SM: Băng chuẩn ADN(50bp).
1: Chứng dương cho AML1 (334bp).
2: Chứng dương cho tổ hợp gen AML1/TEL (412bp).
3: Mẫu bệnh nhân dương tính với chuyển đoạn gen AML1/TEL và cón một gen AML1 bình thường.
3.3.2.3. Tỷ lệ chuyển đoạn gen E2A/PBX ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho
Trong nghiên cứu của chúng tôi có 8/34 bệnh nhân BCC dòng lympho có chuyển đoạn gen E2A/PBX chiếm 23,58% (hình 3.23).
Hình 3.23. Tỷ lệ bệnh nhân BCC dòng lympho có chuyển đoạn gen E2A/PBX
Chuyển đoạn E2A/PBX là chuyển đoạn q23 trên nhiễm sắc thể số 1 và đoạn p13 trên nhiễm sắc thể 19. Chuyển đoạn E2A/PBX trong nghiên cứu của chúng tôi có 7/66 bệnh nhân chiếm 10,61%. Trong nghiên cứu Hunger SP [89], tỷ lệ chuyển đoạn E2A/PBX trong BCC dòng lympho nói chung từ 5%- 6%, nhƣng với BCC dòng B lympho, tỷ lệ này là 20%. Theo Robert M [121], tỷ lệ có chuyển đoạn E2A/PBX thƣờng chiếm 5%- 6% tổng số bệnh nhân, tỷ lệ gặp riêng trong dòng BCC dòng B lympho là 25%. A. Kamel [94] thì có kết quả phân tích chuyển đoạn gen E2A/PBX gặp 24/134 bệnh nhân nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 17,9%. Năm 1984, Williams đã mô tả chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13) là một chỉ điểm cho những trƣờng hợp có nguy cơ cao tái phát hệ thần kinh trung ƣơng [151]. Trong cả ngƣời lớn và trẻ em, chuyển đoạn gen E2A/PBX chủ yếu xuất hiện trên các bệnh nhân BCC dòng B lympho. Tổ hợp gen E2A/PBX mã hóa cho yếu tố hoạt hóa phiên mã hỗn hợp, còn đƣợc gọi là oncoprotein (protein gây ung thƣ). Từ đó, làm tế bào tăng sinh không kiểm soát đƣợc [38][89]. Bảng 3.18 so sánh kết quả phân tích chuyển đoạn gen E2A/PBX của chúng tôi so với các tác giả khác đã công bố.
23.58%
74.42%
E2A/PBX
Bảng 3.18. So sánh kết quả phân tích chuyển đoạn gen E2A/PBX của chúng tôi so với các tác giả khác đã công bố
Tác giả Năm Tỷ lệ Hunger SP [89] 1996 5% -6% Robert M [121] 2006 5% - 6% Kamel A [94] 2007 17,9% Đỗ T. Vinh An 2011 10,63%
Kết quả bảng 3.18 cho thấy tỷ lệ chuyển đoạn gen E2A/PBX trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn so với các tác giả Hunger và Robert, nhƣng lại thấp hơn so với kết quả của Kamel A. Nhận dạng sự có mặt của chuyển đoạn gen E2A/PBX cho phép giải thích một số trƣờng hợp bệnh nhân có số lƣợng bạch cầu tăng cao, có nguyên nhân từ sự hoạt động của tổ hợp gen E2A/PBX thúc đẩy quá trình sinh sản quá mức của các tế bào non ác tính.
3.3.2.4. Tỷ lệ biến đổi gen MLL/AF4 ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho
Trong nhóm các bệnh nhân có các chuyển đoạn gen nghiên cứu, có 7/34 bệnh nhân BCC dòng lympho có biến đổi gen MLL/AF4 chiếm 20,59%. (hình 3.25).
