Nghiên cứu một số đặc điểm tế bào máu, tủy xương, nhiễm sắc thể và protein protein bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho

Bạch cầu cấp dòng lympho là một bệnh lí ác tính, đặc trưng bởi sự tăng sinh ác tính của các tế bào tiền thân dòng lympho có thay đổi về vật chất di truyền, dẫn đến lấn át các dòng tế bào

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 13

1.1 QUÁ TRÌNH SINH MÁU 13

1.1.1 Cơ quan sinh máu 13

1.1.2 Quá trình sinh máu 17

1.1.3 Dấu ấn miễn dịch trên bề mặt tế bào qua các thời kì phát triển 19

1.2 BỆNH BẠCH CẦU CẤP 21

1.2.1 Khái niệm và lịch sử 21

1.2.2 Phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 23

1.3 CÁC NGUYÊN NHÂN GÂY BỆNH BẠCH CẦU CẤP 26

1.3.1.Tiền sử gia đình 26

1.3.2 Phóng xạ 26

1.3.3 Hóa chất 27

1.3.4 Virus 27

1.4.CƠ CHẾ BỆNH SINH BỆNH BẠCH CẦU CẤP 27

1.4.1 Sự hoạt động của các gen ung thư (oncogene) 27

1.4.2 Gen ức chế u 28

1.4.3 Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 28

1.4.4 Một số biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho 29 1.5 KĨ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN CÁC BIẾN ĐỔI GEN 37

1.5.1 Khái niệm 37

1.5.2 Các dạng kĩ thuật PCR được áp dụng trong nghiên cứu 38

1.6 HOẠT ĐỘNG CỦA HỆ PROTEIN TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO 40

1.6.1 Tác động của hệ protein lên hoạt động tế bào 40

1.6.2 Các protein bất thường liên quan đến bệnh bạch cầu cấp 41

1.6.3 Tác động của các protein khác 42

1.6.4 Kĩ thuật phân tích protein 43

1.7 CÁC YẾU TỐ CÓ GIÁ TRỊ TIÊN LƯỢNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH BẠCH CẦU CẤP 45

1.8 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO Ở VIỆT NAM 46

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 49

2.1 ĐỐI TƯỢNG 49

2.1.1 Số lượng 49

2.1.2 Tiêu chuẩn 49

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 49

2.3 PHƯƠNG PHÁP 50

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 50

2.3.2 Nội dung và các chỉ số nghiên cứu 50

2.3.3 Các nhóm đối tượng nghiên cứu 50

2.4 KĨ THUẬT 51

2.4.1 Kĩ thuật huyết tủy đồ, chẩn đoán bênh bạch cầu cấp dòng lympho 51 2.4.2 Kĩ thuật phân tích tế bào di truyền 53

2.4.3 Kĩ thuật PCR 54

2.4.4 Kĩ thuật phân tích protein 57

2.4.5 Qui trình nghiên cứu 59

2.5 XỬ LÍ SỐ LIỆU 61

2.6 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 61

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 63

3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU 63

3.1.1 Số bệnh nhân nghiên cứu: 66 bệnh nhân 63 3.1.2 Độ tuổi nhóm bệnh nhân nghiên cứu: 63 3.1.4 Phân loại thể bệnh 65 3.2 ĐẶC ĐIỂM HUYẾT HỌC TỦY SINH MÁU CỦA BN BẠCH CẦU CẤP

DÒNG LYMPHO 72 3.2.1 Đặc điểm máu ngoại vi 72 3.2.2 Đặc điểm tế bào tủy xương 74 3.2.3 Tỷ lệ % tế bào non ác tính trong tủy xương bệnh nhân BCC dòng lympho 78 3.3 ĐẶC ĐIỂM TẾ BÀO DI TRUYỀN BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO 80 3.3.1 Kết quả phân tích nhiễm sắc thể 80 3.3.2 Kết quả xác định các chuyển đoạn gen MLL/AF4, E2A/PBX,

BCR/ABL, AML1/TEL 90 3.4 SO SÁNH CÁC NHÓM BỆNH NHÂN CÓ BẤT THƯỜNG SỐ LƯỢNG

NHIỄM SẮC THỂ VÀ CÓ CÁC CHUYỂN ĐOẠN GEN MLL/AF4,

E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL VÀ TỶ LỆ TẾ BÀO NON ÁC TÍNH

TRƯỚC VÀ SAU ĐIỀU TRỊ 101 3.5 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PROTEIN HUYẾT THANH BN BẠCH CẦU CẤP

DÒNG LYMPHO 107 3.5.1 Loại bỏ albumin và IgG và phân tích các peptide bằng phương pháp nanoLC MS/MS 107 3.5.2 Kết quả phân tích protein 108 3.6 BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ CỦA CÁC XÉT NGHIỆM HUYẾT

HỌC, DI TRUYỀN, MIỄN DỊCH, PHÂN TỬ, DƯỚI PHÂN TỬ TRONG

CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG BẠCH CẦU CẤP 122

KẾT LUẬN 127 KIẾN NGHỊ 129 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN

ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

FLT: Fetal Liver Tyrosine HCD: Heavy chain Díease HSP90: Heat stock protein 90

MLL: Myeloid lymphoid leukemia PCR: Polymerase Chain Reaction Ph1: Philadelphia

RNA: Ribonucleotide acid WHO: World health orgnization

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tỷ lệ và sự phân bố các tế bào sinh máu và tế bào mỡ 15

Bảng 1.2 Các dấu ấn miễn dịch trên tế bào lympho 24

Bảng 1.3 Các biến đổi di truyền và tiên lượng trong BCC dòng lympho 29

Bảng 1.4 Các đột biến cấu trúc thương gặp ở BN BCC dòng lympho 31

Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái các thể bệnh BCC dòng lympho 52

Bảng 2.2 Các dấu ấn bề mặt tế bào dòng lympho 53

Bảng 3.1 Độ tuổi nhóm bệnh nhân bạch cầu cấp trong nghiên cứu 63

Bảng 3.2 Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo tiêu chuẩn hình thái FAB 65

Bảng 3.3 Kết quả phân thể bệnh BCC theo dòng T/B lympho 70

Bảng 3.4 So sánh kết quả phân loại BCC dòng lympho bằng phương pháp miễn dịch 71

Bảng 3.5 Các chỉ số huyết học bệnh nhân BCC dòng lympho 72

Bảng 3.6 Số lượng tế bào tủy trước điều trị 74

Bảng 3.7 Số lượng tế bào tủy sau điều trị 77

Bảng 3.8 Tỷ lệ % tế bào non ác tính trong tủy xương bệnh nhân BCC dòng lympho trước và sau điều trị hóa chất 78

Bảng 3.9 Tỷ lệ thành công khi phân tích nhiễm sắc thể 82

Bảng 3.10 Kết quả phân tích nhiễm sắc thể karyotype 82

Bảng 3.11 Các dạng bất thường số lượng NST bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 83

Bảng 3.12 So sánh một số kết quả công bố về tỷ lệ quá bội và thiểu bội NST ở bệnh nhân BCC dòng lympho 84

Bảng 3.13 Các dạng bất thường cấu trúc NST bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 85

