[11]
Nguyên tắc
Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzyme của VK phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan. Độ lớn của MT trong suốt thể hiện hoạt tính của enzyme.
A * D M (CFU/ml) =
Cách tiến hành
Thu dịch nuôi cấy
- Chuẩn bị 50ml MT3 nuôi VK trong bình tam giác 250ml, đem hấp khử trùng 1210C trong 30 phút.
- Dùng pipetman lấy một thể tích giống cấp 2 sao cho mật độ tế bào 106
- 107/ml nuôi cấy vào bình tam giác chứa MT3.
- Đặc bình tam giác lên máy lắc với tốc độ 150vòng/phút, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ.
Ly tâm dịch nuôi cấy 15phút, tốc độ 5000vòng/phút. Loại bỏ sinh khối thu được dịch enzyme thô.
Chuẩn bị các đĩa Petri có MT4. Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 9mm) khoan các lỗ thạch trên MT4 tương ứng trong các đĩa. Dùng pipetman vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào các lỗ khoan. Giữ các đĩa petri trong tủ lạnh 40
C trong 2 - 4giờ, sau đó chuyển ra nhiệt độ phòng 24giờ.
Nhỏ dung dịch HgCl2 10% lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải. Kiểm tra kết quả
VK sinh ra protease sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do HgCl2 phản ứng với protein tạo kết tủa.
Đánh giá khả năng tạo enzyme
Đặt sấp đĩa petri. Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính lỗ khoan (d).
Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzyme của các chủng nấm sợi.
Quy ước:
- (D - d) ≥ 25mm: enzyme có hoạt tính rất mạnh - (D - d) ≥ 20mm: enzyme có hoạt tính mạnh
- (D - d) ≥ 10-19,5mm: enzyme có hoạt tính trung bình - (D - d) ≤ 10mm: enzyme có hoạt tính yếu
2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20]
Nguyên tắc
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt độ phân giải protein của protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử folin.
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enyme.
Cách tiến hành
* Dựng đường chuẩn tyrosine
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Dd tyrosin chuẩn 1mM/l (ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Dd HCl 0.2N (ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
Dd NaOH 0.5N (ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
Lắc và để yên trong 10 phút, đem đo mật độ quang ở bước sống 660nm Ống 1 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosin tương quan giữa lượng tyrosin (µmol) và ΔOD (ΔOD = ODTN
– ODKC)
* Định lượng protease trong mẫu
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Ống thí nghiệm Ống kiểm chứng
Dd casein 1% (ml) 5 5
Dd TCA 10% (ml) 0 5
Dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 300C trong 30 phút
TCA 5% (ml) 5 0
Lọc, lấy dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (ml) 1 1
Dd NaOH 0.5N (ml) 2 2
Thuốc thử Folin (ml) 0.6 0.6
Lắc đều và để yên trong 10 phút. Đem đo OD ở bước sống 660nm Tính ΔOD = ODTN – ODKC. Dựa vào đồ thị chuẩn suy ra µmol tyrosin.
Tính kết quả
Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme trong một phút ở 300C phân giải được một lượng protein tương đương với một micromole tyrosin
Hoạt độ 1ml dung dịch enzyme được tính bằng công thức
Trong đó:
x: Số ml tyrosin suy ra từ đường chuẩn.
V: Tổng thể tích của hỗn hợp phản ứng với enzyme (ml). L: Độ pha loãng của dịch enzyme mẫu.
t: Thời gian hỗn hợp phản ứng.
v: Thể tích dịch lọc đem phản ứng (ml).