic, diacetyl, CO2

+ Chúng có khả năng tạo các chất kháng khuẩn

1.1.2.3 Quá trình lên men lactic [6] [20] [30]

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường tạo acid lactic dưới tác

dụng của VK lactic Do các VK lactic khác nhau tham gia có cơ chế khác nhau và

sản phẩm chính phụ khác nhau nên lên men lactic được chia thành hai loại: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình

Sơ đồ 1.1: Quá trình lên men lactic đồng hình (nét liền) và dị hình (nét đứt)

[51]

(1) lactate dehydrogenase; (2) alcohol dehydrogenase

* Lên men lactic đồng hình

Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic, chiếm 90 - 98% tổng sản phẩm lên men Ngoài ra còn một lượng nhỏ acid bay hơi, rượu ethanol và các sản phẩm khác

Phương trình tổng quát lên men lactic đồng hình:

C6H12O6 → 2CH3-CHOH-COOH Các VK lên men lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường Embden - Mayerhof, nhưng chúng không có đủ enzyme carboxylase nên acid pyruvic không

Glucose

ATP

ADP ATP

ADP

Acetaldehyde Glucose - 6 - P

-ATP

ADP

NADH NAD+

NAD+2NAD+

2NADH

4ADP 4ATP 2H2O

bị phân giải tiếp tục mà chỉ nhận hydro để tạo thành acid lactic, một phần nhỏ acid lactic bị decarboxyl để tạo một lượng nhỏ sản phẩm phụ nói trên

Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghệ thực phẩm, đặc biệt là trong công nghệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai

Các chủng VK tham gia trong kiểu lên men này chủ yếu là hai giống:

Lactobacillus (Lactobacillus bulgaricum, Lactobacillus plantarum, …) và

Streptococcus (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, …)

* Lên men lactic dị hình

Quá trình lên men tạo sản phẩm đa dạng, ngoài acid lactic còn hang loạt các sản phẩm khác với tỉ lệ khá cao như: acid lactic 40%, acid sucxinic và ethanol 20%, acid acetic 10% , các chất khí (CO2, H2) 20%, …

Phương trình tổng quát lên men dị hình:

C6H1206 → CH3-CHOH-COOH + COOH-(CH)2-COOH + CH3COOH

+ C2H2OH + CO2 + H2 … Quá trình lên men dị hình là sự lên men khá phức tạp, những VK lên men kiểu này có men decarboxylase để phân huỷ acid pyruvic ra CO2 và CH3CHO Tuy nhiên enzyme này không phân giải hết được acid pyruvic, nên một phần acid này được chuyển thành acid lactic và acid sucxinic

Trong hệ VK lactic dị hình, thiếu các enzyme chủ yếu của con đường Embden

- Mayerhof, đó là adolase và triosephosphate isomerase nên glucose sẽ chuyển hóa theo chu trình pentosephosphate qua hàng loạt sản phẩm trung gian để tạo xilulose

5-phosphate, sau đó bị phân ly thành aldehyde và acetyl phosphate Từ aldehyde, phosphoglycerinic chuyển tiếp tạo thành acid succinic và acid lactic, còn acetyl phosphate tiếp tục chuyển hóa theo hai hướng để tạo ethanol và acid acetic

Quá trình lên men dị hình tạo nhiều sản phẩm nên việc tách và cô lập các sản phẩm khác nhau rất tốn kém Tuy nhiên quá trình này cũng có vai trò rất quan trọng trong việc chế biến một số loại thực phẩm VK lactic dị hình có thể làm cho sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn

Các chủng VK chủ yếu lên men lactic dị hình: Bacterium aeogenes, Bacterium

pentoacetium, Lactobacillus brevis,

1.1.2.4 Một số ứng dụng và tác hại của VK lactic

VK lactic là nhóm VK có rất nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia vào tất cả hoạt động sống của con người nên được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:

* Công nghệ thực phẩm

- Bacteriocin: Việc lên men thực phẩm bằng cách sử dụng VK lactic là phương pháp bảo quản truyền thống dựa vào sự đối kháng các loại VSV khác nhau Một trong những đặc điểm quan trọng của VK lactic là khả năng tạo các hoạt chất có khả năng kháng khuẩn gọi là bacteriocin (Klaenhammer, 1987) [49] Một vài loại

bacteriocin từ VK lactic như Nisin (Lactococcus lactis subsp lactis ATCC 11454), Pediocin A (Pediococcus pentosaceus FBB61 và L - 7230), Pediocin AcH

