Nguyên tắc
Khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Gen 16 rARN gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của VK. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh xác định VK.
Cách tiến hành
* Bước 1
- Lấy một ít KL được nuôi cấy trên bề mặt thạch làm thành dịch huyền phù. - Tiến hành tách chiết ADN bằng cách: đun sôi 5phút, để nguội 5phút, ly tâm 5phút, sau đó lấy dịch nổi.
* Bước 2
- Cho dịch nổi thu được, primer, Taq, dNTP, Mg2+vào PCR mix để khuếch đại gen 16s rARN.
- Phản ứng PCR gồm 3 bước:
+ Biến tính: Trong một dd đầy đủ thành phần cho sự sao chép, ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94 - 950
C trong vòng 30giây - 1phút.
+ Lai: Nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700
+ Tổng hợp: Nhiệt độ được nâng lên đến 720C để ADN polimerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự ADN thường kéo dài từ 30giây đến vài phút.
* Bước 3: Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose để xác định sản phẩm PCR. * Bước 4: Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEX II của Qiagen.
* Bước 5: Giải trình tự đoạn rARN 16s, nhằm xác định trình tự acis nucleic. Có 2 phương pháp xác định:
- Phương pháp hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử ADN, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleoide.
- Phương pháp enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ ADN polimerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các dideoxynucleotide thông thường. Kết quả cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn ADN có kích thước chênh nhau 1 nucleoide.
Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn ADN sẽ được phân tích trên điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ điện di.
* Bước 6: Xuất kết quả trình tự để phân tích. Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH xác định tên VK cần định danh.