* Vai trò của calcium [53]
Calcium là một khoáng chất có nhiều nhất, chiếm khoảng 1.5 - 2% thể trọng. Trong cơ thể con người 99% calcium tồn tại trong xương, răng, móng, 1% tồn tại
trong máu, trong tổ chức tế bào và dịch ngoài tế bào nhưng có nhiều nhiệm vụ rất quan trọng.
Vai trò chính yếu của calcium là phối hợp với sinh tố D để cấu tạo bộ xương và hàm răng vững chắc. Bên cạnh đó calcium cũng đóng một vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống các enzyme, sự co cơ, phóng thích chất dẫn truyền thần kinh, duy trì nhịp tim bình thường, quá trình đông máu, … đều chịu ảnh hưởng của calcium.
Nhu cầu calcium khác nhau theo từng lứa tuổi. Theo tổ chức y tế thế giới WHO, nhu cầu calcium tối thiểu của cơ thể con người:
- Trẻ sơ sinh: 300 - 400mg/ngày. - Nhi đồng: 600 - 800 mg/ngày. - Thanh thiếu niên: 1000 mg/ngày. - Người lớn 24 - 50 tuổi: 800mg/ngày.
Người cao tuổi, phụ nữ có thai: 1200 mg - 1500 mg/ngày.
Theo Walloc (1991), nếu ăn uống thiếu calcium con người có thể bị mắc 147 bệnh. Vì thế, calcium là khoáng chất cần thiết cho sự sống.
* Khả năng đồng hóa của calcium [12][57]
Calcium là nguyên tố khó đồng hóa bởi cơ thể. Độ đồng hóa của nó phụ thuộc vào mối tương quan giữa những hợp phần khác của thức ăn như chất béo, chất xơ, magiesium, phospho. Vitamin D là chất điều hòa đồng hóa calcium.
Chất béo: điều kiện thuận lợi để hấp thụ calcium tốt khi tỉ lệ calcium ứng với 1g chất béo có trong thức ăn là 0.04 - 0.08g. Thừa hay thiếu chất béo đều không tốt,thiếu chất béo thì sẽ chuyển toàn bộ calcium thành muối calcium của chất béo, thừa chất béo thì không đủ acid mật (inozitphosphoric, oxalic) để chuyển hóa muối calcium của acid béo thành phức hòa tan mà cơ thể có thể hấp thụ được. Do đó, phần lớn sẽ thải ra ngoài cùng với phân.
Chất xơ: Việc hấp thu calcium có thể thay đổi tùy thuộc vào bản chất, nguồn gốc của chất xơ. Nhiều loại chất xơ từ các loại rau xanh, đậu quả, quả có màu vàng, chuối, ... không ảnh hưởng tới việc hấp thu calcium. Song ngược lại, chất xơ trong
vỏ lúa mạch, vỏ ngũ cốc lại làm giảm hấp thu của calcium. Chất xơ khi kết hợp các thành phần khác của thức ăn như phytat và oxalat cũng sẽ làm giảm sự hấp thu calcium thức ăn.
Magnesium: thừa magnesium trong khẩu phần ăn cũng ảnh hưởng xấu đến sự hấp thụ calcium. Để hòa tan muối calcium cũng như muối magnesium đòi hỏi phải kết hợp chúng với acid muối mật, do đó muối magnesium càng nhiều thì acid mật còn lại để kết hợp với muối calcium càng ít, vì thế sẽ làm giảm quá trình hấp thụ calcium của cơ thể.
* Nguồn cung cấp calcium
Theo các nhà nghiên cứu thì nguồn thức ăn có calcium tốt nhất là sữa và các chế phẩm từ sữa. Sữa không chỉ chứa nhiều calcium mà cơ thể còn dễ hấp thu. Bên cạnh đó, rau xanh và các loại đậu, đặc biệt là đậu tương, vừng, hạt dưa, rong biển, tôm, cua, sò huyết là những thực phẩm chứa nhiều calcium.[61] Trong bột xương và vỏ trứng lượng calcium chiếm đến 20% và khả năng hấp thụ lên tới 70%, chính vì vậy đây cũng là thực phẩm tốt dành cho những người thiếu calcium.