(Pediococcus acidilactici H), Leucocin (Leuconostoc gennlidum), Các

bacteriocin có khả năng kìm hãm sự phát triển của các VK gây bệnh hay gây hư

hỏng thực phẩm như Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus spp,

Enterococcus spp [48]

- Probiotics: là những VSV sống mà khi đưa vào cơ thể người hay động vật nó

có những tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ và làm tăng khả năng hoạt động hệ VSV của vật chủ (Hevenaar và Huis in’t Veld, 1992) Một số VK lactic được sử

dụng như probiotics là: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei,

Lactobacillus casei subsp rhamnosus, Streptococcus salivarius subsp thermophilus, (Conway, 1996)

- Trong quá trình lên men, VK lactic có khả năng tạo ra acid lactic và acid acetic cùng với một số loại acid hữu cơ khác Chính vì thế chúng được ứng dụng để sản xuất dưa chua, sản xuất tương, sản xuất đậu phụ, sản xuất các sản phẩm lên men

từ sữa,

* Trong y dược

- VK lactic được dùng trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất sản phẩm mang tên là Biolactyl chuyên trị tiêu chảy bằng VK lactic [20] Có nhiều

nghiên cứu để chữa bệnh tiêu chảy, kết quả cho thấy chủng Streptococcus

boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng

Lactobacillus acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh

erythromycin (D'Souza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006) Tính hiệu quả của phòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng VSV được sử dụng và liều lượng, có thể giảm đến 50% mức độ của bệnh Các loại thực phẩm bổ sung VK

lactic được dùng điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu chảy cấp, giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây tiêu chảy cấp ở trẻ em và tiêu ở người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002)

- Mặc dù vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên VK lactic được cho là có một

số hiệu ứng có lợi cho chức năng miễn dịch VK lactic có thể bảo vệ chống lại các mầm bệnh bằng sự ức chế cạnh tranh báo hiệu cho tế bào chủ làm giảm đáp ứng

viêm; tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr và Martha, 2003); tăng số lượng tế bào plasma sản xuất IgA - kháng thể chính trong cơ thể; hoạt hóa các đại thực bào cũng như tăng tỷ lệ lympho - T (Reid et al., 2003), Ouwehand et al., 2002); kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (O'Toole và Cooney, 2008)

- VK lactic ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, một biến chứng thường gặp khi

dùng kháng sinh Thuốc kháng sinh được cho là làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái "tắt" trong khi VK lactic lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch và nhiều hơn nữa có thể nhanh chóng phản ứng với lây nhiễm mới

* Một số ứng dụng khác

- VK lactic được ứng dụng trong công nghệ sản xuất acid lactic Acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo và các loại muối lactate (các loại lactat kim loại được sử dụng trong thành phần của một số

mỹ phẩm chăm sóc da như punosal và của hãng mỹ phẩm Punac có tác dụng chống lại các VSV có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da) [20]

- Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi [6]

Ngoài mặt có lợi ra, trong một số ngành công nghiệp quá trình lên men lactic lại rất có hại Nếu bị nhiễm khuẩn lactic thì quá trình sản xuất rượu vang, rượu, nước giải khát, đồ hợp, sản xuất đường, mật tinh bột bị ảnh hưởng nghiêm trọng

Do đó, phải dùng nhiều phương pháp khác nhau để chống sự hư hỏng này [18]

1.2 Gi ới thiệu về cá tra

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được

Tổng năng lượng

cung cấp

(Calori)

Chất đạm (g)

Tổng lượng chất béo (g)

Chất béo chưa bão hòa (có DHA, EPA) (g)

Cholesterol (%)

Natri (mg)

Trong thành phần dinh dưỡng của cá tra có chứa các axit béo chưa bão hoà Các chất này rất hữu ích trong việc bảo vệ màng tế bào và giúp làm giảm Cholesterol trong máu, từ đó sẽ làm giảm các bệnh tim mạch Bên cạnh đó, trong cá tra còn có DHA (acid docohexanoic) và EPA (acid écosapentaenoic) hay còn gọi là

