3.3.1.1 Mật độ tế bào Bacillus amyloliquefaciens trong MT nuôi cấy
Tiến hành nhân giống cấp 1 và 2 chủng Bacillus amyloliquefaciens trong môi trường sữa đậu nành bổ sung 2% sucrose. Sau 24 giờ thu dịch nuôi cấy, đem xác định mật độ tế bào của giống bằng phương pháp đếm KL. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Mật độ tế bào Bacillus amyloliquefaciens trong giống các cấp
Mật độ tế bào (CFU/ml) x 108
Giống cấp 1 3.86. ± 0.24
Giống cấp 2 24.40 ± 1.83
Kết quả định lượng tế bào bằng phương pháp đếm KL sau khi nuôi Bacillus amyloliquefacienstrong MT3: giống cấp 1 là 3.86 ± 0.24 (CFU/ml) x 108 và giống cấp 2 là 24.40 ± 1.83 (CFU/ml) x 108 cho thấy mật độ tế bào Bacillus amyloliquefaciens ở MT3 khá ổn định. Vì vậy, nuôi Bacillus amyloliquefaciens
trong MT3 thích hợp cho việc nhân giống và đạt mật độ tế bào cần thiết, đảm bảo cho việc sinh tổng hợp protease.
3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Các chủng VSV khác nhau có tốc độ sinh trưởng khác nhau, tốc độ sinh trưởng thường liên quan đến thời gian nuôi cấy. Đó là yếu tố quan trọng quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Thông thường enzyme được tổng hợp nhiều nhất tại một thời gian nhất định nào đó [26]. Vì thế, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của chủng
Bacillus amyloliquefaciens.
Chủng Bacillus amyloliquefaciens được nuôi trong MT3 theo các khoảng thời gian khác nhau. Sau từng thời gian nuôi cấy đã khảo sát, thu dịch enzyme thô và
xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày trong hình 3.11, 3.12, bảng 3.5.
Hình 3.11: Vòng phân giải casein của Bacillus amyloliquefaciens khi được nuôi
cấy ở các khoảng thời gian khác nhau
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Thời gian (giờ) 0 24 48 72
Hoạt độ protease (UI/ml) 0 0.83a 1.25c 1.16d
Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Từ kết quả trên cho thấy, chủng Bacillus amyloliquefaciens có hoạt độ protease tăng cùng với sự gia tăng về thời gian khảo sát. Tại thời điểm 48giờ hoạt độ protease đạt giá trị cực đại rồi giảm xuống. Trong 24giờ nuôi cấy đầu tiên, dịch
24 giờ 48 giờ 72 giờ
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 20 40 60 80
Thời gian (giờ)
Hoạ t độ pr ot ea se (U I/m l)
enzyme cho hoạt độ protease thấp là 0.83UI/ml, nhưng sau 48giờ nuôi cấy, dịch enzyme cho hoạt độ protease đạt cực đại là 1.25UI/ml, và sau 72giờ nuôi cấy thì hoạt độ protease bắt đầu giảm chỉ còn 1.16UI/ml. Vì vậy, chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy thích hợp cho chủng Bacillus amyloliquefaciens sinh tổng hợp protease là 48giờ.
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Đỗ Thị Thu Nga (2012) về chủng Bacillus cho thấy hoạt độ protease cao nhất trong khoảng 42 - 48giờ nuôi cấy.
Ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Sự sinh trưởng và phát triển là thuộc tính cơ sở của VSV. Sự sinh tổng hợp enzyme cao hay thấp phụ thuộc vào quá trình sinh trưởng và sử dụng nguồn dinh dưỡng nhiều hay ít của chúng. Tỷ lệ giống ban đầu thích hợp sẽ giúp tế bào sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme tốt. Vì vậy, việc chọn ra tỷ lệ giống ban đầu thích hợp cho việc sinh tổng hợp protease là rất quan trọng. Nên chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống lên khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus amyloliquefaciens.
Chủng Bacillus amyloliquefaciens nuôi trong MT3 với các tỷ lệ giống khác nhau. Sau 48 giờ thu dịch enzyme thô và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.13.