Hình 3.24. Tỷ lệ bệnh nhân BCC dòng lympho có chuyển đoạn gen MLL/AF4 trong nhóm có biến đổi gen nghiên cứu
Khi phân tích 66 bệnh nhân BCC dòng lympho, chúng tôi thu đƣợc kết quả có 8 bệnh nhân có chuyển đoạn MLL/AF4, chiếm tỷ lệ 12,12%. Nhiều nghiên cứu khác nhau về chuyển đoạn MLL/AF4, có các kết quả khác nhau. Kamel A., gặp tỷ lệ này rất thấp 1%, trong nhóm bệnh nhân ông nghiên cứu [94]. V Duke, thấy ở ngƣời trƣởng thành mắc bệnh bạch cầu cấp chuyển đoạn gen này đƣợc phát hiện với tỷ lệ khoảng từ 10% - 15% [68].
Bảng 3.19. So sánh kết quả phân tích chuyển đoạn gen MLL/AF4 của chúng tôi với các tác giả khác đã công bố
Tác giả Năm công bố Tỷ lệ %
Duke V.M [68] 2005 10%-15% Kamel A [94] 2007 1% Đỗ T. Vinh An 2011 12,12 * Nhận xét: 20.59% 79.41% MLL/AF4 các chuyển đoạn khác
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi có chuyển đoạn gen MLL/AF4 cao hơn nhóm bệnh nhân trong nghiên cứu của Kamel nhƣng lại tƣơng tự nhƣ kết quả nghiên cứu của Duke. Kamel chỉ nghiên cứu về tần xuất có chuyển đoạn gen MLL/AF4 trong những bệnh nhi mắc bạch cầu cấp dòng lympho tại Ai Cập [94], nên tỷ lệ gặp chuyển đoạn này có thể không cao. Duke lại nghiên cứu trên ngƣời trƣởng thành [68], với 54/66 bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi là ngƣời trƣởng thành thì kết quả nghiên cứu của chúng tôi không có nhiều khác biệt so với tác giả khác.
Meztler và cộng sự nhận thấy chuyển đoạn MLL/AF4 gắn liền với một tiên lƣợng xấu [104], còn theo Huret những bệnh nhân có chuyển đoạn gen thời gian sống ngắn, tái phát nhanh, dƣới một năm [90]. Duke V.M nhận thấy: tổ hợp gen MLL/AF4 tạo ra một phức hợp protein tác động trực tiếp vào quá trình biệt hóa của tế bào gốc, hoặc tạo ra một protein gián tiếp tham gia vào quá trình hình thành các u, vì nó chỉ đƣợc tìm thấy trong các u tế bào B của ngƣời [68].
3.4. SO SÁNH CÁC NHÓM BỆNH NHÂN CÓ BẤT THƢỜNG SỐ LƢỢNG NHIỄM SẮC THỂ VÀ CÓ CÁC CHUYỂN ĐOẠN GEN MLL/AF4, E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL VÀ TỶ LỆ TẾ BÀO NON ÁC TÍNH TRƢỚC VÀ SAU ĐIỀU TRỊ
Các bất thƣờng nhiễm sắc thể, chuyển đoạn gen có liên quan trực tiếp đến đánh giá khả năng đáp ứng thuốc của bệnh nhân BCC dòng lympho. Bệnh nhân lui bệnh hoàn toàn có tỷ lệ tế bào non ác tính trong tủy dƣới 5%, chƣa lui bệnh sẽ có tỷ lệ tế bào non ác tính cao hơn trên 5%. Kết quả phân tích các nhóm bệnh nhân có bất thƣờng nhiễm sắc thể, các chuyển đoạn gen với tỷ lệ tế bào non ác tính sau điều trị hóa chất đƣợc trình bày ở bảng 3.20, bảng 3.21 dƣới đây.
Bảng 3.20. Kết quả phối hợp đặc điểm tế bào di truyền ở bệnh nhân BCC dòng lympho sau điều trị hóa chất
Đặc điểm biến đổi
Lui bệnh hoàn toàn (<5% tế bào non ác
tính/tủy)
Lui bệnh không hoàn toàn (>5% tế bào non
ác tính /tủy) >50 NST 3 0 47- 50 NST 1 1 38 NST 0 1 ABL/BCR 4/9 5/9 AML/TEL 8/9 1/9 MLL/AF4 2/7 5/7 E2A/PBX 3/8 5/8 Nhận xét: - Nhóm bệnh nhân có các bất thƣờng số lƣợng : 47- 50 NST, 38 NST và nhóm có chuyển đoạn gen MLL/AF4, E2A/PBX, ABL/BCR, tỷ lệ tế bào non ác tính <5% thấp hơn so với nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn gen AML/TEL và nhóm bệnh nhân có trên 50 NST [103] [121] [142].