Omega - 3 có thể giúp làm giảm hàm lượng triglyceride cao trong máu, một yếu tố gây nên bệnh tim Theo Hiệp hội Tim Hoa Kỳ, chất béo Omega - 3 giúp bảo vệ cơ thể chống lại chứng rối loạn nhịp tim, từ đó giảm nguy cơ đột tử Ngoài ra, chất béo

Omega - 3 còn giúp ngăn ngừa quá trình xơ cứng động mạch (là nguyên nhân dẫn đến chứng xơ vữa động mạch), làm giảm nguy cơ bị lão hóa não, tăng cường hoạt động của trí nhớ, [64]

1.2.3 Tình hình s ử dụng phụ phẩm cá tra

Trong quy trình sản xuất cá tra philê đông lạnh xuất khẩu, người ta chỉ lấy phần nạc của cá, các bộ phận còn lại như da cá, mỡ cá, xương cá, nội tạng, … chiếm trên

dưới 70% khối lượng nguyên liệu, được bán với giá rất rẻ [60]

Trong khi đó, theo kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Lan Chi và cộng sự (2009) các phần của phụ phẩm cá tra có hàm lượng protein cao (đầu tới 42,68%),

xương sống, đuôi, vây lại có hàm lượng tro và calcium khá cao

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của các phần phụ phẩm cá tra

- Bột cá làm nguyên liệu cho thức ăn chăn nuôi

- Mỡ cá chế biến thành dầu cá bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Ngoài ra còn được dùng để sản xuất biodiesel, một nguyên liệu thân thiện với môi trường

- Chất khoáng (calcium, phosphor) từ xương bổ sung vào thực phẩm cho động vật nuôi

- Gelatin, collagen từ da cá được sử dụng trong ngày dược phẩm và mỹ phẩm

- Thu nhận enzyme từ nội tạng cá (Kim và Mendis (2006), Shahidi (2007), Nguyễn Thị Yến (2006))

1.3 T ổng quan về TP giàu calcium và protein

1.3.1 Gi ới thiệu về calcium

* Vai trò của calcium [53]

Calcium là một khoáng chất có nhiều nhất, chiếm khoảng 1.5 - 2% thể trọng Trong cơ thể con người 99% calcium tồn tại trong xương, răng, móng, 1% tồn tại

trong máu, trong tổ chức tế bào và dịch ngoài tế bào nhưng có nhiều nhiệm vụ rất quan trọng

Vai trò chính yếu của calcium là phối hợp với sinh tố D để cấu tạo bộ xương

và hàm răng vững chắc Bên cạnh đó calcium cũng đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống các enzyme, sự co cơ, phóng thích chất dẫn truyền thần kinh, duy trì nhịp tim bình thường, quá trình đông máu, … đều chịu ảnh hưởng của calcium

Nhu cầu calcium khác nhau theo từng lứa tuổi Theo tổ chức y tế thế giới WHO, nhu cầu calcium tối thiểu của cơ thể con người:

- Trẻ sơ sinh: 300 - 400mg/ngày

- Nhi đồng: 600 - 800 mg/ngày

- Thanh thiếu niên: 1000 mg/ngày

- Người lớn 24 - 50 tuổi: 800mg/ngày

Người cao tuổi, phụ nữ có thai: 1200 mg - 1500 mg/ngày

Theo Walloc (1991), nếu ăn uống thiếu calcium con người có thể bị mắc 147 bệnh Vì thế, calcium là khoáng chất cần thiết cho sự sống

* Khả năng đồng hóa của calcium [12][57]

Calcium là nguyên tố khó đồng hóa bởi cơ thể Độ đồng hóa của nó phụ thuộc vào mối tương quan giữa những hợp phần khác của thức ăn như chất béo, chất xơ, magiesium, phospho Vitamin D là chất điều hòa đồng hóa calcium

Chất béo: điều kiện thuận lợi để hấp thụ calcium tốt khi tỉ lệ calcium ứng với 1g chất béo có trong thức ăn là 0.04 - 0.08g Thừa hay thiếu chất béo đều không tốt,thiếu chất béo thì sẽ chuyển toàn bộ calcium thành muối calcium của chất béo, thừa chất béo thì không đủ acid mật (inozitphosphoric, oxalic) để chuyển hóa muối calcium của acid béo thành phức hòa tan mà cơ thể có thể hấp thụ được Do đó, phần lớn sẽ thải ra ngoài cùng với phân