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Tỷ lệ giống (%) 1 2 3 4 5
Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Từ kết quả trên cho thấy, chủng Bacillus amyloliquefaciens có hoạt độ protease tỷ lệ nghịch với tỷ lệ giống ban đầu cho vào MT. Tỷ lệ giống 1% cho hoạt độ protease cao 1.28UI/ml, hoạt độ protease giảm mạnh 0.60UI/ml khi tỷ lệ giống ban đầu là 5%. Vì tỷ lệ giống ban đầu quá cao làm mật độ tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhiều sẽ gây ra tình trạng thiếu chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng, phát triển của VK, làm chậm quá trình sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme của chúng. Nên tỷ lệ giống ban đầu vừa đủ sẽ giúp VK sinh trưởng tốt cũng như khả năng tổng hợp protease cao. Cho nên tỷ lệ giống ban đầu thích hợp cho chủng Bacillus amyloliquefaciens sinh tổng hợp protease là 1%.
Ảnh hưởng của nồng độ sucrose
Theo Ostroko và cộng sự (1977), glucose, sucrose, maltose, fructose và sorbitol là các nguồn carbon tốt nhất cho sự sinh tồng hợp protease ở Bacillus subtilis. Nên chúng tôi chọn nguồn carbon là sucrose với các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus amyloliquefaciens.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 1 2 3 4 5 6 Tỷ lệ giống (%) H oạ t độ pr ot ea se (U I/m l)
Tiến hành cấy 1% giống vào MT3 với các nồng độ sucrose khác nhau. Sau 48 giờ thu dịch enzyme thô và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.14.
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Nồng độ sucrose (%) 0 1 2 3 4 5
Hoạt độ protease (UI/ml) 0.72a 0.84b 1.29c 1.56d 1.63de 1.69e
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Từ kết quả trên cho thấy, chủng Bacillus amyloliquefaciens có hoạt độ protease tỷ lệ thuận với nồng độ sucrose cho vào MT. Hoạt độ protease tăng mạnh khi nồng độ sucrose 3% là 1.56UI/ml, sau đó tăng chậm ở nồng độ 4%, 5% cho hoạt độ protease lần lượt là 1.63UI/ml và 1.69UI/ml. Như vậy, nồng độ sucrose thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp protease là từ 3 - 5%. Tuy nhiên hoạt độ protease tăng không đáng kể ở các nồng độ 3%, 4%, 5% và sự khác biệt này là không có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%. Do đó, vì lý do kinh tế nên chúng tôi chọn nồng độ sucrose 3% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
0 0.5 1 1.5 2 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ sucrose (%) H oạ t độ pr ot ea se (U I/m l)
Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT
pH MT có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng phát triển của VK. Nồng độ H+ và OH- ảnh hưởng trực tiếp lên tế bào hoặc ảnh hưởng gián tiếp làm thay đổi độ phân li của các chất trong MT. Thay đổi pH còn ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzyme, đến sản phẩm trung gian, đến sự phân li, ... [8]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus amyloliquefaciens.
Chúng tôi tiến hành cấy 1% giống vào MT3, 3% sucrose với pH ban đầu của MT được điều chỉnh từ 5 - 8 bằng KOH 5% và acid citric 5%. Sau 48 giờ thu dịch enzyme thô và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.15.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
pH 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Hoạt độ
protease (UI/ml) 0.31
a 0.66b 1.08d 1.36e 1.54f 1.31e 0.87c
Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Từ kết quả trên cho thấy, trị số pH đầu tiên của MT là 5.0 ảnh hưởng nhiều tới sự sinh tổng hợp protease. Hoạt độ protein tăng mạnh từ pH 5.5 - 7 và đạt cực trị ở
0 0.5 1 1.5 2 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 pH Hoạ t độ pr ot ea se (U I/m l)
pH 7 là 1.54UI/ml, sau đó giảm mạnh khi pH 8 cho hoạt độ protease là 0.87UI/ml. Khi pH quá thấp hoặc quá cao sẽ ức chế quá trình sinh trưởng phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp protease của VK. Vì vậy, pH 7 là pH thích hợp cho sự sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens.
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả khi khảo sát pH thích hợp cho Bacillussinh tổng hợp protease như: Nguyễn Thị Trần Thụy (2009) là pH 7, Đỗ Thị Thu Nga (2012) là pH 6.5 - 7. Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), pH thích hợp để nuôi cấy VK thu protease là 6.6 - 7.4.
Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và đến hoạt tính của enzyme. Do Bacillus có khả năng sinh bào tử, nên chúng có khả năng sinh trưởng trong giới hạn nhiệt khá rộng từ 20 - 450C. Nếu nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm ức chế các phản ứng sinh hóa xảy ra. Nhằm tìm nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy.
Tiến hành cấy 1% giống vào MT3, 3% sucrose, điều chỉnh pH 7, sau đó nuôi ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Sau 48 giờ thu dịch enzyme thô và xác định hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và hình 3.16.
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Nhiệt độ (0C) 30 35 40 45
Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của
Bacillus amyloliquefaciens
Từ kết quả trên cho thấy, chủng Bacillus amyloliquefaciens có khả năng sinh tổng hợp protease ở các điều kiện nhiệt độ nghiên cứu. Hoạt độ protease đạt tối đa ở nhiệt độ 350C là 2.15UI/ml. Kết quả này là phù hợp vì các chủng Bacillus thường là các chủng ưa ấm. Vì vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 350
C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Theo nghiên cứu của một số tác giả về nhiệt độ tối thích cho khả năng sinh tổng hợp protease của Bacillus: Puri S (2002) t0opt là 30 – 370C; Shumi (2004), Al – Saleh (2007), Nguyễn Thị Trần Thụy (2009) t0
opt là 370C, Đỗ Thị Thu Nga (2012), 30 – 350C.
Động thái học của quá trình lên men
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens với tất cả các điều kiện tối ưu trên để xác định tốc độ sinh trưởng phát triển và khả năng sinh tổng hợp protease của nó.Sau 6 giờ nuôi cấy, chúng tôi tiến hành kiểm tra pH một lần và thu dịch lên men để xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL và hoạt độ protease bằng phương pháp Anson cải tiến. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.17.
Bảng 3.10: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens
0 0.5 1 1.5 2 2.5 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ (0 C) H oạ t độ pr ot ea se (U I/m l)
Thời gian (giờ) pH Mật độ tế bào (CFU/ml) x 108 Hoạt độ protease (UI/ml) 0 7.00c 2.88a 0.33a 6 6.78b 8.50b 0.55b 12 6.62a 16.00c 0.85c 18 7.07c 30.00e 0.98d 24 7.34d 54.60g 1.13e 30 7.71ef 65.60k 1.50g 36 7.79f 65.40k 1.64h 42 8.00gh 65.00hk 1.89kl 48 8.13kl 60.00h 2.11m 54 8.22l 52.80g 1.94l 60 8.04hk 49.40g 1.80k 66 7.91g 38.20f 1.52g 72 7.64e 24.00d 1.36f
Hình 3.17: Động học quá trình lên men của Bacillus amyloliquefaciens
Từ kết quả trên cho thấy, mật độ tế bào của chủng Bacillus amyloliquefaciens
tăng dần theo thời gian từ 6 - 30giờ, đây là pha sinh trưởng. Tại thời điểm 30 giờ mật độ tế đạt giá trị cực đại 65.60 x 108CFU/ml. Sau đó giảm nhẹ và đi vào ổn định từ thời điểm 30 - 42 giờ và sau 42 giờ mật độ tế bào bắt đầu giảm và đến 48 giờ thì
0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80
Thời gian (giờ)
H oạ t độ pr ot ea se (U I/m l) hoặ c pH 0 10 20 30 40 50 60 70
Hoạt độ protease (UI/ml) pH Mật độ tế bào (CFU/ml) x 10 8
M ật độ t ế bà o ( C FU /m l) x 10 8
giảm mạnh, đây là pha suy vong trong quá trình sinh trưởng của chủng Bacillus amyloliquefaciens.