- Khi nghiên cứu các bất thƣờng di truyền của bệnh nhân BCC dòng lympho, các tác giả nhƣ Vanes, Robert, đều nhận thấy, các bệnh nhân có trên lƣỡng bội nhiễm sắc thể, với số lƣợng nhiễm sắc thể trên 50 đều có tiên lƣợng tốt, đáp ứng bền vững với điều trị hóa chất [121] [142]. Nhóm bệnh nhân thiểu bội, có số nhiễm sắc thể ít hơn 46, có tiên lƣợng xấu, bất kể các phƣơng
pháp điều trị tích cực hiện có. Theo Robert M (2006), các bệnh nhân có số lƣợng nhiễm sắc thể từ 47 đến 50 nhiễm sắc thể thƣờng có tiên lƣợng trung bình, khả năng đáp ứng thuốc thay đổi tùy thuộc vào từng cá thể, số lƣợng bạch cầu máu, tuổi bệnh nhân [121]… Tuy nhiên, trong nghiên cứu Raimondi cho rằng trong nhóm bệnh nhân BCC dòng lympho này, nếu tăng đơn độc nhiễm sắc thể 21 có tiên lƣợng tốt nhƣ nhóm bệnh nhân có trên 50 nhiễm sắc thể [118].
Bảng 3.21. So sánh tỷ lệ tế bào non giữa các nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn gen trước và sau điều trị
Loại chuyển đoạn
Tỷ lệ % tế bào non ác tính trung bình trong tủy xƣơng
Trƣớc điều trị Sau điều trị
ABL/BCR 67 12
MLL/AF4 65 11,3
AML1/TEL 54 5,3
Hình 3.26. Tỷ lệ tế bào non ác tính trước và sau điều trị ở các bệnh nhân có chuyển đoạn gen MLL/AF4, E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL
Nhận xét:
+ Tỷ lệ tế bào non ác tính trung bình ở bệnh nhân có các chuyển đoạn gen MLL/AF4, E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL trƣớc khi điều trị hóa chất gần tƣơng tự nhau.
+ Tỷ lệ tế bào non ác tính sau khi điều trị ở bệnh nhân có chuyển đoạn gen AML1/TEL là thấp nhất trong các chuyển đoạn gen MLL/AF4, E2A/PBX, BCR/ABL, AML1/TEL.
Khi nghiên cứu về gen TEL và gen AML, các nhà khoa học nhận thấy gen TEL và gen AMl đều mã hóa cho yếu tố phiên mã nhân, tổ hợp gen này phá vỡ chức năng bình thƣờng của gen, tạo ra một yếu tố ức chế phiên mã, làm suy giảm biểu hiện của gen AML. Nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn gen này có yếu tố tiên lƣợng bệnh tốt, độc lập với các yếu tố nguy cơ chuẩn lâm sàng nhƣ độ tuổi và số lƣợng bạch cầu. Tỷ lệ sống khỏi (số tế bào non ác tính
67 65 54 48 12 11.3 5.3 15 0 10 20 30 40 50 60 70 80
ABL/BCR MLL/AFF4 AML/TEL Category 4
Tỷ lệ % tế bào non ác tính trước điều trị
Tỷ lệ % tế bào non ác tính sau điều trị
trong tủy xƣơng dƣới 5%), kéo dài trên 5 năm có thể đạt tới 90% [117]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ tế bào non ác tính ở bệnh nhân có chuyển đoạn gen AML/TEL sau điều trị có giá trị trung bình là 5,3%, hầu nhƣ những bệnh nhân này đều đạt ngƣỡng lui bệnh hoàn toàn. Có 1/10 bệnh nhân có chuyển đoạn AML/TEL còn 7% tế bào non ác tính, bệnh nhân 70 tuổi, hạn chế về độ tuổi, có thể là một trong nguyên nhân chƣa đạt lui bệnh hoàn toàn.