Bảng 3.14 So sánh tỷ lệ bệnh nhân BCC dòng lympho có NST Ph1 86

Bảng 3.15 Kết quả phân tích một số bất thường gen bằng RT-PCR 90

Bảng 3.16 So sánh tỷ lệ chuyển đoạn gen ABL/BCR trong nghiên cứu

và một số tác giả khác 92 Bảng 3.17 So sánh tỷ lệ chuyển đoạn gen AML/TEL trong nghiên cứu

và một số tác giả khác 96 Bảng 3.18 So sánh kết quả phân tích chuyển đoạn gen E2A/PBX của

chúng tôi so với các tác giả khác đã công bố 99 Bảng 3.19 So sánh kết quả phân tích chuyển đoạn gen MLL/AF4 của

chúng tôi với các tác giả khác đã công bố 100 Bảng 3.20 Kết quả phối hợp đặc điểm tế bào di truyền ở bệnh nhân BCC

dòng lympho sau điều trị hóa chất 102 Bảng 3.21 So sánh tỷ lệ tế bào non giữa các nhóm bệnh nhân có chuyển

đoạn gen trước và sau điều trị 103 Bảng 3.22 So sánh tỷ lệ các protein tổng thể liên quan đến bệnh ung thư

và tỷ lệ dạng protein dạng đột biến giữa các cơ sở dữ liệu người bình thường và người mắc bệnh bạch cầu cấp 109 Bảng 3.23 So sánh tỷ lệ các protein bền nhiệt liên quan đến bệnh ung

thư và tỷ lệ dạng protein dạng đột biến giữa các cơ sở dữ liệu người bình thường và người mắc bệnh bạch cầu cấp 111 Bảng 3.24 Một số protein tổng thể có liên quan đến quá trình bệnh bạch

cầu cấp 112 Bảng 3.25 Các protein bệnh khác trong huyết thanh bệnh nhân bạch cầu

cấp dòng lympho 116 Bảng 3.26 Một số protein liên quan đến ung thư trong huyết thanh

bệnh nhân bạch cầu cấp 119 Bảng 3.27 Tỷ lệ tế bào non ác tính sau điều trị của bệnh nhân BCC dòng

lympho 120 Bảng 3.28 Các ưu điểm và nhược điểm của xét nghiệm Huyết học, di

truyền, MD phân tử, dưới phân tử trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 125

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ sinh máu theo thuyết một nguồn 18

Hình 1.2 Các dấu ấn trên bề mặt tế bào lympho qua các giai đoạn phát triển 21

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa chuyển đoạn gen BCR/ABL 33

Hình 1.4 Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen MLL/AF4 34

Hình 1.5 Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen E2A/PBX 35

Hình 1.6 Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen AML1/TEL 36

Hình 1.7 Hình ảnh minh họa cho quá trình sao mã ngược tạo sợi đôi cADN từ sợi đơn ARN và quá trình tổng hợp sợi AND 39

Hình 3.1 Phân bố giới tính trong nhóm nghiên cứu 64

Hình 3.2 Các tế bào non ác tính trong BCC dòng lympho thể L1 có kích thước nhỏ, tương đối đều 66

Hình 3.3 Các tế bàonon ác tinh trong BCC dòng lympho thể L2 có kích thước lớn, không đều, nguyên sinh chất hẹp 66

Hình 3.4 Các tế bào non ác tính trong BCC dòng lympho thể L3 nhân lớn, có hốc chế tiết trong nguyên sinh chất, nguyên sinh chất rộng 67

Hình 3.5 Hình ảnh các hạt PAS dương tính trên bề mặt tế bào non 68

Hình 3.6 Hình ảnh các tế bào non ác tinh dương tính PAS 68

Hình 3.7 Hình ảnh dương tính CD 20, âm tính với CD33 70

Hình 3.8 Hình ảnh dương tính với CD 10 và CD34 71

Hình 3.9 Số lượng tế bào tủy xương trước điều trị hóa chất 75

Hình 3.10 Hình ảnh tế bào tế bào non ác tính tăng sinh dầy đặc trong các khoang sinh máu trên tiêu bản sinh thiết 75

Hình 3.11 Hình ảnh tế bào tế bào non ác tính trong tủy, không thấy các tế bào đầu dòng hồng cầu, bạch cầu hạt và mẫu tiểu cầu 77

Hình 3.12 Hình ảnh tủy sinh máu trở lại bình thường 80

Hình 3.13 Tỷ lệ % phân tích được nhiễm sắc thể trong nghiên cứu 81

Hình 3.14 Bộ NST 46,XY bình thường 88

Hình 3.15 Hình ảnh chuyển đoạn t(4;12) 88

Hình 3.16 Hình ảnh 48 NST, +8, +18, Ph1, 89

Hình 3.17 Hình ảnh NST Ph1 dương tính trên tiêu bản nhuộm băng G 89

Hình 3.18.Tỷ lệ các loại chuyển đoạn gen MLL/AF4, E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL gặp trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 91

Hình 3.19 Tỷ lệ BN có chuyển đoạn ABL/BCR 83

Hình 3.20 Hình ảnh điện di có Ph1 (+) 94

Hình 3.21 Tỷ lệ BN có chuyển đoạn AML/TEL trong nhóm có các chuyển đoạn gen nghiên cứu 95

Hình 3.22 Hình ảnh điện di AML1/TEL 97

Hình 3.23 Tỷ lệ bệnh nhân BCC dòng lympho có chuyển đoạn gen E2A/PBX 98

Hình 3.24 Tỷ lệ bệnh nhân BCC dòng lympho có chuyển đoạn gen MLL/AF4 trong nhóm có biến đổi gen nghiên cứu 100

Hình 3.25 Tỷ lệ tế bào non ác tính trước và sau điều trị ở các bệnh nhân có chuyển đoạn gen MLL/AF4, E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL 104

Hình 3.26 Hệ thống xét nghiệm và giá trị các loại xét nghiệm đã 122

MỞ ĐẦU

Bạch cầu cấp - hay ung thư máu cấp là một trong những bệnh máu hay gặp nhất trong những bệnh máu ác tính, bao gồm bạch cầu cấp dòng tủy và dòng lympho Theo thống kê của viện sức khỏe Hoa kỳ, bạch cầu cấp có tỷ lệ mắc mới hàng năm là 4000 bệnh nhân, tỷ lệ tử vong do căn bệnh này xấp xỉ 1.700 bệnh nhân, đứng hàng thứ 5 trong những số những ca tử vong do ung thư tại Mỹ

Bạch cầu cấp dòng lympho là một bệnh lí ác tính, đặc trưng bởi sự tăng sinh ác tính của các tế bào tiền thân dòng lympho có thay đổi về vật chất di truyền, dẫn đến lấn át các dòng tế bào tạo máu khác, rối loạn quá trình sinh tổng hợp tế bào máu trong cơ thể

Khoảng 60 - 70% bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho có các biến đổi

tế bào di truyền (như: trên lưỡng bội nhiễm sắc thể, thiểu bội nhiễm sắc thể, chuyển đoạn, đảo đoạn, đứt gãy nhiễm sắc thể) [136] Cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều biến đổi gen được coi như nguyên nhân gây rối loạn quá trình biệt hóa tế bào Các biến đổi gen trong bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho B có tỷ lệ cao hơn bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp dòng lympho T, các biến đổi gen này được coi như một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới khả năng lui bệnh, nguy cơ tái phát và khả năng sống của người bệnh Năm 2008, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đưa ra hệ thống phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho dựa trên các bất thường gen [36]

Đầu những năm 2000, khi ra đời công nghệ proteomic, cho phép phân tích sự biểu hiện của các protein trong cơ thể người, các nhà nghiên cứu nhận thấy, ngay khi bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp có bộ nhiễm sắc thể bình thường,

do một sai sót nào đó trong quá trình dịch mã đã tạo ra các sản phẩm là các protein khác lạ Các protein này họat động như một enzym tác động vào quá

trình biệt hóa tế bào hoặc tác động như một sản phẩm oncogen, làm rối loạn quá trình sinh trưởng của tế bào dẫn đến tính ác tính- ung thư hóa

Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về bất thường gen, nhưng chưa có nghiên cứu hệ thống nào về các biến đổi gen, biến đổi protein ở bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Trước nhu cầu thiết thực phục vụ cho chẩn đoán và điều trị bệnh bạch

cầu cấp chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm tế bào máu, tủy xương, nhiễm sắc thể và protein bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho” với các mục tiêu sau:

1 Phân tích các chỉ số tế bào máu và tủy ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho trước và sau điều trị

2 Phân tích các biến đổi nhiễm sắc thể, biến đổi gen, biến đổi protein

ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho

3 Phân tích mối liên quan giữa một số đặc điểm tủy sinh máu, protein, các biến đổi di truyền với kết quả điều trị bước đầu bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 QUÁ TRÌNH SINH MÁU

Có nhiều giả thuyết khác nhau về quá trình sinh máu, tuy nhiên, năm

1945, sau khi phát hiện ra sự có mặt của tế bào gốc khi nuôi cấy đơn dòng [19], cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, các nhà khoa học đã đưa

ra một sơ đồ sinh máu dựa vào sự phát triển từ một tế bào gốc ban đầu dưới tác dụng của các yếu tố kích thích sinh máu khác nhau để biệt hóa thành các dòng tế bào máu chuyên biệt bao gồm hồng cầu, các loại bạch cầu, mẫu tiểu cầu [31] [87]

1.1.1 Cơ quan sinh máu

Quá trình phát triển của con người trải qua nhiều thời kì khác nhau, kể

từ khi là bào thai cho đến khi trưởng thành Trong quá trình này, cùng với sự phát triển về hình thái bên ngoài là sự phát triển và biệt hóa của các cơ quan sinh máu [19]

1.1.1.1 Sinh máu thời kì phôi thai

Thời kì phôi thai, các tế bào sinh máu đầu tiên xuất hiện ngay khi có túi noãn hoàng, từ khoảng 3 - 12 ngày sau thụ tinh, kết thúc khoảng tháng thứ 2 của thai kì Sau đó, quá trình sinh sản và phát triển của các tế bào máu diễn ra chủ yếu trong gan và lách [31]

- Gan phôi: là cơ quan tạo máu đầu tiên, đỉnh cao của tạo máu gan phôi

là tuần lễ từ tuần thứ 10 - 25 của thai kì Tạo máu tại gan còn kéo dài khoảng

từ 1- 2 tuần sau khi trẻ ra đời

Ngay trong thời kì phát triển phôi thai, các tế bào sinh máu tại gan cũng giảm dần về mật độ, do sự phát triển và biệt hóa của các tế bào gan Tế bào gan có có khả năng sinh sản rất lớn, từ một tế bào ban đầu, qua nuôi cấy dưới

sự tác động của các yếu tố tác động đơn dòng đã phát triển thành hàng ngàn

tế bào khác nhau Trong sinh máu tại gan, chưa có nhiều sự xuất hiện của các

1.1.1.2 Quá trình sinh máu sau sinh

Ở trẻ em, quá trình sinh máu diễn ra trong tủy xương và khu trú dần theo độ tuổi Trong thời kì sơ sinh, tất cả các xương đều tham gia trong quá trình sinh máu, khả năng này giảm dần cho đến khi 20 tuổi [31] [87]

Ở người trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra tại các xương dẹt (khung xương chậu, cột sống, xương ức, xương sườn), còn các xương dài phát triển tổ chức mỡ

Vì thế, tủy xương được mô tả thành hai phần, tủy đỏ và tủy trắng Tủy

đỏ, gồm nhiều tế bào sinh máu, trong đó có hồng cầu tạo mầu đỏ Tủy trắng gồm các tế bào mỡ Tỷ lệ và sự phân bố các tế bào sinh máu và tế bào mỡ cũng thay đổi theo lứa tuổi [61] được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Tỷ lệ và sự phân bố các tế bào sinh máu và tế bào mỡ

Độ tuổi Vị trí sinh máu

Tỷ lệ tế bào sinh máu/

Nguồn: Bone marrow diagnosis, David brown, Kenvin Gatter, năm 2006 [61]

Trong tủy xương sinh máu gồm nhiều phần:

+ Xương

+ Dịch đệm: Mô đệm, tạo ra môi trường sinh máu bao gồm: tế bào lưới,

tế bào xơ, tế bào mỡ, các phân tử như sắt…

+ Tế bào đầu dòng sinh máu: Dòng bạch cầu hạt, dòng hồng cầu, dòng mẫu tiểu cầu

+ Các tế bào khác: Tế bào dòng lympho, tương bào (plasmocyte cell), thực bào

+ Các yếu tố thể dịch

Tất cả tạo ra một vi môi trường thích hợp cho sự sinh sản và biệt hóa của

tế bào sinh máu [40] [61]

1.1.1.3 Cơ quan sinh máu ngoài tủy xương

Cơ quan sinh máu ngoài tủy xương gồm có lách, tuyến ức, hạch lympho

- Lách: Lách là một bộ phận tạo miễn dịch và hoạt hóa đại thực bào, tạo

kháng thể chống bệnh nhiễm trùng rất quan trọng của cơ thể

+ Lách có các nang lympho- vùng tế bào B lympho, và các vùng tế bào T lympho bao quanh động mạch Các nang lympho còn được gọi là các trung tâm mầm làm nhiệm vụ sản xuất kháng thể dịch thể

+ Lách phá hủy hồng cầu, hủy vi khuẩn, các tế bào máu hết thời gian hoạt động- nơi diễn ra quá trình chết theo qui trình (apoptosis) của tế bào + Lách còn là cơ quan dự trữ máu

+ Lách tham gia trong quá trình tạo máu: sản xuất tế bào gốc có khả năng sinh máu [19] [40]

Hạch lympho (lympho node) có các vùng phân bố lympho mang tính

chuyên biệt

+ Vùng trung tâm mầm (Follicular centers): là nơi sinh sản và biệt hóa của B lympho Khu vực áo ngoài của trung tâm mầm tập trung các lympho nhỏ (small lympho) Khu vực trong (màu trắng) là nơi tập trung các lympho lớn (large lympho)

+ Vùng cận vỏ (Paracortex): bao quanh trung tâm mầm, tập trung nhiều

T lympho

+ Vùng tủy và cuống hạch (medullary cords) là vùng tập trung các đại thực bào, B lympho và tương bào (plasmocyte) [73] [87]

1.1.2 Quá trình sinh máu

1.1.2.1 Sơ đồ sinh máu

Có nhiều lý thuyết về nguồn gốc tế bào máu, nhưng có hai thuyết sinh máu chính được đề cập nhiều hơn cả:

+ Thuyết nhiều nguồn: một số tác giả cho rằng: nguồn gốc tế bào máu là

do từ hai, ba hoặc nhiều loại tế bào khác nhau sinh ra

+ Thuyết một nguồn: thuyết này được nhiều người thừa nhận [19]

Thuyết này cho rằng các tế bào máu đều được sinh ra từ tế bào gốc vạn năng, tùy theo sự kích thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn năng này sẽ biệt hoá

để tạo thành những tế bào có chức năng cần thiết Quá trình tạo máu này được thể hiện theo sơ đồ sau (hình 1.1)

Hình 1.1 Sơ đồ sinh máu theo thuyết một nguồn

1.1.2.2 Quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào gốc

Trong sinh máu, tế bào tủy tạo máu có hai chức năng chính là sinh sản

và biệt hóa [61] [87] [136] Tế bào gốc vạn năng (pluripotent hemopoietic stem cells) có khả năng sinh sản lớn và tạo ra tế bào gốc đa năng cho tạo máu Tế bào gốc đa năng (multi- hemopoietic stem cell) là tế bào có khả năng phát triển định hướng dòng tủy hoặc dòng lympho Trực tiếp tạo ra tế bào mẹ cho từng dòng tế bào tạo máu Tế bào gốc định hướng dòng tủy tiếp tục quá trinh sinh sản và biệt hóa dưới tác dụng của các yếu tố kích thích, điều hòa sinh hóa

để trở thành các tế bào gốc đầu dòng đơn dòng dòng hồng cầu, dòng bạch cầu hạt, dòng mẫu tiểu cầu

- Các tế bào sinh sản theo qui trình gián phân, số lượng tế bào gốc vạn năng ít, nhưng số lượng tế bào gốc đầu dòng và tế bào trưởng thành rất lớn Quá trình biệt hóa của tế bào diễn ra hai hiện tượng thay đổi hình thái và sự thay đổi các dấu ấn bề mặt Sự thay đổi này thể hiện các biến đổi rất rõ rệt, mang tính đặc trưng cho từng dòng tế bào máu khác nhau [31]

1.1.3 Dấu ấn miễn dịch trên bề mặt tế bào qua các thời kì phát triển

Mỗi tế bào đều có các đặc trưng riêng về mặt miễn dịch do sự có mặt của các thụ thể (receptor) trên bề mặt màng tế bào [61] Qua các thời kì phát triển của tế bào, đều có các dấu ấn miễn dịch trên bề mặt tế bào khác nhau [71] [73] [87]

Dấu ấn miễn dịch này không chỉ đặc trưng cho các độ tuổi tế bào mà còn mang tính đặc trưng cho từng dòng tế bào riêng [43] [71]

1.1.3.1 Dấu ấn miễn dịch tế bào gốc

Dấu ấn màng đặc trưng đầu tiên cho tế bào máu là dấu ấn CD34 (CD- Cluster of Differentiation- cụm biệt hóa) Sau đó, cùng với quá trình sinh sản

và biệt hóa của tế bào thành các tế bào gốc định hướng dòng tủy hay tế bào gốc định hướng dòng lympho Mật độ dấu ấn CD 34 giảm dần và xuất hiện thêm các dấu ấn khác, khẳng định quá trình biệt hóa [13] [43] [136]

Năm 1981, trong một hội nghị về kháng nguyên màng bạch cầu đã thống nhất đặt tên các dấu ấn màng là CD, đến nay đã có gần 400 CD được xác định trên bề mặt tế bào [28]

Các giai đoạn phát triển khác nhau của dòng bạch cầu hạt, dòng mono, dòng hồng cầu và dòng mẫu tiểu cầu có các dấu ấn khác nhau [61]

1.1.3.2 Quá trình biệt hóa dòng lympho

Chức năng chính và quan trọng nhất của các tế bào dòng lympho là tạo

ra các kháng thể đặc hiệu và các ghi nhớ miễn dịch Các kháng thể đặc hiệu dùng để chống lại các yếu tố tác động ban đầu từ virut, vi khuẩn…[40]

Các tế bào lympho có hai dòng riêng biệt bao gồm: dòng T lympho biệt hóa tại tuyến ức, dòng tế bào B lympho biệt hóa và trưởng thành tại tủy xương Các dòng tế bào lympho T và B khác nhau mang các dấu ấn khác nhau [13] [19] [59] [61]

- Các yếu tố tham gia quá trình biệt hóa của dòng lympho [40] [61]: + CFU-L (Colony Forming unit lympho): Yếu tố tạo cụm lympho + CFU-TL (Colony Forming unit T lympho): Yếu tố tạo cụm

↓

T hỗ trợ

CD4

T độc CD8

Plasmcyte CD38, CD138

Hình 1.2 Các dấu ấn trên bề mặt tế bào lympho qua các giai đoạn phát triển [61]

Dựa trên các dấu ấn biệt hóa trên dòng tế bào người ta có thể xác định được chính xác dòng tế bào và giai đoạn biệt hóa của tế bào [73] Từ năm

1986, trong việc phân loại bệnh bạch cầu cấp, người ta sử dụng các dấu ấn miễn dịch để phân loại các dưới nhóm của BCC dòng lympho T và B, kết hợp với hình thái học [61]

1.2 BỆNH BẠCH CẦU CẤP

1.2.1 Khái niệm và lịch sử

1.2.1.1 Khái niệm chung

Bạch cầu cấp là một tập hợp nhóm bệnh, với đặc điểm chính là tăng số lượng bạch cầu bất thường ở cả trong tủy xương và máu ngoại vi, phá hủy quá trình sinh máu bình thường trong tủy và thâm nhiễm vào các cơ quan [50] [53] [61] [72] [86]

Các tế bào bất thường là nguyên nhân của hàng loạt triệu chứng:

- Phá hủy tủy xương: dẫn đến tính trạng thiếu máu, giảm bạch cầu trung tính, giảm tiểu cầu Các tế bào máu bình thường gồm hồng cầu, bạch cầu hạt

và tiểu cầu cần thiết cho sự tồn tại của một cơ thể sống bị giảm về số lượng ở máu ngoại vi và bị phá hủy quá trình sinh sản trong tủy [23] [86]

- Thâm nhiễm vào các cơ quan: gan, lách, hạch, não, da… [50]

Khi các cơ quan nội tạng bị thâm nhiễm tế bào bất thường, gan, lách to

ra, xuất hiện hạch, gây tình trạng sốt, …Các tế bào bất thường thâm nhiễm vào thần kinh trung ương gây tổn thương não, thâm nhiễm vào xương gây đau xương [86]

1.2.1.2 Lịch sử phát hiện bệnh bạch cầu cấp

Năm 1827, bệnh ung thư máu đựơc ghi nhận lần đầu tiên bởi Velpeau, đến năm 1845 Bennett đặt tên bệnh là Leucocythema (tăng bạch cầu) Sau đó Virchow gọi bệnh này là bệnh White blood (máu trắng), và cuối cùng chính ông đặt cho bệnh một cái tên vẫn còn được sử dụng đến tận bây giờ đó là Leukemia (tiếng Hy lạp có nghĩa là máu trắng) [9] [18] [25] [53]

Những bệnh án ban đầu được thông báo có rất nhiều bạch cầu trong máu bệnh nhân, phù hợp với bệnh cảnh bệnh nhân Leukemia mạn - ung thư máu mạn Đến năm 1889, Ebsstein mới đặt thuật ngữ lơ xê mi cấp - ung thư máu cấp Hai dạng bệnh này không chỉ khác nhau về tiến triển bệnh (cấp hay mạn) mà còn có sự khác biệt về hầu hết các khía cạnh bệnh học như: các biến đổi trên gen, cơ chế bệnh sinh, đặc điểm ác tính của tế bào ung thư và cả phương thức điều trị [9] [72]

1.2.1.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh bạch cầu cấp

Bệnh có các biểu hiện như bệnh nhân có số lượng bạch cầu máu tăng,

có khi tăng rất nhiều làm cho máu có màu trắng [41]

Bệnh thường có các diễn biến bệnh nhanh, bệnh nhân có các biểu hiện như: thiếu máu dẫn đến hoa mắt, chóng mặt; xuất huyết: do giảm tiểu cầu, xuất huyết thành mảng dưới da, chảy máu chân răng; nhiễm trùng: sốt, viêm loét họng miệng… do giảm bạch cầu, tỷ lệ tử vong ở bệnh cao, thời gian sống của bệnh nhân kể từ khi phát bệnh ngắn Bệnh bạch cầu cấp là một bệnh

ác tính của tổ chức sinh máu, được đặc trưng bởi sự tăng sinh của các tế bào bất thường, bắt đầu từ trong tuỷ xương- cơ quan tạo máu, làm cho việc sản sinh ra các tế bào máu bình thường bị hư hại [72] [96] [130]

1.2.2 Phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Bệnh bạch cầu cấp là bệnh lí ác tính của các tế bào đầu dòng tạo máu, các tổn thương vật chất di truyền được coi như nguyên nhân gây ra tình trạng: quá sản- tăng sinh không ngừng tế bào non, loạn sản - rối loạn quá trình apotosis, bất sản – các tế bào non bình thường không trưởng thành được [9] [25] [138]

Theo tiêu chuẩn mới của Tổ chức Y tế thế giới WHO, tiêu chuẩn chẩn đoán bạch cầu cấp là khi có ≥ 20% tế bào bất thường trong tủy xương [46] [86] [121]

- Bạch cầu cấp được chia thành hai thể bệnh chính dựa theo nguồn gốc

đặc điểm về các biến đổi di truyền (nhiễm sắc thể hoặc gen) của các tế bào non ác tính

1.2.2.1 Phân loại dựa vào các đặc điểm hình thái

- L1: Các tế bào bất thường có kích thước nhỏ, tương đối đều, nhân khá mịn [4] [112]

- L2: Các tế bào bất thường kích thước tương đối lớn, không đồng đều, nhân thô, thường có hạt nhân to rõ, nguyên sinh chất rộng vừa, ưa bazơ [46] [121]

- L3: Các tế bào bất thường có kích thước lớn, nhân lớn, lưới mầu thô, nguyên sinh chất rất rộng, có hốc chế tiết, ưa bazơ vừa [100] [121]

1.2.2.2 Phân loại theo dấu ấn miễn dịch dòng T và B lympho

Cách phân loại này được WHO đưa ra từ năm 2001, khi nhận thấy việc phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho cấp theo hình thái không đưa lại hiệu quả cao trong tiên lượng bệnh, và đưa ra tiêu chí phân loại dựa vào các dấu ấn miễn dịch –CD [46] [47] [62] [72]

 Các tế bào bất thường dòng B lympho, sẽ có các dấu ấn CD19, CD22, CD79a, CD20, CD10 [71] [73]

 Các tế bào bất thường dòng T lympho sẽ có các dấu ấn CD7, CD3, CD2 [71] [73]

Các thể bệnh có dấu ấn CD tương ứng được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Các dấu ấn miễn dịch trên tế bào lympho [113] [121] [130]

Dòng B lympho

- Các tế bào dòng B lympho

+ Dấu ấn miễn dịch xuất hiện và có tính ổn định từ đầu dòng đến cuối dòng B lympho là CD 79a BCC dòng B lympho thường được chia thành các dưới nhóm: B sớm, B chung, tiền B và B trưởng thành

+ Các B lympho trưởng thành ngày nay được xếp vào nhóm Burkitt lymphoma [141]

- Các tế bào dòng T lympho: Tế bào lympho T thường có 3 giai đoạn phát

triển chính [56]

+ Giai đoạn sớm (trước tuyến ức): chủ yếu xảy ra trong tủy xương, tiền

T, chủ yếu xuất hiện CD7, các CD biệt hóa khác chưa xuất hiện

+ Giai đoạn tiền T (pre T-cell): tế bào T biệt hóa trên bề mặt vỏ tuyến

ức (T- thymocyte), xuất hiện các dấu ấn CD2, CD5

+ Giai đoạn trưởng thành: xảy ra trong lõi tuyến ức, các dấu ấn CD4, CD8 xuất hiện, biệt hóa thành hai nhóm tế bào T cụ thể, T giúp đỡ CD4, T độc CD8 [92] [128]

Ngoài ra, các dấu ấn miễn dịch còn giúp xác định một số thể bệnh bạch cầu cấp khác như BCC thể tế bào NK, BCC thể lai tuỷ - lympho [54]

Khi tiến hành phân loại bệnh bạch cầu cấp bằng các dấu ấn miễn dịch, các nhà huyết học nhận thấy tỷ lệ các tế bào bất thường có nguồn gốc B lympho chiếm tỷ lệ từ 70 - 75%, cao hơn các tế bào dòng T lympho,bệnh nhân bạch cầu cấp dòng B lympho cũng thường có tiên lượng tốt hơn dòng T lympho [136]

1.3 CÁC NGUYÊN NHÂN GÂY BỆNH BẠCH CẦU CẤP

Nguyên nhân gây bệnh bạch cầu cấp thực sự đến giờ vẫn là một ẩn số, nhưng qua thực nghiệm và thực tế một số nguyên nhân gây bệnh đã được đề cập

1.3.1.Tiền sử gia đình

Những nghiên cứu của trước đây cho thấy, có những gia đình có nhiều người mắc bệnh [78] [96] Nguy cơ mắc bệnh của một thành viên trong anh/ chị sinh đôi cùng trứng cũng đáng chú ý, nếu một người mắc bệnh thì người còn lại cũng có nguy cơ cao mắc bệnh trong thời gian gần Nếu một trong hai trẻ mắc bệnh trong thời gian từ 1 - 4 tuổi, thì tần suất mắc bệnh của đứa trẻ còn lại là 15% [78] [116] [147]

1.3.2 Phóng xạ

Ngay từ khi xảy ra các vụ nổ bom hạt nhân ở Hirosima và Nagasaki trong chiến tranh thế giới thứ hai, người ta đã nhận thấy nhóm người sống sót sau các vụ nổ này cao hơn rất nhiều so với quần thể dân cư khác [9]

Sau vụ nổ nhà máy hạt nhân Trecnoburn, tại Nga, số người bị ảnh hưởng trong vùng nhiễm xạ mắc bệnh cầu cấp cũng rất cao, gấp khoảng 50 lần so với cư dân vùng khác Các bức xạ ion hóa đã gây tổn thương vật liệu di truyền, hoạt hóa các gen tiền ung thư (proto- oncogene) thành gen sinh ung thư (oncogene) thực sự [25]

1.3.3 Hóa chất

Những người tiếp xúc lâu dài với các hóa chất độc hại như benzene, hóa chất vòng Alkyl, có nguy cơ mắc bệnh BCC cao hơn từ 10 - 15% so với nhóm khác [18]

Các hóa chất khác như chloramphenicol, phenylbutalzol cũng có khả năng gây bệnh bạch cầu cấp Ở Việt Nam, tần suất những người có tiếp xúc với thuốc trừ sâu cao gấp 2,5 lần so với nhóm người không tiếp xúc với thuốc

1.4.CƠ CHẾ BỆNH SINH BỆNH BẠCH CẦU CẤP

1.4.1 Sự hoạt động của các gen ung thư (oncogene)

Các gen bình thường do yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư – gọi là gen ung thư (oncogene) [18] [23] [130] Sản phẩm của các gen ung thư là các protein bất thường, có hoạt tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào [41] [53] [72]

Các gen gây ung thư- oncogene được chia thành 4 nhóm chính:

- Oncogene mã hóa protein là yếu tố tăng sinh, gen này hoạt động quá

mức dẫn đến tình trạng sinh sản của tế bào mất kiểm soát [23]