Hình 1.6: Sữa giàu calcium [56] [69]
Người ta còn có thể bổ sung calcium cần thiết cho cơ thể dưới dạng viên thuốc, dịch hoặc sử dụng thực phẩm có bổ sung calcium. Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng calcium thông qua thực phẩm có lợi hơn là thông qua uống viên calcium, vì hấp thụ tốt hơn và tránh hiện tượng lắng đọng tạo sỏi thận [53].
Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium [54] [62] [66]
Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium [71]
1.3.2 Giới thiệu về protein
Protein (Đạm) là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptid (gọi là chuỗi polypeptid). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
* Vai trò dinh dưỡng: protein là hợp phần chủ yếu, quyết định toàn bộ các đặc trưng của khẩu phần thức ăn. [59] [63]
- Cung cấp các nguyên liệu cho sự tạo máu, bạch huyết, hormone, enzyme, kháng thể, … Cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặc biệt vitamin và chất khoáng.
- Là nguồn năng lượng cho cơ thể: đáp ứng 10 - 15% năng lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4Kcal. Về nhiệm vụ cung cấp năng
lượng có thể thay thế protein bằng các chất dinh dưỡng khác nhưng về mặt tạo hình không có chất dinh dưỡng nào có thể thay thế.
- Protein chiếm 19% trọng lượng cơ thể.
+ Protein là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống, chúng giữ vai trò quan trọng trong sự phát triển, duy trì sự sống và phục hồi của tế bào và các mô.
+ Khi thiếu protein trong chế độ ăn hằng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu cho sức khỏe như suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn (đối với trẻ em), giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đỡ của cơ thể đối với một số bệnh.
+ Thiếu protein sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh.
+ Thiếu protein cũng sẽ làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái của xương (lượng calcium giảm, lượng magnesium tăng cao). Do vậy mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong thức ăn cho mọi lứa tuổi.
* Cơ sở của quá trình thủy phân protein [31]
Sự thủy phân protein cũng như mọi phản ứng hóa học khác đều là sự trao đổi điện tử giữa các nguyên tử nhất định của các phân tử phản ứng. Việc thủy phân các phân tử dẫn đến làm đứt liên kết peptit nối nguyên tử carbon của một gốc acid amin này với nguyên tử nitơ của gốc kia và các nhóm amin được giải phóng theo phương trình: H+ C R H H2N C O N H C H R C O N C R H COOH OH- C H H H2N C N CH COOH R O H + C H H2N H COOH
* Nguồn protein trong TP [15]
Hàm lượng protein trong các thức ăn không giống nhau.
- TP có nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều về số lượng, cân đối về thành phần và hàm lượng các acid amin thiết yếu.
- TP có nguồn gốc thực vật (đậu nành, các loại đậu khác, …) là nguồn protein quan trọng. Hàm lượng acid amin thiết yếu cao trong đậu nành còn các loại đậu khác thì hàm lượng acid amin thiết yếu không cao, sự cân đối về thành phần các acid amin thiết yếu thấp hơn protein có nguồn gốc động vật.
Bảng 1.3: Hàm lượng protein trong một số loại TP thông dụng
Tên thực phẩm Lượng protein (g/100g) Tên thực phẩm Lượng protein (g/100g) Đậu nành 34 Tôm đồng 18.4 Đậu phộng 27.5 Trứng vịt 15
Đậu xanh 23.4 Ngô mảnh 8.5
Đậu đen 24.2 Gạo tẻ 7.6
Mè 20.1 Bột mì 11
Thịt trâu, bò 21 Bánh mì 7.9
Thịt gà 21.4 Khoai tây 2
Cá chép 16 Khoai sọ 1.8
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Các chủng VK do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
- Bacillus amyloliquefaciens
- Lactobacillus casei
2.1.2 Nguyên liệu
Phụ phẩm cá tra: Công ty trách nhiệm chế biến thủy sản Minh Qúy - cụm công nghiệp Tân Mỹ Chánh - TP. Mỹ Tho - tỉnh Tiền Giang.