Chất xơ: Việc hấp thu calcium có thể thay đổi tùy thuộc vào bản chất, nguồn gốc của chất xơ Nhiều loại chất xơ từ các loại rau xanh, đậu quả, quả có màu vàng, chuối, không ảnh hưởng tới việc hấp thu calcium Song ngược lại, chất xơ trong

vỏ lúa mạch, vỏ ngũ cốc lại làm giảm hấp thu của calcium Chất xơ khi kết hợp các thành phần khác của thức ăn như phytat và oxalat cũng sẽ làm giảm sự hấp thu

calcium thức ăn

Magnesium: thừa magnesium trong khẩu phần ăn cũng ảnh hưởng xấu đến sự hấp thụ calcium Để hòa tan muối calcium cũng như muối magnesium đòi hỏi phải kết hợp chúng với acid muối mật, do đó muối magnesium càng nhiều thì acid mật còn lại để kết hợp với muối calcium càng ít, vì thế sẽ làm giảm quá trình hấp thụ calcium của cơ thể

* Nguồn cung cấp calcium

Theo các nhà nghiên cứu thì nguồn thức ăn có calcium tốt nhất là sữa và các chế phẩm từ sữa Sữa không chỉ chứa nhiều calcium mà cơ thể còn dễ hấp thu Bên cạnh đó, rau xanh và các loại đậu, đặc biệt là đậu tương, vừng, hạt dưa, rong biển, tôm, cua, sò huyết là những thực phẩm chứa nhiều calcium.[61] Trong bột xương

và vỏ trứng lượng calcium chiếm đến 20% và khả năng hấp thụ lên tới 70%, chính

vì vậy đây cũng là thực phẩm tốt dành cho những người thiếu calcium

Hình 1.6: Sữa giàu calcium [56] [69]

Người ta còn có thể bổ sung calcium cần thiết cho cơ thể dưới dạng viên thuốc, dịch hoặc sử dụng thực phẩm có bổ sung calcium Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng calcium thông qua thực phẩm có lợi hơn là thông qua uống viên calcium, vì hấp thụ tốt hơn và tránh hiện tượng lắng đọng tạo sỏi thận [53]

Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium [54] [62] [66]

Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium [71]

1.3.2 Giới thiệu về protein

Protein (Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptid (gọi là chuỗi polypeptid) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein

* Vai trò dinh dưỡng: protein là hợp phần chủ yếu, quyết định toàn bộ các đặc

trưng của khẩu phần thức ăn [59] [63]

- Cung cấp các nguyên liệu cho sự tạo máu, bạch huyết, hormone, enzyme, kháng thể, … Cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặc biệt vitamin và chất khoáng

- Là nguồn năng lượng cho cơ thể: đáp ứng 10 - 15% năng lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4Kcal Về nhiệm vụ cung cấp năng

lượng có thể thay thế protein bằng các chất dinh dưỡng khác nhưng về mặt tạo hình không có chất dinh dưỡng nào có thể thay thế

- Protein chiếm 19% trọng lượng cơ thể

+ Protein là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống, chúng giữ vai trò quan trọng trong sự phát triển, duy trì sự sống và phục hồi của tế bào và các

mô

+ Khi thiếu protein trong chế độ ăn hằng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu cho sức khỏe như suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn (đối với trẻ em), giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đỡ của cơ thể đối với một số bệnh

+ Thiếu protein sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều

cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh

+ Thiếu protein cũng sẽ làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái của xương (lượng calcium giảm, lượng magnesium tăng cao) Do vậy mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong thức ăn cho mọi lứa tuổi

* Cơ sở của quá trình thủy phân protein [31]

Sự thủy phân protein cũng như mọi phản ứng hóa học khác đều là sự trao đổi điện tử giữa các nguyên tử nhất định của các phân tử phản ứng Việc thủy phân các phân tử dẫn đến làm đứt liên kết peptit nối nguyên tử carbon của một gốc acid amin này với nguyên tử nitơ của gốc kia và các nhóm amin được giải phóng theo phương trình:

R C O

H

H2N C

N CH COOH

R O H

+

C H

H 2 N H COOH

* Nguồn protein trong TP [15]

