Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu TP giàu calcium và protein
Dịch nuôi cấy
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên
khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus
amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens
Thủy phân Phụ phẩm cá tra
Bột xương cá
tra Phân tích sinh hóa
Nguyên liệu TP giàu Calcium và protein
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei Dịch lên men Lactobacillus casei Xương đã tách protein Ngâm trích ly calcium Xác định các điều kiện thích hợp Dd protein
2.3.2 Bố trí thí nghiệm
2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra
Tiến hành xác định các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lượng Ca2+, Nitrogen tổng số (NTS), protein tổng, Nitrogen formol (NF), Nitrogen ammoniac (NNH3).
2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens
Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1
- Chuẩn bị các bình tam giác (50ml) chứa 5ml MT3 đã vô trùng.
- Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang bình MT đã chuẩn bị ở trên.
- Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2
- Chuẩn bị bình tam giác (250ml) chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên.
- Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24giờ.
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens
* Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cấy 1% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy: 24giờ, 48giờ, 72giờ thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn thời gian thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các tỷ lệ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các nồng độ sucrose: 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn nồng độ sucrose thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT
Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định pH ban đầu của MT thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các nhiệt độ: 300C, 350C, 400C, 450C. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Động thái học của quá trình lên men
Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các các điều kiện đã chọn. Cứ 6giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hoạt độ protease.
Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens
2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei
Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1
- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT3 đã vô trùng.
- Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang ống nghiệm MT đã chuẩn bị ở trên.
- Ủ ở nhiệt độ 430C trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2
- Chuẩn bị bình tam giác chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Ủ ở nhiệt độ 430C trong 24giờ.
Bacillus amyloliquefaciens Tỷ lệ giống/MT 1% 2% 3% 4% 5% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ pH ban đầu 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 300C 350C 400C 450C Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5% Hoạt độ protease
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei
* Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cấy 5% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT2 dịch thể. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 24giờ, 48giờ, 72giờ, 96giờ, 120giờ thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn thời gian thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Ảnh hưởng của MT nuôi cấy
Cấy 5% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT (gồm các loại MT khác nhau: MT5, MT6, MT7, MT8). Sau thời gian nuôi cấy đã chọn ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn MT thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Cấy vào bình tam giác chứa 50ml MT với các tỷ lệ giống: 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho lượng acid cao để nghiên cứu thí nghiệm tiếp theo.
* Ảnh hưởng của nồng độ surose
Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT với các điều kiện đã chọn với các nồng độ surose: 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10%. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Chọn nồng độ surose thích hợp cho lượng acid cao để nghiên cứu thí nghiệm tiếp theo.
* Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT
Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT với các điều kiện đã chọn, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ phòng thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Xác định pH MT ban đầu thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
Cấy giống vào bình tam giác chứa 50 ml MT với các điều kiện đã chọn, nuôi ở các nhiệt độ: 200
C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C. Sau thời gian thu dịch lên men và xác định hàm lượng acid. Xác định nhiệt độ thích hợp cho lượng acid cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Động thái học của quá trình lên men
Nuôi VK với các điều kiện thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trên. Cứ 12giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hàm lượng acid.
Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei
Chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp Hàm lượng acid Lactobacillus casei Tỷ lệ giống/MT 1% 3% 5% 7% 10% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ pH ban đầu 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 200C 250C 300C 350C 400C 450C Môi trường MT5 MT6 MT7 MT8 Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5%
2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens
Với điều kiện tối ưu để thu dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens cho hoạt độ protease cao đã chọn ở những thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân xương cá tra bằng dịch nuôi cấy
Bacillus amyloliquefaciens. * Tỷ lệ nước
Bổ sung 3% dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens và các tỷ lệ nước khảo sát như sau: 0%, 10%, 30%, 50%, 70%, 100% vào xương cá tra, tiến hành thủy phân trong 24giờ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra tỷ lệ nước tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Tỷ lệ dịch nuôi cấy
Với tỷ lệ nước tối ưu đã xác định, xương cá tra được thủy phân với tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens khác nhau: 1%, 3%, 5%, 7%, 10% trong 24giờ ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra tỷ lệ dịch nuôi cấy tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Nhiệt độ thủy phân
Với tỷ lệ nước và dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đã xác định, tiến hành thủy phân xương cá tra trong 24giờ ở các nhiệt độ: 400
C, 450C, 500C, 550C. Sau thời gian thủy phân tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra nhiệt độ tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Thời gian thủy phân
Với các điều kiện đã xác định ở các thí nghiệm trên, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens từ 4 - 40giờ. Sau các khoảng thời gian khảo sát tiến hành lấy mẫu đo các chỉ số đạm để
tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein
từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens
Thủy phân bằng dịch lên men Bacillus amyloliquefaciens
Bột xương cá tra Tỷ lệ dịch lên men/cơ chất 1% 3% 5% 7% 10% Tỷ lệ nước/cơ chất 0% 10% 30% 50% … Nhiệt độ 300C 350C 400C 450C 500C 550C Thời gian 0 giờ 4 giờ 8 giờ 12 giờ 16 giờ 20 giờ … Đo các chỉ số đạm Hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan Chọn điều kiện thủy phân thích hợp
2.3.2.5 Thí nghiệm 5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei
Với điều kiện tối ưu để thu dịch lên men Lactobacillus casei cho hàm lượng acid cao đã chọn ở những thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra đã tách protein bằng dịch lên men Lactobacillus casei.
Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của
xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei
Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ … Xương cá tra đã tách protein
Ngâm trích ly calcium bằng dịch lên men Lactobacillus casei
Tỷ lệ dịch nuôi cấy/cơ chất 1:1 1.5:1 2:1 2.5:1 3:1 Xác định hàm lượng calcium Chọn điều kiện trích ly thích hợp
* Tỷ lệ dịch lên men
Xương cá tra đã tách protein được ngâm bằng dịch lên men Lactobacillus casei với các tỷ lệ 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3 trong 72giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành thu mẫu để xác định hàm lượng calcium. Từ đó, chọn ra tỷ lệ dịch lên men tối ưu để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Thời gian trích ly
Với tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đã xác định, tiến hành khảo sát thời gian ngâm trích ly calcium từ xương cá tra từ 0 - 120giờ. Sau các khoảng thời gian khảo sát tiến hành lấy mẫu xác định hàm lượng calcium. Từ đó, chọn ra thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
2.3.2.6 Thí nghiệm 6: Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calcium bằng VSV
Tiến hành xác định các chỉ tiêu về hàm lượng Ca2+
, NTS, protein tổng, NF, NNH3của dịch xương cá tra sau thủy phân protein và trích ly calciumbằng VSV.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp cấy truyền giữ giống [32] [38]
Nguyên tắc
Trong điều kiện lạnh sẽ làm giảm quá trình hô hấp và trao đổi chất ở VSV. Đồng thời ngăn cản sự sinh trưởng của chúng để đảm bảo không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống.
Cách tiến hành
Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa MT giữ giống đã vô trùng.
Dùng que cấy vòng vô trùng, cấy zích zắc trên bề mặt thạch nghiêng.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 - 48giờ cho tạo sinh khối, sau đó bảo quản ống giống ở nhiệt độ 40C.
Giống được cấy truyền hàng tháng.
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn
Quan sát và miêu tả KL của VK về: - Khả năng phát triển của KL. - Màu sắc KL
- Đặc điểm hình thái, kích thước và tính chất bề mặt KL.
2.4.2.2 Phương pháp nhuộm Gram [20] [32] Nguyên tắc
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà vi khuẩn được chia làm 2 nhóm:
- Nhóm vi khuẩn Gram dương (G+): vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn etylic.
- Nhóm vi khuẩn Gram âm (G-): không giữ nguyên màu của thuốc nhuộm khi xử lý bằng cồn etylic và bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung.
Cách tiến hành * Làm tiêu bản
- Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn.
- Dung bút bông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lam để đánh dấu vết khuẩn phía trên lam.
- Nhỏ dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vòng tròn.
- Dung que cấy khử trùng để nguội đặt nhẹ KL (VK nuôi cấy từ 24 - 48giờ trong ống thạch nghiêng), đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam.
- Dàn mỏng thành vết bôi, cố định vết bôi bằng cách để khô trong không khí hoặc hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn.
* Nhuộm tiêu bản
- Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U. - Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.
- Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để từ 1-2 phút, rửa bằng nước cất.
- Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa bằng nước cất.
- Tẩy màu bằng cồn 960từ 15-20 giây. Rửa bằng nước cất.
- Đặt miếng giấy lọc lên, nhỏ dung dịch Fuschin trong 1 phút, rửa bằng nước cất.
- Làm khô tiêu bản và quan sát tiêu bản bằng vật kính dầu.
2.4.2.3 Phương pháp nhuộm bào tử [20] [32] Nguyên tắc
Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ.
Cách tiến hành
* Làm tiêu bản: tương tự mục 2.4.2.2 nhưng VK được nuôi cấy khoảng 2 tuần trên MT thạch nghiêng.
* Nhuộm tiêu bản
- Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U.
- Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhỏ xanh Metylen thấm ướt hết giấy lọc, hơ