Dịch tương đậu nành: cơ sở sản xuất đậu phụ Bách hóa tổng hợp - quận Thủ Đức - TP. Hồ Chí Minh.
Cà chua, bắp mỹ, giá, đậu nành, nước mắm 350N, agar, sucrose mua tại chợ An Đông (34 - 36 An Dương Vương phường 9 - Quận 5 - TP. Hồ Chí Minh)
2.1.3 Hóa chất
D - glucose, peptone, cao nấm men, cao thịt, casein, peptone, CH3COONa, K2HPO4, MnSO4.4H2O, Amonium citrate, Tween 80, NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaCl, FeSO4.7H2O, H2O2, HCl đặc, NaOH, acid trichloracetic, Na2HPO4, FeCl3, Trilon B (EDTA), H2SO4 đặc, CuSO4, K2SO4, KCN, tyrosin, phenol, murexid, crystal violet, lugol, fuschin, xanh metylen, folin, phenolphthalein, metyl đỏ.
2.1.4 Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi Sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư Phạm TP. Hồ Chí Minh cung cấp gồm:
Tủ sấy (Memmert - Đức), cân phân tích điện tử (Scientech - Đức), nồi hấp vô trùng (Huxley - Đài Loan), tủ cấy vô trùng (Việt Nam), tủ ấm (Binder - Đức), tủ lạnh (National - Nhật Bản), máy đo pH (Hana - Trung Quốc), máy lắc (Gerhardt - Đức), máy li tâm (Hettich - Đức), bể lắc nhiệt (Grant - Anh), kính hiển vi (Olympus - Nhật), máy chụp ảnh kỹ thuật số (Olympus - Nhật), máy khuấy từ, máy chưng cất đạm (Gerhardt, Đức), máy phá mẫu (Gerhardt, Đức), máy trung hòa khí (Gerhardt, Đức), máy đo quang phổ UV (Amersham Biosciences, Thụy Điển), máy lắc ống nghiệm, nồi nấu môi trường, bếp điện.
2.1.4.2 Dụng cụ
Bình tam giác (50ml, 100ml, 250ml), ống nghiệm, đĩa Petri, cốc thủy tinh (100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), ống đong (10ml, 100ml, 500ml), ống ly tâm, bình định mức (50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml), bình hút ẩm, đèn cồn, diêm quẹt, que gạt, que cấy (que cấy vòng, que cấy nhọn), khoan nút chai, pipetman (0,1ml, 1ml, 5ml, 10ml), thước đo, giấy lọc, khăn lọc, bông mỡ, bông thấm nước, lame, lamel, ...
2.2 Môi trường nghiên cứu
MT1 (MT giữ giống Bacillus amyloliquefaciens: MT cá peptone): nước mắm 350N 30ml, peptone 10g, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml. [7]
MT2 (MT giữ giống Lactobacillus casei: MT MRS (de Man, Rogosa and Sharp)): D - glucose 20g, peptone 10g, cao nấm men 5g, cao thịt 10g, CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g, Tween 80 1ml, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml.[22]
MT3 (MT nhân giốngBacillus amyloliquefaciens và Lactobacillus casei, khảo sát hoạt tính và hoạt độ protease: MT sữa đậu nành): sữa đậu nành 1000ml (đậu nành 100g ngâm trương nước từ 4 - 6 giờ → xay nhuyễn → lọc → bổ sung nước cất đến 1000ml), sucrose 20g.
MT4 (MT định tính khả năng sinh protease): pepton 5g, cao nấm men 2.5g, casein 10g, agar 20g, nước cất bổ sung đến 1000ml. [27]
MT5 (MT cà chua: MT khảo sát khả năng sinh acid): Nước ép cà chua 400ml, D - glucose 10g, cao nấm men 10g, dung dịch muối A 5ml (K2HPO4 2,5g, KH2PO4 2,5g, nước cất 250ml), dung dịch muối B 5ml (MgSO4.7H2O 10g, NaCl 5g, FeSO4.7H2O 5g, MnSO4.4H2O 5g, nước cất 250ml), agar 20g, nước cất bổ sung đến: 1000ml. [7]
MT6(MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, nước chiết bắp bổ sung 1000ml.[20]
MT7(MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, nước chiết giá đậu bổ sung đủ 1000ml. [13]
MT8(MT khảo sát khả năng sinh acid): CH3COONa 5g, K2HPO4 2g, MgSO4 0.1g, MnSO4.4H2O 0.05g, Amonium citrate 2g/l, sucrose 20g, dịch tương đậu nành bổ sung đủ 1000ml. [12]
2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm 2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu TP giàu calcium và protein
Dịch nuôi cấy
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên
khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus
amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens
Thủy phân Phụ phẩm cá tra
Bột xương cá
tra Phân tích sinh hóa
Nguyên liệu TP giàu Calcium và protein
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei Dịch lên men Lactobacillus casei Xương đã tách protein Ngâm trích ly calcium Xác định các điều kiện thích hợp Dd protein
2.3.2 Bố trí thí nghiệm
2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra
Tiến hành xác định các chỉ tiêu về độ ẩm, hàm lượng Ca2+, Nitrogen tổng số (NTS), protein tổng, Nitrogen formol (NF), Nitrogen ammoniac (NNH3).
2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens
Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1
- Chuẩn bị các bình tam giác (50ml) chứa 5ml MT3 đã vô trùng.
- Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang bình MT đã chuẩn bị ở trên.
- Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2
- Chuẩn bị bình tam giác (250ml) chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên.
- Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24giờ.
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens
* Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cấy 1% giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian nuôi cấy: 24giờ, 48giờ, 72giờ thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn thời gian thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các tỷ lệ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn tỷ lệ giống thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3 với các nồng độ sucrose: 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Chọn nồng độ sucrose thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT
Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3, chỉnh pH ban đầu ở các mức: 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở nhiệt độ phòng thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định pH ban đầu của MT thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Cấy tỷ lệ giống đã chọn vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các nhiệt độ: 300C, 350C, 400C, 450C. Sau thời gian nuôi cấy đã chọn thu dịch chiết enzyme và xác định hoạt độ protease. Xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ protease cao để tiến hành khảo sát tiếp theo.
* Động thái học của quá trình lên men
Cấy giống vào bình tam giác chứa 50ml MT3. Nuôi trên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút ở các các điều kiện đã chọn. Cứ 6giờ kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào và hoạt độ protease.
Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens
2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei
Chuẩn bị giống lên men * Nhân giống cấp 1
- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml MT3 đã vô trùng.
- Dùng que cấy vòng vô trùng, lấy một vòng KL từ ống giống sang ống nghiệm MT đã chuẩn bị ở trên.
- Ủ ở nhiệt độ 430C trong 24giờ. * Nhân giống cấp 2
- Chuẩn bị bình tam giác chứa 45ml MT3 đã vô trùng. - Cho 5ml giống cấp 1 vào bình MT đã chuẩn bị ở trên. - Ủ ở nhiệt độ 430C trong 24giờ.
Bacillus amyloliquefaciens Tỷ lệ giống/MT 1% 2% 3% 4% 5% Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ pH ban đầu 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 Nhiệt độ 300C 350C 400C 450C Nồng độ sucrose 0% 1% 2% 3% 4% 5% Hoạt độ protease