- Oncogene mã hóa protein là các thụ thể tiếp nhận tín hiệu trên màng tế bào: vị trí tiếp nhận protein tạo cụm tế bào bị thay đổi, chỉ tạo được một dòng

tế bào mà không có khả năng tạo dòng tế bào khác Tạo ra tính lấn át của các

tế bào ác tính trong tủy sinh máu [53] [72]

- Oncogene mã hóa protein là các chất truyền tin từ màng qua bào tương vào tế bào: các protein mang chất truyền tin bị sai lệch đẫn đến sự loạn sản của tế bào [41]

- Oncogene nhân là các gen mã hóa cho protein nằm trong nhân tế bào Khi các gen bình thường trong nhân bị thay đổi cấu trúc và trở thành các oncogen mã hóa cho các protein gắn vào ADN, hoạt động như các yếu tố phiên mã, ảnh hưởng đến toàn bộ quá trình phiên mã và dịch mã sẽ bị sai lệch, dẫn đến sự rối loạn sinh sản và biệt hóa của tế bào [83]

1.4.2 Gen ức chế u

Người ta đã chứng minh được trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát sự tăng sinh, đó là các gen ức chế u (tumor suppressor gene) [142] Khi những gen này bị mất hoặc bất hoạt, dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, gây ra u [23] [147]

Hiện nay, đã có nhiều gen ức chế u được tìm thấy và trong đó, nghiên cứu nhiều nhất là gen p53 trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 17, mã hóa cho photphoprotein 53kDa Có trên 230 đột biến gây bất thường gen p53, gen p53 tham gia vào quá trình điều hòa phân bào Khi chức năng bình thường của chúng bị mất đi thì tế bào phân chia không kiểm soát được Đó là nguyên nhân của nhiều bệnh lí máu bất thường trong đó có bệnh bạch cầu cấp dòng lympho [65] [142]

1.4.3 Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Nếu một oncogen hoạt động đơn lẻ, chưa đủ điều kiện để dẫn tới tình trạng ác tính Khi có sự phối hợp hoạt động của nhiều oncogen, hoặc có sự phối hợp với gen ức chế sự phát triển khối u, mới làm các tế bào bình thường trở thành tế bào ác tính [23] [121] [153]

Cơ chế chuyển dạng ác tính bao gồm các dạng sau:

- Chuyển đoạn hoặc cấu trúc lại nhiễm sắc thể: Các chuyển đoạn bất thường giữa các NST (chuyển đoạn giữa các gen BCR/ ABL), hay dư thừa hoặc khuyết thiếu NST (thừa NST số 8) [72] [86] [92] [121]

- Đột biến điểm: thay đổi thành phần, hoặc số lượng nucleotit trên các ADN hoặc có thể là sự thay thế các nucleotit [90] [92] [103]

- Nhân gen (lặp gen): thừa NST 8, NST 21 [92]

- Kết hợp yếu tố khuyếch đại: virut gây ung thư gắn bộ gen của mình vào các vị trí oncogene, dẫn đến kích thích tế bào tăng sinh [103] [117]

1.4.4 Một số biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho

Khi nghiên cứu về BCC dòng lympho, người ta nhận thấy, có rất nhiều các bất thường về vật chất di truyền được ghi nhận Các bất thường này có giá trị cao trong việc đưa ra tiên lượng cho bệnh nhân [87] [121]

Các biến đổi di truyền thường gặp và tiên lượng trong BCC dòng lympho được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Các biến đổi di truyền và tiên lượng trong

BCC dòng lympho [118] [121] [130]

Tiên lượng Loại bất thường

Tốt Trên lưỡng bội : >50 NST

Chuyển đoạn t(12;21)

Trung bình Trên lưỡng bội từ 47-50 NST

46XX/XY (bộ NST bình thường) Chuyển đoạn t(1;19)

Chuyển đoạn t(9;22) Chuyển đoạn t(11q23), t(4;11) Chuyển đoạn t(5;14)

Giá trị tiên lượng nói lên khả năng đáp ứng thuốc, điều trị của các bệnh nhân BCC dòng lympho [142] Các bất thường di truyền được ghi nhận trong khoảng từ 80 - 90% bệnh nhân mắc BCC dòng B- lympho, và vì có giá trị cao trong tiên lượng bệnh, nên tổ chức y tế thế giới WHO đã đưa ra tiêu chuẩn sử dụng các bất thường di truyền để phân loại bệnh BCC dòng B lympho [130] [147] Tuy nhiên, các bất thường di truyền chỉ được ghi nhận ở khoảng 50-60% bệnh nhân BCC dòng T lympho và cũng không có giá trị cao trong tiên lượng bệnh, nên đối với việc phân loại BCC dòng T lympho, WHO không đề cao tiêu chuẩn các bất thường về mặt di truyền [121] [129]

1.4.4.1 Các bất thường tế bào di truyền ở BCC dòng B Lympho

Khi nghiên cứu các bất thường di truyền trong tủy xương bệnh nhân BCC dòng B lympho, nhận thấy chủ yếu gặp các bất thường sau:

- Trên lưỡng bội có trên 50 NST: loại bất thường về số lượng cấu trúc NST này gặp với tần suất từ 25 - 30% số ca bệnh BCC ở trẻ em, bất thường

số lượng NST dẫn đến tình trạng tăng lượng ADN của các tế bào non ác tính

dòng lympho trong tủy Phần lớn trẻ em mắc BCC lympho có số NST trên 50 đều ở độ tuổi từ 2- 10 [75] [121] Các nhóm NST thường gặp thêm là NST 2,

3, 4, 10, 18, thường có tiên lượng tốt Tuy nhiên, nếu có trên 50 NST nhưng

có thêm các chuyển đoạn khác đi kèm, bệnh có thể có tiên lượng chỉ ở mức trung bình [77] [113]

- Trên lưỡng bội từ 47-50 NST: tần xuất gặp xấp xỉ 15%, có kèm các bất thường về cấu trúc- khoảng 1/3 Các nhóm thường có thêm NST là 8, 13,

21 Không có nhiều khác biệt về đặc điểm lâm sàng, hình thái, và miễn dịch huyết học ở nhóm bệnh nhân này, so với nhóm có trên 50 NST, nhưng về độ tuổi có thể lớn hơn, số lượng bạch cầu máu ngoại vi tăng cao hơn [90] [100] [103] [121]

- Bộ nhiễm sắc thể bình thường 46XX hoặc 46XY: gặp ở khoảng 10% bệnh nhân trẻ em, và có khoảng 30% ở người trưởng thành Nhóm này có tiên lượng trung bình [58] [77] [121]

- Thiểu bội: số bệnh nhân có dưới 46 NST chiếm từ 2-9% số lượng các bất thường Phần lớn bệnh nhân có 45 NST, thường mất một NST 20 ở trẻ em Không có biểu hiện lâm sàng, hình thái hay miễn dịch khác biệt [58] [75] [121]

- Các bất thường cấu trúc (pseudodiploid- giả lưỡng bội): xuất hiện trong khoảng 40% số bệnh nhân BCC trẻ em, và khoảng 55% người trưởng thành Hiệu quả điều trị có liên quan đến loại đột biến khác nhau [58] [121]

Bảng 1.4 Các đột biến cấu trúc thương gặp ở BN BCC dòng lympho [121]