Khoảng 20-30% bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho B, có mang nhiễm sắc thể Ph1, với sự tổ hợp gen ABL/BCR mã hóa cho protein ABL/BCR. Bình thƣờng, những vùng trên protein BCR và ABL liên quan đến con đƣờng truyền tín hiệu tế bào, ảnh hƣởng đến việc tăng sinh tế bào, sự chết tế bào, và sự gắn kết giữa các tế bào. Protein BCR/ABL có hoạt tính tyrosine kinase cao, đóng vai trò trung tâm trong tiến triển bệnh BCC dòng lympho [117]. Trƣớc đây, chuyển đoạn gen ABL/BCR đƣợc đánh giá là một chuyển đoạn có tiên lƣợng xấu, nhƣng gần đây với sự ra đời của các thuốc ức chế đặc hiệu hoạt tính của tyrosine kinase nhƣ Imatinib, tiên lƣợng của nhóm bệnh nhân mang chuyển đoạn gen này đã đƣợc cải thiện đáng kể [77]. Điều đó lí giải vì sao trong nghiên cứu của chúng tôi và các nghiên cứu khác gần dây, nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn gen ABL/BCR có tỷ lệ tế bào non ác tính trung bình sau điều trị khá thấp 12% (bảng 3.21). Bệnh nhân duy nhất có tỷ lệ tế bào non ác tính vẫn cao sau khi kết thúc 28 ngày điều trị là bệnh nhân bạch cầu cấp dòng T lympho. Trong nghiên cứu của Robert M (2006), ông nhận thấy các biến đổi di truyền rất có giá trị trong tiên lƣợng của bệnh nhân bạch cầu cấp dòng B lympho, thì đối với dòng T lympho lại không có giá trị trong tiên lƣợng bệnh. Các bệnh nhân bạch cầu cấp dòng T lympho thƣờng có tiên lƣợng bệnh kém hơn, khả năng đáp ứng thuốc chậm hơn [121].
Những nghiên cứu phân tử đã chỉ ra rằng, chuyển đoạn gen MLL/AF4 là chuyển đoạn khó phát hiện ở mức độ tế bào- nhiễm sắc thể, nhƣng khi dùng các kĩ thuật phân tử PCR, FISH, khả năng phát hiện cao hơn. Gen MLL bình thƣờng ở trạng thái mã hóa cho protein có khả năng gắn kết ADN và có vai trò quan trọng trong hoạt động phiên mã của các gen liên quan đến quá trình biệt hóa [104]. Trong chuyển đoạn MLL/AF4, gen MLL chuyển tới gắn với gen AF4 ở nhiễm sắc thể số 4, làm mất đi hoạt tính bình thƣờng của gen MLL và sản phẩm protein của nó mất khả năng gắn kết ADN, làm cho tế bào không biệt hóa đƣợc [121][142]. Dẫn đến tình trạng không có các tế bào máu bình thƣờng để đảm nhận chức năng sống của cơ thể. Tổ hợp gen MLL/AF4 đƣợc đánh giá là yếu tố có tính tiên lƣợng xấu ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho, đặc biệt ở trẻ nhỏ. Theo Godley, nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn gen MLL/AF4, có thể có tỷ lệ đáp ứng thuốc ban đầu tốt nhƣng sau đó khả năng tái phát cao, không phụ thuộc độ tuổi [75]. Kết quả bảng 3.20 cho thấy, tỷ lệ tế bào non ác tính trung bình của nhóm có chuyển đoạn MLL/AF4 là 11,3%, trong đó có 2 bệnh nhân đạt lui bệnh hoàn toàn, tỷ lệ tế bào non ác tính dƣới 5%, nhƣng khi theo dõi các bệnh nhân có chuyển đoạn này, nhận thấy có 4 bệnh nhân tái phát tế bào non ác tính sau 42 ngày điều trị hóa chất.
