2.4.3.1. Hóa chất
- dNTP: các nucleotit tự do, để tổng hợp sợi đơn DNA. - Taq DNA: enzyme tách sợi đôi DNA ban đầu để nhân gen. - MgCl2: ion hoạt hóa.
- Primer- Mồi xuôi và ngƣợc:dùng để tổng hợp đoạn DNA đặc trƣng cho các đột biến. Trình tự các mồi (lựa chọn cặp mồi có tần xuất gặp nhiều nhất) [140].
A, Cặp mồi cho chuyển đoạn t(8;21)(q23;p13), đặc trưng bởi chuyển đoạn gen E2A/PBX
E2A-A : CACCAGCCTCATGCACAAC PBX-B : TCGCAGGAGATTCATCACG E2A-C : CACCCTCCCTGACCTGTCT PBX-D : GGCCTGCTCGTATTTCTCC PBX-E3: TGAACTTGCGGTGGATGAT
B, Chuyển đoạn gen MLL/AF4
MLL-A : CCGCCTCAGCCACCTAC AF4-B : TGTCACTGAGCTGAAGGTCG
MLL-C : AGGACCGCCAAGAAAAGA AF4-D : CGTTCCTTGCTGAGAATTTG MLL-E5: AAGCCCGTCGAGGAAAAG
C, Chuyển đoạn gen AML1/TEL:
AML1-A : CTACCGCAGCCATGAAGAACC TEL-B : AGAGGAAGGCCCATTGCTGAA AML1-C : ATGACCTCAGGTTTGTCGGTCG TEL-D : TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCT AML1-E : TGGCTGGCAATGATGAAAACTACT
D, Chuyển đoạn gen ABL/BCR
BCR-e1-A: GACTGCAGCTCCAATGAGAAC ABL-a3-B: GTTTGGGCTTCACACCATTCC BCR-e1-C: CAGAACTCGCAACAGTCCTTC ABL-a3-D: TTCCCCATTGTGATTATAGCCTA ABL-a3-E: TGACTGGCGTGATGTAGTTGCTT
* Trình tự mồi được lấy theo nghiên cứu của Van Dongen J. và cộng sự
[140].Mồi đƣợc đặt tại mua tại hãng Invitrogen, Mỹ.
- Thạch Agarose 1.5%, Invitrogen, Mỹ.
- Loading dye: dung dịch hiển thị màu, Biorad, Mỹ.
- Dung dịch nhuộm màu điện di: Ethidium Bromide, Invitrogen, Mỹ. - DNA chuẩn, 100bp, Invitrogen, Mỹ.
- Kit tách chiết RNA từ huyết tƣơng, GE heath, Thụy Điển. - Dung dịch điện di TBE 1x: Invitrogen, Mỹ.
- Chứng dƣơng, chứng âm: đƣợc cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu bệnh dịch khu vực Châu Á- Thái Bình Dƣơng Namru II, Indonesia.
2.4.3.2 Trang thiết bị
- Máy li tâm tốc độ cao, Eppendoft, Đức. - Máy li tâm thƣờng: Kubota, Nhật Bản.
- Máy biến đổi nhiệt (Thermo cycle): 96 giếng, Biorad, Mỹ. - Bể điện di Biorad.
- Bàn có đèn UV light đọc kết quả điện di, Biorad, Mỹ. - Vortex, AppliBiosystem, Mỹ.
- Tủ pha hóa chất vô trùng: Sanyo, Nhật Bản. - Máy chụp ảnh gen Polar, Mỹ.
2.4.3.3. Kĩ thuật RT-PCR
- Bệnh phẩm: 1ml dịch tủy xƣơng. - Li tâm 5000v/phút x 10 phút. - Tách lấy huyết tƣơng.
- Cho 100µl huyết tƣơng vào chính giữa ống cột lọc.
- Dùng dung dịch rửa 1 và 2 để rửa sạch, và phá vỡ màng bạch cầu. - Li tâm tốc độ 13.000v/p x 5 phút.
- Kit tách chiết sử dụng cột lọc có lƣới silica, kết dính sợi ARN, sau đó dùng 50µl dung dịch tách để tách các sợi ARN ra khỏi lƣới. Li tâm 13.000v/phút x 3 phút, các ARN sẽ tách ra khỏi lƣới silica, rơi xuống tuýp eppendoft.
- Dùng 20µl sản phẩm tách chiết đƣợc để sử dụng cho quá trình khuyếch đại cùng các dNTP, mồi, MgCl2, H2O, Taq polymerase vừa đủ 50µl.
- Thực hiện chu trình biến đổi nhiệt: + PCR nhiệt độ và thời gian chu kỳ. • Ban đầu tan : 95 ° C trong 30 giây.
• Chu trình biến đổi nhiệt PCR. 94 ° C trong 30 giây : dãn xoắn. 65 ° C trong 60 s (gắn mồi).
72 ° C trong 60 s ( tổng hợp chuỗi). • Số chu kỳ lặp lại: 35.
• Kết thúc PCR: 16 ° C (hoặc nhiệt độ phòng). + Vòng PCR thứ hai lồng PCR: Nested PCR. • 1 ml của vòng PCR đầu tiên.
• Cùng một khối lƣợng, hóa chất và các điều kiện chu kỳ cho lần đầu tiên vòng PCR.
- Sản phẩm của các quá trình khuyếch đại đƣợc lấy 5µl trộn với 1µl dung dịch nhuộm màu- loading dye, trên giấy paraffin.
- Thạch agarose 1.5%: 100mg, hòa tan trong 100ml nƣớc cất, đun sôi, đổ khuôn, để nguội, tạo giếng điện di.
- Nhỏ sản phẩm khuyếch đại đã trộn thuốc nhuộm màu vào giếng. - Điện di một chiều trong dung dịch TBE [140].
- Đọc kết quả trên UV light.
2.4.4. Kĩ thuật phân tích protein
2.4.4.1. Hóa chất
- Kit loại bỏ albumin và γ-Immunolobulin: Aurum serum protein mini kit, hãng Biorad- Mỹ.
- Aceton lạnh 80%.
- Đệm ETP: 20mM EDTA pH 8.1, 0.2M tris- HCl pH8.9, 7% PEG 6000). - Đệm lectin ConA, hãng Amersham, Mỹ.
2.4.4.2. Trang thiết bị
- Máy li tâm thƣờng: Kubota, Nhật Bản. - Cột điện di ái lực đa lectin.
- Máy điện di phối phổ hai chiều 2-DE, hãng Beckton Dickenson, Mỹ.
2.4.4.3. Kĩ thuật định danh và định lượng protein trong huyết thanh
- Bệnh nhân nhịn ăn, lấy 10ml máu.
- Li tâm 3000vòng/ phút x 10 phút, tách lấy huyết tƣơng. - Dùng kit để lọc tách albumin.
- Thu nhận các protein bền nhiệt từ protein huyết thanh đƣợc thu nhận theo phƣơng pháp của Goufman và cộng sự , 2006. Li tâm tốc độ cao, thu phần nổi, sau đó tủa trong aceton lạnh, ở -20oC.
- Phân tách glycoprotein bằng cột ái lực đa lectin, sắc kí ái lực.
- Xác định hàm lƣợng protein bằng thuốc nhuộm protein để phân tích các protein có trong huyết thanh bệnh nhân BCC [91].
- Điện di hai chiều 2-DE: phân tích các protein theo điểm đẳng điện. Hệ thống phân tích protein theo điểm đẳng điện trên hệ thống: POTEANIEF, hãng Biorad, Mỹ.
- Điện di lần hai - điện di một chiều, để phân tích trình tự các protein bất thƣờng.
- Thủy phân Trypsin, sau khi thủy phân các chỗi peptit đƣợc tách ra khỏi gel và đƣợc phân tích trên hệ thống khối phổ.
- Săc kí lỏng nano đa chiều (MDNano LC), kết hợp phân tích khối phổ QSTAR®XL nhận dạng các trình tự protein.
- Kết quả thu đƣợc sẽ đƣợc đối chiếu với dữ liệu tại ngân hàng protein thế giới.