Chuyển đoạn NST Bất thường gen mức phân tử

t(9;22)(q34;q11)

t(4;11)(q21;q23)

gen ABL-BCR gen MLL-AF4 gen E2A-PB

IL-3/IgH

E2A/HLF

+ Chuyển đoạn t(9;22)(q34;q11): gặp nhiều trong BCC dòng B

lympho, là chuyển đoạn gen ABL (Alberson) trên NST 9q34 và BCR (Breakpoint cluster region – vùng cụm điểm gãy) trên NST 22q11 Chuyển đoạn này thường hay gặp ở bệnh nhân bệnh bạch cầu mạn tính Tuy nhiên, phân tích bằng các kĩ thuật phân tử như khuyếch đại chuỗi polyme - PCR, lai miễn dịch huỳnh quang - FISH cho thấy, chuyển đoạn này gặp nhiều trong BCC trẻ nhi, và khoảng ½ người trưởng thành BCC dòng lympho có tiền sử bạch cầu mạn có đứt vùng BCR Trong bạch cầu mạn, phân tử chuyển đoạn

có kích thước 210kD, là sản phẩm của major breakpoint (điểm gãy chính) Trong BCC dòng lympho, sản phẩm có kích thước 190kD, là sản phẩm của minor breakpoint (điểm gãy phụ) [38] [109] [121] Đoạn 11 trên cánh dài NST số 22 bị đứt a, chuyển đến gắn vào cánh dài NST số 9, và đoạn 34 trên cách dài NST số 9 đứt ra, chuyển đến gắn trên cánh dài NST số 22 (hình 1.3)

Bệnh nhân BCC dòng lympho có chuyển đoạn này có một số đặc điểm liên quan đến hình thái của các tế bào non: kích thước lớn, nhân to, thô, nguyên sinh chất có thể tìm thấy nhiều hạt

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa chuyển đoạn gen ABL/BCR

Về lâm sàng, BCC dòng lympho có chuyển đoạn ABL/BCR ở người lớn tuổi có các đặc điểm: số lượng bạch cầu tăng, thâm nhiễm nội tạng và hệ thần kinh trung ương [67] [79]

Tiên lượng bệnh nhóm có chuyển đoạn ABL/BCR trước đây không cao Tuy nhiên gần đây, với sự ra đời của các thế hệ thuốc điều trị mới như Imatinib, tác dụng trực tiếp lên các vị trí chuyển đoạn, nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn ABL/BCR được đánh giá là một trong những nhóm đạt hiệu quả cao trong điều trị

+ Đảo đoạn 11q23 tại điểm MLL, không có đặc điểm đặc trưng về hình thái, về lâm sàng thường có tăng cao số lượng bạch cầu và lách to Đặc điểm

về dấu ấn miễn dịch khá đặc trưng: CD10 dương tính- đây là dấu ấn dòng B sớm, có thể xuất hiện đồng thời với CD15, CD33, CD13 Nhóm bệnh nhân có đảo đoạn 11q23 cũng thường có tiên lượng bệnh xấu [114]

+ Chuyển đoạn gen MLL/AF4 t(4;11)(q21;q23): các chuyển đoạn

này liên quan đến gen MLL nằm trên NST số 11 và gen AF4 nằm trên NST

số 4 [115] [121] [124] Nghiên cứu phân tử về MLL, Pui CH (2008) đã nhận thấy gen MLL có thể có sự kết hợp giữa đầu N trên MLL và đầu C của 40 gen khác nhau tạo ra các tổ hợp gen mới [117] Trong đó, tổ hợp gen MLL/AF4 tạo ra một sản phẩm là MLL protein, protein này thúc đẩy hoạt động phiên

mã, dẫn đến tình trạng rối loạn biểu hiện của gen điều khiển HOX, gây tăng cao số lượng bạch cầu, số lượng non ác tính

Hình 1.4 Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen MLL/AF4 [117]

Những bệnh nhân dương tính với chuyển đoạn này thường gặp ở trẻ dưới 1 tuổi với tần xuất 50-70%, ở người trưởng thành khoảng 5% [114]

Nhóm có chuyển đoạn MLL/AF4 thường gặp ở bệnh nhân BCC dòng B lympho, và thường có số lượng bạch cầu tăng, thâm nhiễm thần kinh trung ương [115] [121] [142] Tỷ lệ sống sót của nhóm này thấp [33] [44]

+ Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13): chuyển đoạn xảy ra giữa gen E2A

và gen PBX là một trong nhữ chuyển đoạn xuất hiện nhiều ở trẻ em Chuyển đoạn này có thể là chuyển đoạn cân bằng t(1;19)(q23;p13) hoặc không cân bằng der (19) (q23;p13) Tuy vậy, kết quả của các chuyển đoạn này là sự hoạt động của gen kết thúc E2A trên NST 19p13 và gen PBX1trên NST 1q23 [89] [92] [105]

Hình 1.5 Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen E2A/PBX

Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) không có nhiều khác biệt về hình thái của các tế bào non ác tính nhưng về đặc điểm dấu ấn miễn dịch có nhiều sai khác, CD19, CD10 dương tính, nhưng CD20 thường âm tính [121]

Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) thường có báo cáo về tiên lượng không tốt với điều trị bằng hóa chất [38] [94] [150]

+ Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22): là chuyển đoạn giữa gen TEL và

gen AML1 có tần xuất gặp nhiều ở trẻ em [49] [151] [153]

Chuyển đoạn này không dễ phát hiện khi phân tích karyotype, thường được phát hiện bằng kĩ thuật PCR hoặc FISH Chuyển đoạn này không gặp ở

các trường hợp trên lưỡng bội >50 NST, nhưng có thể xuất hiện cùng các dạng bất thường về số lượng NST khác [121]

Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) là sự chuyển dịch của gen TEL trên NST 12p23 đến gen AML1 trên NST 21q22 [85] [86] [96]

Hình 1.6 Hình ảnh minh họa chuyển đoạn gen AML1/TEL

Về hình thái và miễn dịch tế bào non ác tính, bệnh nhân BCC dòng lympho có chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) không có nhiều khác biệt [121]

Chuyển đoạn này thường có tiên lượng tốt, nguy cơ bội nhiễm thấp [96] [99] [121]

1.4.4.2 Các bất thường tế bào di truyền ở BCC dòng T lympho

Các loại bất thường di truyền trong BCC dòng T lympho cũng tương tự như dòng B lympho Tuy nhiên, các bất thường trong dòng T lympho, không

có giá trị cao trong tiên lượng bệnh như dòng B lympho [121]

Các loại bất thường di truyền thường gặp ở BCC dòng T lympho:

- Chuyển đoạn t(11;14): chuyển đoạn này chiếm khoảng từ 40 - 50% số bệnh nhân BCC dòng T lympho, chuyển đoạn này ít gặp ở BCC dòng B

TEL

AMLI-TEL AMLI

lympho Khoảng ½ số BN này có đứt điểm trên thụ thể tế bào T (T- cell Receptor) 14q11, ở vị trí gen TCRδ, bất thường này thường có tiên lượng xấu [69] [92]

- Chuyển đoạn t(10;14), gặp với tần xuất từ 2-5% ở bệnh nhân BCC dòng T lympho nhưng cũng là chuyển đoạn hiếm gặp ở BCC dòng B lympho [63][90]

- Trên lưỡng bội 50NST cũng có gặp trong BCC dòng T lympho, thường

có tiên lượng xấu [74]

Các bất thường di truyền trong BCC T lympho không có giá trị trong tiên lượng, nhưng một vài mối liên quan giữa đột biến gen và lâm sàng đã được ghi nhận Các tứ bội thường gặp ở trẻ nhỏ, lâm sàng xấu, tế bào non ác tính thường có kích thước lớn [69]

1.5 KĨ THUẬT PCR TRONG PHÁT HIỆN CÁC BIẾN ĐỔI GEN

+ 4 loại deoxyribonucleotide (dNTP): Adenin (dATP), Thymine (dTTP), Guanin (dGTP), Cytosine (dCTP)

+ DNA chứa các đoạn DNA cần nhân bản trong phản ứng

+ Các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược, bản chất là các đoạn

oligonucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với hai đầu đoạn DNA cần nhân bản

+ Ion Mg++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp

+ Dung dịch đệm Tris- KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng Khi hỗn hợp dung dịch này được cho vào máy biến đổi nhiệt (thermal cycler), dưới tác dụng biến đổi của chu trình nhiệt độ, phản ứng nhân bản sẽ xảy ra [36] [63]

1.5.2 Các dạng kĩ thuật PCR được áp dụng trong nghiên cứu

Có hai dạng kĩ thuật PCR được áp dụng trong phát hiện các bất thường gen trong bệnh BCC, tùy thuộc vào loại sản phẩm di truyền tách chiết ban đầu

là mRNA hay DNA:

- RT-PCR (Reverse Transcription PCR): Sao chép ngược, enzyme phiên

mã ngược hoạt động, từ sợi đơn ARN được để tổng hợp mạch kép bổ xung (tạo sợi đôi cADN) Dưới tác dụng của nhiệt độ cao (94 độ C), enzyme phiên

mã ngược sẽ bị bất hoạt Sau đó, quá trình tổng hợp để tạo các bản sao đoạn sợi cADN có trình tự gen bất thường được phát hiện bởi các cặp mồi, sẽ thực hiện liên tục

Hình 1.7 Hình ảnh minh họa cho quá trình sao mã ngược tạo sợi đôi cADN từ sợi đơn ARN và quá trình tổng hợp sợi ADN [29]

- Nested - PCR ( PCR lồng): Tổng hợp các bản sao cADN ngay từ sợi đôi gốc Kĩ thuật này cho phép tăng độ nhậy của các cặp mồi phát hiện đột biến Bao gồm hai chu trình lồng vào nhau:

+ Chu trình 1: dùng cặp mồi nhận biết đoạn oligonucleotit dài

+ Chu trình 2: dùng cặp mồi đặc trưng đột biến để nhân lên đoạn ngắn hơn từ đoạn dài đã có [29] [103] [141]

1.6 HOẠT ĐỘNG CỦA HỆ PROTEIN TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÕNG LYMPHO

1.6.1 Tác động của hệ protein lên hoạt động tế bào

1.6.1.1 Khái niệm về hệ protein

Protein bản chất là một chuỗi acid amin, là sản phẩm đầu ra của gen

trong tế bào Trình tự các acid amin được mã hóa bởi các bộ ba nucleotit trên gen, hay nói cách khác, protein là sản phẩm thể hiện hoạt động của gen [139]

1.6.1.2 Biểu hiện và chức năng của protein

Sự biểu hiện hoặc chức năng của các protein được điều hòa tại nhiều thời điểm, từ phiên mã đến dịch mã và cả sau dịch mã [139] Sau dịch mã, đa phần các phân tử protein lại bị biến đổi hóa học bởi các tương tác protein-protein, hay các phản ứng với nhóm carbohydrat, phosphate… chính những biến đổi này đóng vai trò chủ yếu trong kích hoạt chức năng của nhiều protein chứ không phải được mã hóa trực tiếp từ gen [82] Kết quả là từ một gen ban đầu, ta có thể tìm thấy sự đa dạng về biểu hiện, cấu trúc và chức năng của rất nhiều loại protein khác nhau [81] Một số nghiên cứu cho thấy, từ một gen có thể phát sinh tới sáu protein ở người [139]

Thực ra, chỉ có khoảng 2% số bệnh tật đã biết được xác định do có sai

lệch về trình tự gen [132] 98% số bệnh còn lại cần được làm sáng tỏ ở mức

độ tương tác giữa các protein [91] Điều này chứng tỏ, nhiều cá thể có bộ gen hoàn toàn bình thường nhưng vẫn mắc bệnh, nguyên nhân có thể là do sự sai lạc trong các cấu trúc và mối tương tác, biểu hiện của các protein [35] [63]

Vì vậy, ngày nay nhiều nghiên cứu đang tập trung vào việc phát hiện các protein chỉ thị bệnh Protein chỉ thị bệnh là một trong số các chỉ số sinh học (biomarker) được tạo ra một cách bất thường tại một thời điểm nào đó của đời sống tế bào hoặc bệnh nhân, có tác dụng như một dấu hiệu báo trước [143] Sự bất thường này được biểu hiện thông qua nhiều con đường như lượng protein nhiều hơn bình thường, hoặc protein xuất hiện không đúng thời điểm đã được mã hóa sẵn trong chu trình tế bào Các protein này thường là sản phẩm của quá trình ghép nối sai các mảnh phiên mã mARN hoặc các dạng biến đổi bất thường sau quá trình dịch mã, vì vậy các bất thường này không có nguyên nhân là các bất thường gen, không phát hiện được ở mức độ gen [34] Nhiều protein chỉ thị bệnh đã được phát hiện, nhận dạng trong huyết thanh và đã được phát triển thành kit chẩn đoán bệnh như: Apolipoprotein AI

(Zhang et al., 2004; Kozak et al., 2005) [97] [154]

Nghiên cứu về protein là nghiên cứu về các chức năng của gen, có thể trả lời được các câu hỏi [60] [98] [143]:

- Phần nào của gen được biểu hiện?

- Gen biểu hiện ở đâu, khi nào và có bao nhiêu sản phẩm được biểu hiện?

- Các sản phẩm protein bị biến đổi như thế nào, chúng tương tác với nhau như thế nào?

1.6.2 Các protein bất thường liên quan đến bệnh bạch cầu cấp

Dựa vào các kĩ thuật phân tích protein như điện di hai chiều nhuộm huỳnh quang (2D-DIGE), sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS)… người ta đã phát hiện ra rất nhiều protein bất thường có liên quan đến bệnh bạch cầu cấp [60] [88] Sự có mặt với số lượng lớn hoặc biểu hiện quá mức của các protein này trực tiếp tác động lên quá trình truyền tải thông tin thúc đẩy tế bào sinh sản không ngừng, gây rối loạn tạo máu [98] [156]

- Protein CREB (response element binding protein): Mã hóa cho nhân

tố đáp ứng cAMP, điều khiển các gen chịu trách nhiệm cho các quá trình tăng

số lượng, sinh trưởng và biệt hóa tế bào [143] CREB được phát hiện có biểu hiện thừa cả ở mức độ phiên mã mARN và protein trong tủy xương ở hầu hết bệnh nhân BCC, là một nguyên nhân thúc đẩy sự tăng sinh liên tục của các tế bào non ác tính Vì vậy, mức độ biểu hiện của protein CREB được xem như một chỉ thị theo dõi diễn biến bệnh BCC [56]

-PRAME (preferentially expressed antigen in melanoma), một loại

kháng nguyên đặc trưng cho sự xuất hiện của các khối u ác tính, được nhận thấy có biểu hiện quá mức ở 52.9% bệnh nhi mắc bệnh BCC [111]

1.6.3 Tác động của các protein khác

1.6.3.1 Tác động của các protein bất thường

Mức độ biểu hiện bất thường của các protein trong những trường hợp không có bất thường về cấu trúc là một trong những nguyên nhân khiến rút ngắn đời sống bệnh nhân Tương tự như vậy là sự xuất hiện của các protein liên quan đến bệnh khác, gây rối loạn chuyển hóa, protein gây bệnh ung thư khác đồng thời đều ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng sống tiếp của bệnh nhân [4]