Chuyển đoạn gen E2A- mã hóa cho các yếu tố tăng cƣờng gắn kết nằm trên nhiễm sắc thể 19, và gen PBX mã hóa cho protein gắn kết ADN nằm trên nhiễm sắc thể số 1, tạo ra tổ hợp gen E2A/PBX. Chuyển đoạn này có tƣơng quan nhiều với một số biểu hiện cận lâm sàng nhƣ số lƣợng bạch cầu tăng cao. Nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn gen E2A/PBX có tiên lƣợng xấu, đáp ứng kém với hóa trị liệu và khả năng thâm nhiễm thần kinh trung ƣơng cao [75][116][117]. Nhóm bệnh nhân có chuyển đoạn E2A/PBX trong nghiên
cứu có tỷ lệ tế bào non ác tính trung bình sau điều trị cao nhất 15%, nguyên nhân có thể là do số lƣợng bạch cầu cao bởi các tế bào non ác tính bị kích thích sinh sản do các tín hiệu protein là sản phẩm của tổ hợp gen E2A/PBX, sau một đợt hóa trị liệu ban đầu, tủy xƣơng vẫn còn tế bào non ác tính.
Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu về tỷ lệ tế bào non ác tính sau điều trị hóa chất của chúng tôi cũng tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu và biện luận của các tác giả khác về mức độ biểu hiện, ảnh hƣởng của các bất thƣờng về số lƣợng nhiễm sắc thể và tổ hợp sau các chuyển đoạn gen AML/TEL, ABL/BCR, MLL/AF4, E2A/PBX đối với hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, đây là nghiên cứu mới về việc sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong phát hiện sự có mặt của các chuyển đoạn gen có giá trị cao trong tiên lƣợng bệnh bạch cầu cấp dòng lympho tại Việt Nam.
3.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PROTEIN HUYẾT THANH BN BẠCH CẦU CẤP DÕNG LYMPHO
* Đối tƣợng: 05 BN
3.5.1. Loại bỏ albumin và IgG và phân tích các peptide bằng phƣơng pháp nanoLC MS/MS
3.5.1.1. Loại bỏ albumin và IgG
Trong huyết thanh ngƣời, albumin chiếm từ 50% đến 71%, và các IgG chiếm khoảng 10% lƣợng protein tổng số. Vì vậy, chúng ảnh hƣởng rất lớn đến việc phát hiện các protein ở nồng độ thấp. Việc loại bỏ hai thành phần này là một bƣớc quan trọng trong nghiên cứu proteome huyết thanh bằng phƣơng pháp sắc kí kết nối phối phổ. Trong thí nghiệm này, albumin và IgG đƣợc loại bỏ bằng Aurum Serum TM
protein mini kit, các dung dịch điện di bám cột và qua cột đƣợc định lƣợng, kiểm tra thành phần bằng phƣơng pháp
Bradford và điện di SDS-PAGE 12,6% [4].
Kết quả điện di thu đƣợc cho thấy phần lớn các protein có hàm lƣợng cao nhƣ albumin, IgG đã đƣợc loại bỏ. Các protein hàm lƣợng thấp đã đƣợc làm giàu đáng kể, giúp cho quá trình phân tích tiếp theo đƣợc thuận lợi hơn rất nhiều [4].
3.5.1.2. Phân tích hỗn hợp peptide bằng phương pháp nano LC MS/MS
Các peptide- các protein hàm lƣợng thấp, đƣợc phân tách trên hệ thống sắc kí lỏng hai chiều nano LC để làm sạch và làm đơn giản các thành phần trƣớc khi đƣợc đƣa vào phân tích trên hệ phối phổ liên tục. Máy khối phổ QSTARTMXL quét phổ của các ion đƣợc tạo ra qua nguồn ESI đƣợc phần mềm Analyst QS xác định và chuyển sang chế độ MS/MS, để phân tích trình tự và so sánh với các dữ liệu protein hiện có trên ngân hàng protein thế giới [4].
Kết quả:
Bằng phƣơng pháp nanoLC- phân tích dƣới nguyên tử, đã nhận dạng