Hàm lượng protein trong các thức ăn không giống nhau

- TP có nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều

về số lượng, cân đối về thành phần và hàm lượng các acid amin thiết yếu

- TP có nguồn gốc thực vật (đậu nành, các loại đậu khác, …) là nguồn protein quan trọng Hàm lượng acid amin thiết yếu cao trong đậu nành còn các loại đậu khác thì hàm lượng acid amin thiết yếu không cao, sự cân đối về thành phần các acid amin thiết yếu thấp hơn protein có nguồn gốc động vật

Bảng 1.3: Hàm lượng protein trong một số loại TP thông dụng

Tên thực

phẩm Lượng protein (g/100g)

Tên thực phẩm

Lượng protein (g/100g)

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên v ật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng VK do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

Cà chua, bắp mỹ, giá, đậu nành, nước mắm 350N, agar, sucrose mua tại chợ

An Đông (34 - 36 An Dương Vương phường 9 - Quận 5 - TP Hồ Chí Minh)

2.1.3 Hóa ch ất

D - glucose, peptone, cao nấm men, cao thịt, casein, peptone, CH3COONa,

K2HPO4, MnSO4.4H2O, Amonium citrate, Tween 80, NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaCl, FeSO4.7H2O, H2O2, HCl đặc, NaOH, acid trichloracetic,

Na2HPO4, FeCl3, Trilon B (EDTA), H2SO4 đặc, CuSO4, K2SO4, KCN, tyrosin, phenol, murexid, crystal violet, lugol, fuschin, xanh metylen, folin, phenolphthalein, metyl đỏ

2.1.4 Thi ết bị và dụng cụ

Các thiết bị và dụng cụ do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư Phạm TP Hồ Chí Minh cung cấp gồm:

2.1.4.1 Thiết bị

Tủ sấy (Memmert - Đức), cân phân tích điện tử (Scientech - Đức), nồi hấp vô

trùng (Huxley - Đài Loan), tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ ấm (Binder - Đức), tủ lạnh (National - Nhật Bản), máy đo pH (Hana - Trung Quốc), máy lắc (Gerhardt - Đức), máy li tâm (Hettich - Đức), bể lắc nhiệt (Grant - Anh), kính hiển vi (Olympus

- Nhật), máy chụp ảnh kỹ thuật số (Olympus - Nhật), máy khuấy từ, máy chưng cất đạm (Gerhardt, Đức), máy phá mẫu (Gerhardt, Đức), máy trung hòa khí (Gerhardt, Đức), máy đo quang phổ UV (Amersham Biosciences, Thụy Điển), máy lắc ống nghiệm, nồi nấu môi trường, bếp điện

2.1.4.2 Dụng cụ

Bình tam giác (50ml, 100ml, 250ml), ống nghiệm, đĩa Petri, cốc thủy tinh (100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), ống đong (10ml, 100ml, 500ml), ống ly tâm, bình định mức (50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), bình hút ẩm, đèn cồn, diêm quẹt, que gạt, que cấy (que cấy vòng, que cấy nhọn), khoan nút chai, pipetman (0,1ml, 1ml, 5ml, 10ml), thước đo, giấy lọc, khăn lọc, bông mỡ, bông thấm nước, lame, lamel,

2.2 Môi trường nghiên cứu

MT1 (MT giữ giống Bacillus amyloliquefaciens: MT cá peptone): nước mắm

350N 30ml, peptone 10g, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml [7]

MT2 (MT giữ giống Lactobacillus casei: MT MRS (de Man, Rogosa and Sharp)): D - glucose 20g, peptone 10g, cao nấm men 5g, cao thịt 10g, CH3COONa

5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g, Tween

80 1ml, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml [22]

MT3 (MT nhân giống Bacillus amyloliquefaciens và Lactobacillus casei, khảo sát hoạt tính và hoạt độ protease: MT sữa đậu nành): sữa đậu nành 1000ml (đậu nành 100g ngâm trương nước từ 4 - 6 giờ → xay nhuyễn → lọc → bổ sung nước cất đến 1000ml), sucrose 20g

MT4 (MT định tính khả năng sinh protease): pepton 5g, cao nấm men 2.5g,

casein 10g, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml [27]