pH MT giảm trong thời gian đầu, từ pH ban đầu của MT là 7 giảm xuống 6.62 sau 12 giờ nuôi cấy. Điều này có thể giải thích là do trong thời gian chủng Bacillus amyloliquefaciens sinh trưởng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trung gian là acid hữu cơ tiết vào MT làm pH môi trường giảm [8]. Sau 12 giờ, pH MT bắt đầu tăng dần (từ pH 6.62 - 8.04) là do khi nuôi cấy chủng Bacillus amyloliquefaciens trong MT có sữa sẽ xảy ra hiện tượng peptone hóa một cách chầm chậm và thường chuyển pH MT sang dạng kiềm [9]. Theo Nguyễn Thị Trần Thụy và Lê Ngọc Tú (cùng cộng sự), các loài thuộc chi Bacillus có khả năng sinh tổng hợp protease kiềm trong quá trình sinh trưởng của chúng nên thường chuyển pH MT về pH kiềm. Sau đó, pH MT giảm dần (pH 7.64) là do đường công tăng trưởng của chủng từ Bacillus amyloliquefacienstrong giai đoạn này ở pha suy vong, nên khả năng tạo ra các sản phẩm trao đổi chất giảm. Theo nghiên cứu chúng tôi thấy, tại thời điểm này thì hoạt độ protease tổng hợp ra cũng bắt đầu giảm mạnh.
Hoạt độ protease của chủng Bacillus amyloliquefaciens tăng sau 12 giờ nuôi cấy và đạt cực đại tại thời điểm 48 giờ (2.11UI/ml). Sau đó giảm dần ở các khoảng thời gian khảo sát tiếp theo. Do trong thời gian đầu, trong MT còn đầy đủ chất dinh dưỡng đảm bảo cho VK sinh trưởng tốt. Sau một thời gian sinh trưởng thì mật độ tế bào trong MT lúc này bắt đầu tăng lên và đồng thời lượng chất dinh dưỡng trong MT cũng bắt đầu giảm. Chính vì thế, để tồn tại thì VK tiết ra enzyme để phân giải cơ chất đáp ứng nhu cầu sử dụng của chúng nên tại thời điểm này hoạt độ enzyme bắt đầu tăng mạnh. Khi MT đã cạn kiệt chất dinh dưỡng thì khả năng sinh trưởng của chúng cũng bắt đầu giảm, điều này kéo theo lượng enzyme do nó tiết ra cũng giảm theo. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Trần Thụy (2009) và Đỗ Thị Thu Nga (2012).
Sau khi tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng Bacillus amyloliquefaciens, chúng tôi thu được dịch lên men có hoạt độ protease tương đối cao là 2.11UI/ml tăng 68.80% so với trước tối ưu hóa.
So sánh với chủng Bacillus amyloliquefaciens và chủng Bacillus sinh tổng hợp protease của tác giả Đỗ Thị Thu Nga (2012) có hoạt độ protease lần lượt là 2.487UI/ml và 2.035UI/ml. Vì vậy, chúng tôi chọn Bacillus amyloliquefaciens có khả năng sinh tổng hợp protease với các điều kiện khảo sát trên để nghiên cứu cho những thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei
3.3.2.1 Mật độ tế bào Lactobacillus casei trong MT nuôi cấy
Tiến hành nhân giống chủng Lactobacillus casei trong môi trường sữa đậu nành bổ sung 2% sucrose. Sau 24 giờ thu dịch nuôi cấy, đem xác định mật độ tế bào của giống bằng phương pháp đếm KL. Kết quả được trình bày trong bảng 3.11.
Bảng 3.11: Mật độ tế bào Lactobacillus casei trong giống các cấp
Mật độ tế bào (CFU/ml) x 109
Giống cấp 1 0.64 ± 0.02
Giống cấp 2 2.74 ± 0.33
Kết quả định lượng tế bào bằng phương pháp đếm KL, sau khi nuôi
Lactobacillus casei trong MT3 cấp 1 là 0.64 ± 0.02 (CFU/ml) x 109 và cấp 2 là 2.74 ± 0.33 (CFU/ml) x 109 cho thấy mật độ tế bào Lactobacillus casei ở MT3 khá ổn định. Vì vậy, nuôi Lactobacillus casei trong MT3 thích hợp cho việc nhân giống và đạt mật độ tế bào cần thiết, đảm bảo cho việc sinh acid.
3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh acid của Lactobacillus casei
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Các chủng VSV khác nhau có tốc độ sinh trưởng khác nhau, tốc độ sinh trưởng thường liên quan đến thời gian nuôi cấy chúng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành