Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein IFNγ người trong hệ thống biểu hiện E. coli ở quy mô phòng thí nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHTRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌCTS NGUYỄN HOÀNG CHƯƠNG

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

i DANH MỤC CÁC BẢNG iii

1.1.3 Phân loại và nguồn gốc 4

1.2 Interferon gamma (IFN-γ)) 6

1.2.1 Cấu trúc protein IFN-γ) 6

1.2.2 Sự tạo thành protein IFN-γ) 7

1.2.3 Cấu trúc thụ thể và con đường truyền tín hiệu của protein IFN-γ) 8

1.2.3.1Cấu trúc thụ thể của IFN-γ) 8

1.2.3.2Con đường truyền tín hiệu của protein IFN-γ)

10 1.3 Ứng dụng điều trị xơ gan và những tác động của protein IFN-γ) 12

1.3.1 Ứng dụng điều trị xơ gan của protein IFN-γ) 12

1.3.2 Những tác động của protein IFN-γ) trong điều trị bệnh 14

1.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi trong tế bào vi khuẩn E coli 19

1.4.1 Ưu điểm biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào E coli 19

1.4.2 Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E coli 20

1.4.3 Chủng E coli, hệ thống vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong biểu hiện protein 20

1.4.3.1 Chủng E coli BL21(DE3) Star

20 1.4.3.2 Hệ thống vector biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi sử dụng promoterT7 21

2.1 Vật liệu 25

2.1.1 Chủng vi sinh vật 25

2.1.2 Vector 25

2.1.3 Gen IFN-γ) 26

2.1.4 Các mồi dùng cho giải trình tự 26

2.1.5 Các thang chuẩn dùng cho điện di 27

2.1.6 Các kháng thể dùng cho lai Western blot 27

2.2 Hóa chất 27

2.2.1 Hóa chất dùng cho điện di DNA 27

2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt 28

2.2.3 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 28

2.2.4 Hóa chất dùng tinh sạch DNA từ gel Agarose 28

2.2.5 Hóa chất dùng biến nạp plasmid 28

2.2.6 Hóa chất dùng cho điện di protein 28

2.2.7 Hóa chất dùng cho western blot 28

2.2.8 Hóa chất dùng biểu hiện protein mục tiêu 29

2.2.9 Hóa chất dùng cho ELISA 29

2.2.10 Hóa chất dùng hòa tan IFN-γ) từ tế bào E coli

29 2.2.11 Hóa chất dùng cho tinh chế protein tái tổ hợp

30 2.3 Dụng cụ và thiết bị 30

2.4 Phương pháp 30

2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp 30

2.4.2 Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli khả nạp 31

2.4.3 Cắt mở vòng vector pNanogen bởi cặp enzyme NdeI/HindIII 31

2.4.4 Tạo vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ) 31

2.4.5 PCR khuẩn lạc 32

2.4.6 Quy trình nuôi cấy chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ) sinh tổnghợp protein IFN-γ) ở quy mô phòng thí nghiệm 33

2.4.7 Phương pháp điện di SDS-PAGE 34

2.4.8 Phương pháp lai western blot 34

2.4.9 Phương pháp ELISA 35

2.4.10 Thu nhận protein IFN-γ) từ tế bào E coli 36

2.4.11 Tinh sạch protein IFN-γ) 37

2.4.12 Sắc ký HPLC 39

2.5 Sơ đồ tóm tắt toàn bộ quy trình thực hiện các thí nghiệm 40

2.5.1 Quy trình tạo dòng E coli biểu hiện protein IFN-γ) 40

2.5.2 Quy trình lên men thu nhận protein IFN-γ) 41

2.5.3 Quy trình tinh chế thu nhận protein IFN-γ) 42

3.1 Tạo dòng vi khuẩn E coli biểu hiện protein IFN-γ) 43

3.1.1 Thu nhận gen IFN-γ) 43

3.1.2 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen IFN-γ) 44

3.1.3 Tạo dòng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ) biểu hiện protein IFN-γ)

46 3.1.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E coli BL21(DE3) Star/ pNanogenIFN-γ) trên môi trường LB 47

3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men biểu hiện protein IFN-γ) 48

3.2.1 Khảo sát thời điểm cảm ứng biểu hiện IFN-γ) 48

3.2.2 Khảo sát nồng độ IPTG 50

3.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy trong quá trình cảm ứng 51

3.2.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy sau cảm ứng ảnh hưởng đến sự biểu hiện protein IFN-γ) 53

3.3 Nuôi cấy chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ) biểu hiện protein IFN-γ) trên môi trường LB ở quy mô 500 ml trong điều kiện tối ưu

54 3.4 Tinh sạch protein IFN-γ) 55

3.4.1 Tách chiết protein IFN-γ) 55

3.4.2 Tinh sạch protein IFN-γ) 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC CÁC BẢNG PHỤ LỤC 74

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTCác kí hiệu, chữ

viết tắt Thuật ngữ tiếng Anh

Thuật ngữ tương đươngtiếng Việt

APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên

dsRNA double strand Ribonucleic Acid RNA sợi đôi

kDa kiloDaltone Đơn vị đo trọng lượngphân tử protein

LBKan Luria-Bertani Kanamycin Môi trường LB bổ sung kanamycin

Factor

Nhân tố hoạt hóa đại thực bào

MCS Multicloning site Vị trí gắn chèn gen trên vector

MHC (I, II) Major Histocompatibility

NKT Natural Killer T cell Tế bào T giết tự nhiên

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Bảng 3.1: Kết quả đo OD600 trên môi trường LB, kết quả lặp lại 3 lần 47

Bảng 3.2: Hàm lượng protein IFN-γ) tại thời điểm cảm ứng, kết quả lặp lại 6 lần 49

Bảng 3.3: Hàm lượng protein IFN-γ) tại các nồng độ IPTG, kết quả lặp lại 6 lần 51

Bảng 3.4: Hàm lượng protein IFN-γ) tại các nhiệt độ, kết quả lặp lại 6 lần 52

Bảng 3.5: Hàm lượng protein IFN-γ) theo thời gian cảm ứng, kết quả lặp lại 6 lần 54

Hình 1.3: Mô hình cấu trúc IFN-β ở người 5

Hình 1.4: Mô hình cấu trúc IFN-γ) ở người 5Hình 1.5: Mô hình cấu trúc monomer IFN-γ) ở người 7

Hình 1.6: Mô hình cấu trúc dimer của IFN-γ) ở người 7

Hình 1.7: Sự hình thành IFN-γ) bởi tế bào T/NK 8

Hình 1.8: Cấu tạo thụ thể của protein IFN-γ) 10

Hình 1.9: Sự truyền tín hiệu của protein IFN-γ) 11

Hình 1.10: Tỉ lệ nhiễm viêm gan siêu vi B trên toàn thế giới 13

Hình 1.11: Những tác động của protein IFN-γ) 14

Hình 1.12: Cơ chế kháng virut của protein IFN-γ) 16

Hình 1.13: Cơ chế điều hòa âm của hệ thống operon lac

22

Hình 1.14: Cơ chế kiểm soát âm và dương ở operon lac

24

Hình 2.1: Vector pNanogenIFN-γ) 25Hình 2.2: Các thang chuẩn dùng trong kỹ thuật điện di 27

Hình 2.3: Điều kiện phản ứng PCR 33

Hình 3.1: Kết quả thu nhận đoạn gen IFN-γ)

43

Hình 3.2: Vector pNanogenIFN-γ) 44Hình 3.3: Kết quả PCR khuẩn lạc để sàng lọc dòng tái tổ hợp 45

Hình 3.4: Kết quả kiểm tra vector pNanogenIFN-γ) bằng phản ứng cắt với enzyme

NdeI/HindIII 46

Hình 3.5: Đường cong tăng trưởng của chủng E coli BL21(DE3) Star mang

vector

tái tổ hợp pNanogenIFN-γ) 48Hình 3.6: Khảo sát thời điểm cảm ứng IPTG 49Hình 3.7: Khảo sát cảm ứng nồng độ IPTG 50

Hình 3.8: Kết quả khảo sát theo nhiệt độ cảm ứng 52

Hình 3.9: Khảo sát biểu hiện IFN-γ) theo thời gian 53 Hình 3.10: Kết quả lên men 500 ml trong chai

Schott 54

Hình 3.11: SDS-PAGE công đoạn tách chiết protein IFN-γ) 55

Hình 3.12: Phổ đồ phương pháp lọc gel lần 1 56

Hình 3.13: SDS-PAGE phương pháp lọc gel lần 1 57

Hình 3.14: Phổ đồ giai đoạn cation 58Hình 3.15: Kết quả SDS-PAGE công đoạn cation 58

Hình 3.16: Phổ đồ công đoạn lọc gel lần 2 59Hình 3.17: Kết quả SDS-PAGE công đoạn lọc gel lần 2 60

Hình 3.18: SDS-PAGE (A) và western blot (B) các giai đoạn tinh chế 60

Hình 3.19:Phổ đồ kiểm tra độ sạch của mẫu tinh chế IFN-γ) bằng HPLC

61

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về IFN 1.1.1 Lịch sử phát hiện

Đầu những năm 1920, người ta đã nhận thấy khi các tế bào bị nhiễm virut thì các tế bào đó và các tế bào lân cận không bị nhiễm tiếp bởi chính các virut ấy và các virut khác Năm 1937, Findlay và Mac Callum đã nhận thấy nếu nhiễm virut Rift vào khỉ, sau đó nhiễm tiếp liều gây chết virut sốt vàng thì khỉ không bị bệnh sốt vàng Hai ông gọi hiện tượng này là sự can thiệp (interference) của virut [1] Năm 1957, Alick Isaac và Jean Lindenman ở Viện nghiên cứu Y học Quốc gia Luân Đôn đã tiến hành một thí nghiệm quan trọng mang tính lịch sử Họ nhận thấy rằng khi nhiễm virut cúm sống vào phôi gà đang phát triển mà trước đó đã nhiễm virut cúm bất hoạt bằng nhiệt thì virut mới không thể nhân lên được Nếu nghiền phôi thành dịch rồi tiêm truyền vào phôi gà khác thì cũng ngăn cản sự nhânlên của các virut trong phôi gà Hai ông cho rằng hiện tượng này có liên quan đến sự tạo thành một chất đặc biệt trong tế bào nhiễm virut và đặt tên cho nó là

interferon viết tắt là IFN [1], [39]

Vào năm 1965, 8 năm sau khi phát hiện ra IFN, Wheelock đã trình bày sự xuất hiện của một chất có khả năng kháng lại vi sinh vật giống như IFN trong dịch nổi của môi trường nuôi các tế bào bạch cầu của người sau khi chúng được ủ với lectin phytohemagglutinin thực vật (PHA) [76]

Năm 1966, Glasgow có giả thuyết rằng sản phẩm IFN có vai trò không chỉ trong thời gian đầu của quá trình xâm nhiễm virut mà còn có vai trò trong giai đoạn sau khi đã xâm nhiễm Để chứng minh quan điểm của mình, ông đã gây miễn dịch

chuột với virut Chikungunya và kiểm tra sản phẩm IFN thu được trong in vitro với

loại virut tương tự Kết quả là hoạt tính của tế bào bạch cầu thu được từ chuột đã được gây miễn dịch cao gấp 4 lần so với chuột ban đầu Tuy nhiên tại thời điểm đó, ông không giải thích được sự tồn tại của IFN-γ) trong thí nghiệm quan sát Mặcdù vậy, trong phần thảo luận của mình ông cũng biện luận rằng: “sản phẩm IFN tạo ra bởi tế bào bạch cầu sau khi đã bị xâm nhiễm virut có vai trò trong quá trình miễn dịch của mô hay tế bào” [26]

Vào cuối những năm 1960, định nghĩa về “cảm ứng miễn dịch” của IFN đã được xác định một cách tương đối rõ ràng Năm 1972 và 1973, người ta thừa nhận rằng IFN cảm ứng miễn dịch có sự khác nhau về đặc tính sinh hóa so với IFN cảm ứng bởi virut Rebecca Falcoff đã mô tả đặc điểm của IFN cảm ứng bởi kháng thể kháng bạch cầu và cho thấy rằng nó dễ bị biến tính với axit và khả năng di chuyểnkhác so với IFN cảm ứng bởi virut trên sắc ký DEAE-cellulose và lọc gel Dựa vào những kết quả nghiên cứu được, tác giả đã kết luận: “IFN được tổng hợp bởi các tế bào của hệ miễn dịch dưới tác động của tác nhân gây miễn dịch được gọi là IFN miễn dịch” Trong một nghiên cứu quan trọng khác, Youngner và Salvin đã cho thấy rằng, chuột bị nhiễm BCG (một dạng của vi khuẩn lao) khi được tiêm với

một vi khuẩn cổ Tuberculin thì thấy có sự ức chế mạnh mẽ quá trình phát triển của

vi khuẩn Sự ức chế này là đặc tính của IFN, nhưng IFN này lại có sự khác nhau so với IFN cảm ứng bởi virut Dựa vào đó, tác giả đã kết luận rằng: “IFN tạo ra

bởi vi khuẩn cổ Tuberculin trong chuột đã gây miễn dịch với BCG là một loại

phân tử có khả năng ức chế vi sinh vật và được xác định là lớp II của IFN” Trong khi đó năm 1979, trình tự axit amin đầu của IFN ở tế bào bạch cầu và tế bào sợi ở người đã được khám phá, và cho thấy có sự tồn tại của phân tử IFN tương đồng trong chuột Vào đầu những năm 1980, Committee đã đồng ý với đề xuất về thuật ngữ IFN-α và IFN-β về một lớp của IFN, cả hai loại đều tồn tại ở trạng thái ban đầu và xuất hiện sự đồng nhất Mặc dù IFN cảm ứng miễn dịch không tồn tại ở trạng thái ban đầu nhưng Committee đã nhận ra thành phần chính của nó rất khác so với IFN-α và IFN-β, và đặt tên cho nó là IFN-γ), qua đó giải quyết được những tranh luận về lựa chọn giữa “type II IFN” và “IFN miễn dịch” Năm 1990, lần đầu tiên Sydney Peska đã thành công trong việc tạo dòng và sản xuất chế phẩm từ interferon (được tổ chức FDA của Mỹ cấp giấy chứng nhận) đó là interferon alfa có khả năng điều trị viêm gan siêu vi B và C [1], [2], [21], [65], [81]

1.1.2 Đặc điểm chung

IFN là một nhóm các protein tự nhiên được tạo ra do các tế bào của hệ miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virut, vi khuẩn, kí sinh trùng và tế bào ung thư Nó chỉ được tổng hợp khi có mặt các chất sinh

IFN (còn gọi là IFNogen) IFN thuộc một lớp glycoprotein được biết đến dưới cái tên cytokine (chất hoạt hoá tế bào) IFN đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch, nó là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại virut và sự phát triển bất thường của tế bào IFN là một phần của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immune system) và được kích hoạt trong giai đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm trước khi hệ miễn dịch đặc hiệu (specific immune system) có thờigian để phản ứng Cần phân biệt IFN nội sinh được sinh ra trong cơ thể và IFN ngoại sinh do nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể [18]

IFN có phân tử lượng thấp, khoảng 15 kDa (kiloDaltone) đến 25 kDa, dễ bị phân giải bởi các enzyme như trypsin, pepsin IFN khá bền nhiệt, hoạt tính chỉ bị mất khi đun nóng ở 65-70oC trong một giờ hoặc 100oC trong 5 phút Ở 4oC có thể bảo quản IFN trong nhiều tháng IFN cũng bền với axit, ở giá trị pH thấp (pH=2) hoạt tính hầu như không bị mất

IFN có tính kháng nguyên yếu Chúng xuất hiện sau khi tế bào bị kích thích và tồntại trong máu một vài ngày đến một vài tuần Đặc tính sinh học quan trọng của IFN là không có tác dụng đặc hiệu đối với virut mà chỉ cảm ứng trạng thái kháng virut của tế bào, IFN không phải chỉ được sinh ra trong các tế bào bị nhiễm virut mà IFN còn được tạo thành khi tế bào bị kích thích bởi một số chất lạ khác như: axit nucleic, vi khuẩn , độc tố của vi khuẩn, nguyên sinh động vật Vì vậy sự hìnhthành IFN là do sự kích thích của nguồn thông tin lạ hay dưới tác động của bất cứ nguồn thông tin ngoại lai nào

Trong các tế bào không bị nhiễm virut, các gen cấu trúc chịu trách nhiệm tổng hợpIFN luôn ở trạng thái không hoạt động, do đó ở tế bào bình thường không tạo nên IFN Khi virut xâm nhập hoặc các chất kích thích ngoại lai khác vào tế bào, chúnggiải tỏa sự kìm hãm và hoạt hóa các gen cấu trúc này Thông tin từ gen cấu trúc này được sao chép thành mARN tương ứng của tế bào và chính mARN này điều khiển việc tổng hợp IFN IFN sau khi sinh ra, một phần ở lại trong tế bào, còn

phần lớn ngấm qua vách tế bào ra ngoài để ngấm vào các tế bào khác (Hình 1.1)

1 Virut xâm nhiễm vào tế bào

2 Dưới tác động của virut, các nhân tố trong tế bào sẽ di chuyển vào nhân và kích thích các gen của IFN tạo mRNA

3 mRNA di chuyển ra khỏi nhân và được dịch mã tạo ra interferon 4 IFN được tổng hợp sẽ ở lại một phần trong tế bào và phần lớn sẽ di

chuyển sang các tế bào bên cạnh và kích hoạt trạng thái kháng virut ở các tế bào đó

5 IFN chuyển sang các tế bào bên cạnh sẽ di chuyển vào nhân và kích thích tế bào tiết ra các protein có khả năng kháng lại virut

Các tế bào chịu tác động của IFN sẽ ức chế sự tổng hợp RNA hoặc DNA virut Dovậy, IFN được sử dụng như chất điều trị không đặc hiệu cho mọi nhiễm trùng virut Trạng thái kháng virut có thể nhanh chóng lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác, điều này giải thích tại sao cơ thể động vật có thể hoạt động nhanh như vậy để chống lại virut ở tất cả các cơ quan được cảm ứng [23], [51], [81] 1.1.3 Phân loại và nguồn gốc

IFN là những protein được sinh ra bởi những tế bào bạch huyết hay tế bào sợi Chúng có vai trò chống lại khối u, kháng virut hay gây đáp ứng miễn dịch… Dựa vào những đặc điểm như kháng nguyên, hoạt tính sinh học hay các thụ thể mà người ta chia IFN thành 3 lớp:

Lớp I: Bao gồm IFN-α (Hình 1.2) và IFN-β (Hình 1.3) IFN-α có ít nhất 15 nhóm

phụ có khối lượng phân tử khoảng 18 kDa Nguồn tế bào chính sản xuất IFNα là bạch cầu đơn nhân IFN-β là glycoprotein với khối lượng phân tử khoảng 20 kDa, tế bào chủ yếu sản xuất IFN-β là nguyên bào sợi [1], [2]

Lớp II: IFN-γ) là thành phần duy nhất của IFN lớp II, có cấu trúc khác hoàn toàn so

với IFN lớp I (Hình 1.4), bám vào các thụ thể khác nhau và được mã hóa bởi

nhiễm sắc thể khác nhau IFN-γ) hay còn gọi là IFN miễn dịch vì được tế bào T đã

Virut

Virut m ớ i

T ế b à o ch ủ 1T ế b à o ch ủ 1

Hình 1.1: Sự hình thành IFN

hoạt hóa tạo thành nên thực chất cũng là một tế bào miễn dịch IFN-γ) là glycoprotein gồm 2 chuỗi giống nhau với khối lượng phân tử từ 15 tới 24 kDa được mã hóa bởi các gen giống nhau, các gen này có vị trí nằm trên nhiễm sắc thể

số 12 và bao gồm 3 đoạn intron IFN-γ) được sản xuất bởi các tế bào T, B, tế bào

trình diện kháng nguyên, tế bào giết tự nhiên…[3], [10], [79]

Lớp III: Thành phần duy nhất mới được khám phá hiện nay là IFN-λ với những

nghiên cứu còn tương đối hạn chế và đang được tiến hành nghiên cứu nhiều

người

Hình 1.4: Mô hình cấu trúc IFN-γ) ở người

1.2 Interferon gamma (IFN-γ)) 1.2.1 Cấu trúc protein IFN-γ)

Protein IFN-γ) đã được nghiên cứu rất rộng rãi Ở người, protein IFN-γ) được dịch mã từ một đoạn mRNA dài khoảng 1,2 kb tạo thành một chuỗi polypeptide chứa khoảng 166 axit amin (Hình 1.5) Vị trí đầu amio axit ở axit amin thứ 23 tạo thànhcấu trúc kỵ nước đặc biệt, đây là cấu trúc mà khi bị ly giải sẽ tạo thành phân tử protein IFN-γ) hoàn chỉnh với 143 axit amin và có trọng lượng phân tử khoảng 17 hơn n ữa

Hình 1.2: Mô hình cấu trúc IFN-α ở Hình 1.3: Mô hình cấu trúc IFN-β ở người

kDa Ở chuột, bản sao mRNA được dịch mã thành chuỗi polypeptide chứa 134 axit amin, chuỗi polypeptide này có thể bị phân giải tại 2 vị trí đầu N để tạo nên phân tử có kích thước từ 15, 20 và 25 kDa Quá trình thủy giải không làm ảnh hưởng tới hoạt tính hay chức năng của IFN-γ) nhưng nó lại gây ảnh hưởng tới trạng thái tồn tại cũng như độ bền của phân tử Protein IFN-γ) trưởng thành ở người và chuột chỉ có khoảng 36% trình tự chuỗi polypeptide giống nhau [3], [29], [44]

Về mặt sinh lý học, hai chuỗi polypeptide của IFN-γ) có thể kết hợp với nhau để tạo thành một cấu trúc homodimer (Hình 1.6) Cấu trúc homodimer của IFN-γ) không bền, chúng có thể bị biến tính bởi nhiệt độ (to > 65oC) hoặc pH (pH < 4, pH > 9) Cấu trúc homodimer này có thể được xác định ở cấu trúc tinh thể của IFN-γ) ở người, thỏ và bò Cấu trúc này nói lên rằng cấu trúc đầu tiên của IFN-γ) có dạng xoắn ốc với mỗi monomer có chứa 6 xoắn alfa (A-F hay 1-6) được nối với nhau bởi những liên kết ngắn Dạng dimer được hình thành thông qua sự tương tác của những chuỗi xoắn alfa giữa các monomer Hai đầu carboxyl của các chuỗi xoắn E, F (5-6) từ mỗi chuỗi sẽ kết hợp với các cấu trúc xoắn A, B, C và D (1, 2, 3 và

4) để tạo thành từng cặp (Hình 1.6) [11], [20], [48], [77]

Hình 1.5: Mô hình cấu trúc monomer Hình 1.6: Mô hình cấu trúc dimer củaIFN-γ)

IFN-γ) ở người ở người

Cấu trúc tinh thể của IFN-γ) người bám vào thụ quan vùng ngoại bào cũng đã đượcxác định Khi bám vào thụ quan, các phân tử của IFN-γ) kết hợp với nhau tạo cấu trúc giống chữ V, nó được tạo thành bởi 2 cấu trúc xoắn theo trục đối xứng vuông góc với màng nguyên sinh chất Cấu trúc liên kết này đã được thấy trong cấu trúc tinh thể của các cytokine liên quan như IL-10 Đặc biệt, các phân tử IFN-γ) bám vào hai thụ quan giống nhau để cảm ứng các phản ứng sinh học Những nghiên cứu sử dụng protein IFN-γ) đột biến và chuỗi polypeptide nhân tạo đã phát hiện ra vai trò của His 111, axit amin trong liên kết nối xoắn α giữa A và B (AB loop), và phần còn lại ở đầu C trong vùng bám trung gian giữa IFN-γ) và thụ thể của nó [29],[48], [77]

1.2.2 Sự tạo thành protein IFN-γ)

Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer: NK) là nguồn sản sinh IFN-γ) chủ yếu, nhất làở giai đoạn miễn dịch tự nhiên (miễn dịch bẩm sinh) Không giống như tế bào T

hay B, tế bào NK không sử dụng hệ thống thụ thể của kháng nguyên Thay vào đó, chúng sử dụng cả hai cách thức hoạt hóa và kiềm chế các thụ thể để nhận biết các mục tiêu của chúng Sự tăng nhanh về số lượng và chức năng cảm ứng của IFN-γ) bị ảnh hưởng bởi sự cân bằng của quá trình truyền tín hiệu thông qua hoạt hóa hay ức chế tyrosin trên vùng bên trong tế bào của các thụ thể [24], [79] Sự vắng mặt của phức hợp mô gắn màng (MHC) nhóm I có thể làm tăng sự kích thích thông qua quá trình hoạt hóa các thụ quan, hoặc làm giảm tín hiệu thông quaức chế thụ quan, kết quả là sự biểu hiện chức năng của tế bào NK, bao gồm cả sự sản xuất IFN-γ) Các cytokine cung cấp hai cơ chế mà qua đó tế bào NK có thể tiết ra IFN-γ) Trong lúc phản ứng với các sản phẩm nhiễm từ vi sinh vật, các đại thực bào tiết ra một lượng thấp TNF-α và các tiểu phần p40, p35 của IL-12 Chính những cytokine này sẽ kích thích tế bào NK/T tiết ra một lượng thấp IFN-γ) IFN-γ)bắt nguồn từ tế bào NK sẽ kích thích lại các đại thực bào và làm tăng hàm lượng các TNF-α và IL-12, các cytokine này sẽ bắt đầu cho việc tổng hợp IFN-γ) với số lượng lớn bởi tế bào NK Chính sự tác động kích thích qua lại này đã tạo ra được một lượng lớn IFN-γ) và một lượng lớn các đại thực bào đã được hoạt hóa Bên cạnh đó, một lượng IFN-γ) cũng tham gia kích thích, hoạt hóa các tế bào T và NK

(Hình 1.7) [6], [33], [75]

Hình 1.7: Sự hình thành IFN-γ) bởi tế bào T/NK

Sản phẩm IFN-γ) được điều hoà âm bởi IL-4, IL-10 Chức năng chủ yếu của IL-10là ngăn cản đại thực bào tiết ra TNF-α và IL-12 bởi cơ chế làm giảm quá trình tạo bản sao của nhân tố Stat3 (nhân tố đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của tế bào) [62], [69]

1.2.3 Cấu trúc thụ thể và con đường truyền tín hiệu của IFN-γ) 1.2.3.1 Cấu trúc thụ thể của IFN-γ)

Tất cả các tế bào, trừ các hồng cầu trưởng thành, đều biểu hiện các thụ thể bề mặt của cả 2 loại IFN nhóm I và II Số lượng các thụ thể này thay đổi từ 100 tới 2000

trên một tế bào Các thụ thể này là các glycoprotein xuyên màng, các vùng ngoại bào của nó bám vào IFN và các vùng trong tế bào chất thì bám với Jak (Janus tyrosin kinase), Stat và các protein tín hiệu khác

Các thụ thể của IFN-γ) gồm 2 tiểu đơn vị khác nhau Một đơn vị lớn là IFNGR1 (IFN-γ) receptor α, IFN-γ)-R1 hoặc CDw119), có vị trí rất quan trọng của các ligand Một đơn vị nhỏ hơn là IFNGR2 (IFN-γ) receptor β, IFN-γ)-R2 hoặc nhân tố phụ-1), cần cho quá trình chuyền tín hiệu của IFN-γ)

IFNGR1 được mã hoá bởi đoạn gen khoảng 30 kb trên nhiễm sắc thể số 6 ở người và ở chuột đó là đoạn gen khoảng 22 kb nằm trên nhiễm sắc thể 10

Cả hai gen đều có cấu trúc giống nhau và bao gồm 7 exon Exon từ 1-7 của gen ở người được mã hoá cho vùng bên ngoài tế bào, exon 6 mã hoá là vùng xuyên màng và exon 7 mã hoá cho phần lớn vùng bên trong tế bào Quá trình phiên mã của gen ở mỗi loài tạo ra một đoạn mRNA khoảng 2,3 kb (kilobase) Phân tử protein trưởng thành ở người có khoảng 472 axit amin và ở chuột là 451 axit amin, cả hai đều có cách thức sắp xếp giống nhau trên màng tế bào Ở cả người vàchuột thì vùng ngoài của tế bào có chứa 228 axit amin bao gồm 10 cystein và 5 vị trí thuỷ giải liên kết với đầu N Cấu trúc lõi của ligand bám vào vùng ngoài của IFNGR1 là một phân tử giống như roi, chúng được cuộn lại thành hai vùng D1 (vùng ngoài màng) và D2 (vùng gần màng) [3], [12], [22]

Vùng bên trong của IFNGR1 bao gồm các motif gắn với Jak1, các nhân tố trong tếbào chất, tín hiệu vận chuyển và nhân tố hoạt hoá Stat1 Ở người, Jak1 bám vào vùng LPKS là một trình tự gần màng có vị trí axit amin từ 266-299 Trong khi đó vị trí bám của Stat1 là YDKPH ở vị trí axit amin từ 440-444, chính motif này có chứa vị trí Y440 có khả năng bị phosphoryl hoá trong quá trình vận chuyển tín hiệu để cho phép phân tử Stat1 đến được với thụ thể của nó Phần còn lại 441DKPH444 lànhững vị trí chịu trách nhiệm cho khả năng gắn đặc hiệu của Stat1 vào IFNGR1

(Hình 1.8) [20], [44], [76]

1.2.3.2 Con đường truyền tín hiệu của IFN-γ)

Sự kiện cốt yếu trong truyền tín hiệu ở cả IFN nhóm I và IFN nhóm II là sự dimer hóa của các thụ thể Con đường truyền tín hiệu của IFN-γ) cần ít nhất 5 protein: 2 tiểu đơn vị của thụ thể, protein tyrosine kinase Jak1 và Jak2, và Stat1

Trong tế bào không được kích thích, các tiểu đơn vị của thụ thể IFN-γ) kết hợp lại với nhau ở vùng bên trong tế bào tạo thành trạng thái không hoạt động của Jak1 vàJak2 Jak1 bám vào IFNGR1 cần 4 trình tự axit amin (LPKS), ở vùng gần màng bên trong tế bào của IFNGR1, trong khi đó Jak2 kết hợp với 12 axit amin (PPSIPLQIEEYL) bên trong tế bào của IFNGR2 Tín hiệu vận chuyển được bắt đầu khi phân tử IFN-γ) bám vào thụ thể của nó và cảm ứng Jak bởi sự phosphoryl

hóa (Hình 1.8) Các enzyme phosphoryl hóa (kinase) được hoạt hóa, khi đó nó sẽ

phosphoryl hóa lại phần tyrosin ở vùng axit amin YDKPH gần đầu C của chuỗi IFNGR1, bằng cách đó nó sẽ hình thành nên một vùng trình tự được phosphoryl hóa trên các thụ thể, đây là điểm nhận diện của vùng SH2 của Stat1 Hai phân tử Stat1 khi đó sẽ bám vào hai vị trí đã được hoạt hóa trên thụ thể và và chúng sẽ tự phosphoryl hóa ở vị trí Tyrosin (Y701) gần đầu C của chúng bởi sự kết hợp và hoạt hóa tyrosin kinase Hai phân tử protein Stat1 được phosphoryl hóa khi đó sẽ tách ra từ đơn vị IFNGR1 và hình thành một dimer thông qua sự tương tác lẫn nhau giữa phosphotyrosine và vùng SH2 Trong quá trình hoạt hóa, phân tử Stat2 cũng được phosphoryl hóa ở phần serine (S727) thông qua cơ chế khác biệt của kinase từ Jak Homodimer Stat1 được hoạt hóa sẽ kết hợp với một thụ quan liên quan tới nhân là NPI-1 (importin-α) qua một tín hiệu với cấu thể mới là vùng giàu Arginin/lysine trong nhân, tín hiệu này được tạo ra bởi hai phân tử Stat1 bám trên

DNA ở vùng dimer Cùng với Importin p97, kết hợp với NPI-1, phân tử Stat1 sẽ di chuyển qua vùng lõi nhân nhờ quá trình hoạt hóa sự thủy giải của GTP Ở bên trong nhân, homodimer Stat1 sẽ được hoạt hóa, người ta gọi là nhân tố được hoạt hóa bởi gamma (GAF-γ)-activated factor), bám vào yếu tố GAS và gây tác động đến bản sao

của gen gây cảm ứng bởi IFN-γ) (Hình 1.9) [4], [12], [29], [54], [57], [69]

Hình 1.9: Sự truyền tín hiệu của protein IFN-γ)

1.3 Ứng dụng điều trị xơ gan và những tác động của protein IFN-γ) 1.3.1 Ứng dụng điều trị xơ gan của IFN-γ)

Gan là một trong những cơ quan đóng vai trò sống còn trong cơ thể con người Gan là cơ quan giúp loại bỏ các độc chất, vi khuẩn khỏi máu và là nơi dự trữ năng lượng, các men và hormon quan trọng trong cơ thể [85]

Xơ gan là một bệnh gan mạn tính được đặc trưng bởi sự thay thế mô gan bằng mô xơ, sẹo và sự thành lập các nốt tân sinh dẫn đến mất chức năng gan Các nguyên nhân thường gây ra xơ gan bao gồm nghiện rượu, viêm gan siêu vi, và bệnh gan nhiễm mỡ Bệnh gan mãn tính và xơ gan là những nguyên nhân gây tử hàng đầu Tỉ lệ tử vong của người mắc bệnh xơ gan là 34-66% trong vòng 10 năm, phần lớn phụ thuộc vào nguyên nhân gây xơ gan Có ít thông tin về các tác nhân điều biến của nguy cơ xơ gan, một phần từ các bệnh khác gây tổn thương gan như kết hợp

giữa bệnh gan liên quan đến rượu và viêm gan mãn tính do siêu vi, chúng có thể đóng vai trò kết hợp dẫn đến xơ gan [85], [86]

Xơ gan là một bệnh nguy hiểm và thường gặp ở nước ta Đây là một bệnh mạn tính kéo dài có ảnh hưởng xấu và có tỷ lệ tử vong cao bởi cho đến nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (kể cả Tây y và Đông y) Một trong số nguyên nhân hàng đầu dẫn đến xơ gan là do viêm gan virut(nhất là viêm gan virut B và C) Xơ gan sau khi bị viêm gan do virut là do tế bào gan bị hoại tử bởi sự tấn công của virut viêm gan, nên người ta còn gọi là xơ gan hoại tử Ở nước ta, xơ gan do virut chiếm một tỷ lệ đáng kể (khoảng 40%) Khi bị nhiễm virut viêm gan B có thể trở thành viêm gan B mạn tính hoặc người lành mang virut viêm gan B Người ta thấy rằng đối với viêm gan B mạn tính thì loại viêm gan B thể hoạt động là đáng lo ngại nhất bởi vì chúng rất dễ dẫn đến xơ gan

Tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B mạn tính có tính chất địa lý khác nhau (Hình 1.10)

Khu vực Đông Nam châu Á, trong đó Việt Nam, Trung Quốc, một số nước Trung Á, Ả rập, khu vực Trung và Nam châu Phi, khu vực Bắc Nam Mỹ, Alaska và Bắc Canada là những vùng đại dịch nhiễm virut viêm gan B mạn tính, với tỷ lệ người nhiễm virut mạn tính trên 8% dân số, có khoảng 2 tỷ người trên thế giới đã hoặc đang nhiễm virut viêm gan B và 350 triệu người mang virut này mãn tính và dẫn tới xơ gan Tỷ lệ nhiễm virut viêm gan B mạn tính tại Việt Nam trên 8% dân số vàmột số tỉnh có thể lên đến 15-20%, ước tính hiện nay tại Việt Nam có khoảng 12-14 triệu người nhiễm virut viêm gan B và dẫn tới xơ gan [85]

Xơ gan sau viêm gan B mạn tính có ảnh hưởng xấu nhất bởi vì có khoảng 75% bệnh nhân tử vong trong vòng từ 1-5 năm do chảy máu đường tiêu hoá hoặc ung thư hoá Xơ gan là một bệnh nặng mà hậu quả xấu nhất là khi xơ gan đã có cổ chướng (báng nước) hoặc hoàng đản (vàng da) Có khoảng gần 70% bệnh nhân tử vong trong năm đầu và khoảng 85% sau 2 năm bị xơ gan Tuy vậy bệnh tiến triển như thế nào còn tùy thuộc vào chế độ dinh dưỡng, chế độ sinh hoạt, làm việc cũngnhư việc phòng tránh các bệnh nhiễm khuẩn khác tốt hay không Hậu quả của xơ gan có thể bị chảy máu tiêu hoá, điển hình là vỡ tĩnh mạch thực quản gây chảy máu ồ ạt đưa đến tình trạng sốc do trụy tim mạch rất khó cứu chữa Hầu hết các trường hợp khác có thể hôn mê dẫn đến tử vong hoặc bị ung thư hoá [35], [36], [68], [72], [84]

Hình 1.10: Tỉ lệ nhiễm viêm gan siêu vi B trên toàn thế giới

Phương pháp điều trị xơ gan bằng IFN-γ)

Hiện nay trên thế giới cũng như tại Việt Nam chưa có thuốc điều trị đặc hiệu đối với xơ gan Việc điều trị chủ yếu là nhằm vào việc loại bỏ hay kìm hãm các tác nhân gây xơ gan Việc điều trị bằng protein IFN-γ) hằm loại bỏ các virut gây viêm gan thông qua những tác động đa dạng như: Kích thích tế bào kháng lại virus, có những cơ chế điều biến miễn dịch đa dạng [35], [36]…

Phương pháp điều trị xơ gan bằng tế bào gốc kết hợp với protein IFN-γ)

Hiện nay, phương pháp cấy ghép tế bào gốc kết hợp với protein IFN-γ) trong điều trị xơ gan là công nghệ trị liệu đạt hiệu quả cao Đầu tiên tách tế bào của bệnh nhân trong máu, tủy xương bằng các dụng cụ chuyên dụng, sau đó đưa vào phòng thí nghiệm vô trùng, tiến hành tinh chế, chia tách, kiểm định và nuôi dưỡng Cuối cùng thông qua phương pháp truyền dịch để đưa tế bào gốc vào gan qua động mạch, sau khi tế bào gốc được nuôi cấy trong cơ thể bệnh nhân sẽ tiếp tục phân hóa trong gan, nhằm thay thế các tế bào bị tổn hại, nhiễm độc khiến gan bị mờ và suy yếu, giúp phục hồi chức năng gan và đạt được hiệu quả điều trị bệnh.Trong khi đó, protein IFN-γ) được dùng như một chất gây kích thích hệ miễn dịch chống nhiễm khuẩn, loại bỏ các virut [89]

1.3.2 Những tác động của protein IFN-γ) trong điều trị bệnh

Hình 1.11: Những tác động của protein IFN-γ)

Tác động đến sự trình diện kháng nguyên bởi MHC nhóm I

IFN-γ) làm tăng số lượng và độ đa dạng của các đoạn polypeptide được trình diện trên MHC nhóm I Sự tăng cường trình diện MHC I bởi IFN-γ) đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh nội bào, vì nó làm tăng khả năng nhận diện của tế bào T độc với các chuỗi polypeptide lạ, do đó thúc đẩy sự cảm ứng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào IFN-γ) kích thích cảm ứng sự thay thế các tiểu phần của proteasome bằng các tiểu phần

immunoproteasome tạo thành các loại proteasome mới và cắt các đoạn

polypeptide lạ, từ đó làm tăng số lượng các chuỗi polypeptide được trình diện và làm tăng khả năng phân giải các chuỗi polypeptide lạ Ngoài việc tăng về số lượngcác chuỗi polypeptide được cắt thì immunoproteasome còn góp phần tạo ra các đoạn polypeptide có khả năng liên kết với MHC tốt hơn, giúp cho việc trình diện kháng nguyên hiệu quả hơn IFN-γ) còn cảm ứng sự biểu hiện của protein hoạt hóa proteasome như PA28, protein vận chuyển TAP vận chuyển các đoạn polypeptide từ tế bào chất vào lưới nội chất [7], [15], [30], [31], [32], [63]

Tác động đến sự trình diện kháng nguyên bởi MHC nhóm II

IFN-γ) cảm ứng làm tăng sự biểu hiện của các tiểu phần trong phức hợp MHC nhóm II, qua đó tăng khả năng trình diện các đoạn polypeptide lạ cho các tế bào T-CD4 IFN-γ) cũng cảm ứng sự biểu hiện chuỗi Ii, là chaperon có vai trò trong sự trình diện kháng nguyên của MHC II DM, một protein có chức năng loại bỏ các đoạn CLIP (là phần còn lại của chuỗi Ii trong endosome, có chức năng che vùng trình diện kháng nguyên của MHC II khi phức hợp này ở trong lưới nội chất) Cácenzyme phân hủy protein trong tiêu thể liên quan tới sự sản xuất các đoạn

polypeptide như các cathepsin cũng được cảm ứng bởi IFN-γ) IFN-γ) cũng cảm

Hoạt hóa

Hoạt hóa

Hoạt hóa Tănghoạt tính

tế bào NK

Tác động tới MHC nhóm I hoặc II Hoạt hóa tế bào T

Dừng chu trìnhphânchiatế bào Kháng virut

Gâyappoptosis

ứng sự biểu hiện của CIITA, là yếu tố cảm ứng sự phiên mã của các gen liên quan tới MHC II như Ii và DM [9], [43], [49]

Tác động đến các protein kháng virut

Hệ thống IFN tham gia điều hòa miễn dịch tự nhiên và miễn dịch đáp ứng đối với sự xâm nhiễm của virut Mặc dù cả hai dạng của IFN đều có vai trò trong đáp ứng miễn dịch ngay lập tức khi bị nhiễm virut, nhưng ở IFN-γ) còn có cơ chế tác động kháng virut ở giai đoạn tế bào đã bị nhiễm virut và hình thành một trạng thái kháng virut lâu hơn [51]

Cơ chế hình thành trạng thái kháng virut của IFN-γ) đó là sự cảm ứng tạo các enzyme kháng virut mà quan trọng nhất đó là sự tạo thành PKR (Protein Kinase R), đó là một serine/threonin kinase được cảm ứng bởi cả hai nhóm IFN PKR không hoạt động ở trạng thái cơ bản của nó, chúng chỉ hoạt động khi được phosphoryl hóa dsRNA là một thành phần trung gian trong sự sao chép RNA ở virut và đây là cũng một tác nhân hoạt hóa tốt nhất của PKR, mặc dù cũng có một vài nhân tố khác như heparin cũng có khả năng hoạt hóa PKR Sự kết hợp giữa PKR và dsRNA sẽ tạo ra sự thay đổi về mặt cấu tạo và do đó sẽ tạo ra vùng có khảnăng xúc tác sự phosphoryl hóa PKR PKR khi được hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa các nhân tố đặc biệt khác trong tế bào, một trong những nhân tố đó là eIF-2α là một nhân tố cần thiết cho sự dịch mã bình thường của tế bào Sự phosphoryl hóa bởi PKR sẽ ngăn ngừa sự tái sinh của eIF-2α-GTP, khi đó sẽ ngăn cản virut bằng

cách ngăn cản sự tổng hợp protein của virut (Hình 1.12) [8], [23], [37], [55], [56].

Tác động ức chế tăng sinh tế bào

Interferon (IFN)

Interferon receptor

Trạng thái kháng virus

Cảm ứng: Tổng hợp

2’5’ Oligo A Cảm ứng: Protein kinase

Hoạt hóa tổng hợp

2’5’ Oligo A Hoạt hóa : Protein kinase

Hoạt hóa: RNase L

Phân hủy mRNA

Phosphoryl hóa e IF- 2α cần cho sự sinh (

tổng hợp protein)

Ngăn cản tổng hợp protein 2’5’ Oligo A

IFN-γ) cảm ứng tăng cường sự biểu hiện các gen sản sinh ra các protein có chức năng ức chế sự phiên mã hoặc dịch mã các yếu tố cần thiết cho chu trình tế bào, do đó làm dừng chu trình tế bào: PKR phosphoryl hóa tiểu phần α của eIF-2 làm ngừng sự tổng hợp protein; p21 và p27 ức chế hoạt tính của cyclin E (CDK2) và cyclin D (CDK4), gây ra sự dừng chu trình tế bào tại điểm G1/S; Rb và P202 ngăn chặn sự phiên mã của các gen phụ thuộc E2F, là những gen cần thiết cho hoạt động của pha S trong chu trình tế bào [73], [75]

IFN-γ) cũng ức chế sự biểu hiện của c-Myc là yếu tố kiểm soát sự chuyển pha từ G1 sang S [64], [66]

Tác động đến apoptosis

IFN-γ) cảm ứng sự biểu hiện các gen và protein như: IRF-1 là một gen ức chế khối u, cảm ứng apoptosis khi có tín hiệu hư hỏng của DNA; Caspase 1 là một cystein protease liên quan tới hoạt tính sinh học của IL-1 và IL-18, và liên quan tới quá trình apoptosis qua trung gian đại thực bào [47], [52], [[58], 59]

Tác động hoạt hóa chức năng của các cơ quan chống khuẩn, sản sinh NO (Nitric Oxid)

IFN-γ) có tác động hoạt hóa chức năng của các cơ quan chống khuẩn, sản sinh NO thông qua việc cảm ứng sự biểu hiện các gen và protein như:

+ iNOS/NOS2 là enzyme thủy phân thuộc họ NOS làm giảm sự chuyển đổi arginine thành L-citrulline và hình thành NO [50]

L-+ Argininosuccinate synthetase tổng hợp L-arginine, là chất nền cho phản ứng thủy phân tạo NO bởi iNOS Bên cạnh đó IFN-γ) còn tạo GTP- cyclohydroxylase I cung cấp các tetrahydrobiopterin cofactor cần thiết cho sự sản sinh NO bởi iNOS [14], [45], [60]

Tác động điều hòa miễn dịch

IFN-γ) cảm ứng sự biểu hiện các gen và protein như:

+ IL-12 là một cytokine ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình biệt hóa của tế bào TH1 khi được trình diện kháng nguyên

+ Protein 10 được cảm ứng bởi IFN (IP-10, CXCL10), là các chất dẫn dụ bạch cầu và tế bào T

+ Các chất dẫn dụ bạch cầu hay đại thực bào như protein 1 (MCP-1) và CCL2 + Chất dẫn dụ tế bào T như CXCL9

+ Các chất dẫn dụ T-CD4, T-CD8 và tế bào T nhớ: MIP-1α, MIP-1β (CCL3, CCL4)

+ ICAM-1: là các phân tử có tính bám dính không chuyên biệt trên bề mặt tế bào đích của các tế bào lympho, giúp tăng hiệu quả việc tiếp cận của lymphocyte với tế bào mục tiêu

+ B72 là phân tử đồng kích thích trên bề mặt tế bào APC, giúp tăng hiệu quả trìnhdiện kháng nguyên cho tế bào T [47], [49], [51], [59], [61]

1.3.3 Các sản phẩm thương mại từ IFN-γ)

Hiện nay trên thế giới có một sản phẩm thương mại duy nhất được sản xuất từ chếphẩm IFN-γ) có tên gọi là Actimmune Với khả năng điều trị các bệnh về xương đáhay bệnh u hạt mạn tính

Bệnh u hạt mạn tính

Bệnh u hạt mạn tính liên quan tới các rối loạn di truyền của hệ miễn dịch gây ra bởi khuyết tật trong các tế bào miễn dịch gọi là đại thực bào Chức năng chính củađại thực bào là nhận biết và tiêu diệt các mầm bệnh vi khuẩn Trong bệnh nhân bị u hạt mạn tính, đại thực bào không tạo ra đầy đủ của các enzyme chịu trách nhiệmgiết chết các vi sinh vật tiêu hóa Điều này khiến bệnh nhân dễ bị tổn thương nghiêm trọng và nhiễm khuẩn tái phát do vi khuẩn, nấm và tình trạng viêm mãn tính như viêm nướu, các tuyến bạch huyết mở rộng, chúng giống như khối u nên được gọi là u hạt IFN-γ) là một protein xảy ra tự nhiên trong cơ thể người, chức năng chính của nó là kích thích hệ thống miễn dịch để đối phó với chấn thương hoặc nhiễm trùng IFN-γ) có nhiều hữu ích cho bệnh nhân bị u hạt, nó làm giảm các nguy cơ nhiễm trùng và có cơ chế điều biến miễn dịch hiệu quả nhằm loại bỏ các vi khuẩn [88]

Bệnh xương đá

Bệnh xương ác tính là một bệnh rối loạn bẩm sinh rất hiếm, đe dọa đến tính mạngvà xảy ra vào khoảng 1 trong 300.000 trẻ xơ sinh Nó được đặc trưng bởi sự phát triển các cấu trúc xương bất thường dày đặc, giòn, và làm suy yếu chức năng của dây thần kinh sọ Kết quả là, bệnh nhân có tăng nguy cơ thiếu máu, mù lòa, mất thính lực, và nhiễm trùng Các mục tiêu chính của điều trị ở những bệnh nhân có xương ác tính nặng đó là làm chậm tiến triển của bệnh, và điều trị các biến chứng thứ Hiện nay, cấy ghép tủy xương là phương pháp điều trị duy nhất có khả năng chữa bệnh Tuy nhiên, cấy ghép thành công còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chi phí, tìm người mang tủy phù hợp… hiện nay chỉ có khoảng 20-40% các bệnh nhân đủ điều kiện thực hiện việc cấy gép tủy Đối với phần còn lại của các bệnh nhân, điều trị là nhằm mục đích làm chậm sự tiến triển của bệnh và quản lý các biến chứng phụ như thiếu máu và nhiễm trùng tái phát Nhiều loại thuốc, bao gồm cả Calcitriol (vitamin D), corticosteroids và IFN-γ), đã được báo cáo có một số lợi ích trong việc làm chậm sự tiến triển của bệnh Trong số này, chỉ có IFN-γ) đã được sự chấp thuận của Thực phẩm Hoa Kỳ và Cục Quản lý dược để điều trị các bệnh nhân bị bệnh xương đá [88]

1.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi trong tế bào vi khuẩn E coli 1.4.1 Ưu điểm biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào E coli

Từ những ngày đầu tiên phát triển của kỹ thuật DNA tái tổ hợp, các hệ thống biểu

hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn đặc biệt là E coli đã đóng một vai trò hết sức

quan trọng với những lý do sau:

 Bộ gen của E coli có kích thước tương đối nhỏ được mã hóa hoàn toàn và các

thông tin di truyền được nắm rõ

 Nhiều hệ thống vector biểu hiện đã được thiết kế phù hợp cho E coli biểu hiện

protein ngoại lai trong tế bào chất hay tiết ra ngoài môi trường

 E coli có thể nuôi cấy dễ dàng và đạt mật độ cao nhanh chóng trên cơ chất rẻ

tiền, thường sử dụng nguồn cacbon là glucose

 E coli có thể tạo ra các protein ngoại lai với sản lượng cao, từ 10-30% tổng số

protein của tế bào

Các hợp chất sinh dược đầu tiên bao gồm insulin người tái tổ hợp, hormon tăng trưởng người tái tổ hợp có mặt trên thị trường vào những năm đầu thập niên 80 đã mang lại một sự cải tiến vượt bậc về khả năng sử dụng, chất lượng và an toàn so với các sản phẩm được ly trích từ mô trước đây.Cho đến ngày nay đã có rất nhiều hợp chất được sản xuất bằng các hệ thống khác nhau nhằm mục tiêu sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp dùng trong điều trị bệnh, trong đó nhiều hệ thống cải tiến vẫn đang được nghiên cứu và phát triển [67]

1.4.2 Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E coli

Trong tế bào E coli, protein tái tổ hợp thường biểu hiện dạng thể vùi (inclusion

body) không tan trong tế bào chất Thể vùi được hình thành do tốc độ tổng hợp protein cao, các phân tử protein mới được tạo ra không kịp tự gấp cuộn mà kết tụ lại với nhau qua tương tác kị nước thành một thực thể không tan trong tế bào chất.Việc hình thành thể vùi thường xảy ra khi một protein được biểu hiện vượt mức (over-expression) trong tế bào Do đó việc kiểm soát hợp lý tốc độ tăng trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, hay tốc độ trao đổi chất của tế bào chủ có ảnh hưởng phần nào đến đặc tính của protein tái tổ hợp trong tế bào chất, có thể dẫn đến sự hình thành thể vùi hay không Ngoài ra việc đồng biểu hiện (co-expression) protein tái tổ hợp với các chaperone phân tử cũng giúp giới hạn việc hình thành thể vùi [67], [70]

1.4.3 Chủng E coli, hệ thống vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong biểu

hiện protein

1.4.3.1 Chủng E coli BL21(DE3) Star

Một trong những chủng E coli được ứng dụng rộng rãi cho mục tiêu biểu hiện cácprotein tái tổ hợp là E coli BL21 Tất cả các chủng E coli BL21 đều không có protease được mã hoá bởi gen lon và thiếu protease màng ngoài được mã hoá bởi gen ompT Vì vậy, protein tái tổ hợp sẽ tồn tại bền vững trong tế bào E coli BL21

so với những chủng chủ khác có những protease này

Enzym RNase E là sản phẩm phiên mã của gen rne131 có chức năng phân hủy mRNA Chủng E coli BL21(DE3) Star mang đột biến gen rne131, vì thế chủng

này có khả năng gia tăng tính ổn định của mRNA và gia tăng sự biểu hiện của protein ngoại lai

E coli BL21(DE3) Star có chứa thể tiềm tan của thực khuẩn thể DE3 (một chuyển

thể của thực khuẩn thể ) mang đoạn DNA chứa gen lacI, promoter lacUV5 và gen

mã hoá T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase được đặt dưới sự kiểm soát

phiên mã của promoter lacUV5 Đây là một promoter được cảm ứng bởi lactose

hoặc Isopropyl thio--D-galactosidase (IPTG) Do vậy, khi bổ sung IPTG vào môi trường nuôi cấy, gen mã hoá cho T7 RNA polymerase sẽ được hoạt hoá, T7 RNA polymerase tạo thành xúc tác việc phiên mã gen mục tiêu trên vector biểu hiện [67], [70] [79]

1.4.3.2 Hệ thống vector biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi sử dụng

cảm ứng bởi IPTG Protein sẽ được biểu hiện theo sự kiểm soát của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG hoặc lactose được bổ sung vào môi trường nuôicấy

Operon lac bao gồm 3 gen cấu trúc: lacZ, lacY, lacA dưới sự kiểm soát của một promoter, về phía thượng lưu của promoter có gen điều hòa lacI Chức năng của mỗi gen như sau:

 Gen điều hòa lacI mã hóa protein ức chế, protein ức chế gắn vào operator ngăn

cản sự phiên mã của RNA polymerase

 Gen lacA mã hóa cho enzym transacetylase

 Gen lacY mã hóa cho enzym permease (enzym vận chuyển lactose vào trong tế

bào)

 Gen lacZ mã hóa enzym -galactosidase, enzym -galactosidase có 2 chức năng:

đồng phân hóa đường α-lactose thành allolactose, enzym thủy phân đường lactose thành galactose và glucose)

Hệ thống operon lac sử dụng promoter lac có 2 cơ chế điều hòa sự biểu hiện gen:

dưới sự kiểm soát âm bởi protein ức chế và dưới sự kiểm soát dương bởi protein CRP (cAMP receptor protein) còn có thể được gọi CAP (Catabolite Activator Protein, protein hoạt hóa dị hóa) [28], [87]

Cơ chế điều hòa âm

Khi môi trường không có lactose, protein ức chế được mã hóa bởi gen lacI gắn vào operator và ức chế phiên mã, sự ức chế này không hoàn toàn mà có sự phiên

mã vượt cho phép tạo một số -galactosidase và các permease trên màng Khi môi trường có lactose, -galactosidase xúc tác sự thủy phân lactose cũng như xúc tác phản ứng đồng phân hóa chuyển lactose thành -1,6-allolactose Allolactose có ái lực cao với protein ức chế nên gắn được vào monomer của protein ức chế và làm thay đổi cấu trúc tetramer Điều này làm giảm ái lực của protein ức chế với DNA, khiến protein ức chế rời khỏi operator Sự phiên mã của operon được diễn ra để tạo các sản phẩm của gen, trong đó có enzym -galactosidase Enzym -

galactosidase thuỷ phân lactose trong môi trường, giúp vi sinh vật thu năng lượng.Tuy nhiên, theo thời gian, nồng độ lactose trong môi trường giảm, kéo theo sự giảm đồng phân allolactose Điều này dẫn đến sự hoạt hóa protein ức chế trở lại gắn vào operator và ức chế sự phiên mã [28], [87]

Hình 1.13: Cơ chế điều hòa âm của hệ thống operon lac

Cơ chế điều hòa dương

Trong môi trường nuôi cấy có mặt đồng thời cả lactose và glucose thì operon lac

bị bất hoạt, hiện tượng này gọi là ức chế dị hoá Các nghiên cứu cho thấy, khi glucose có mặt ở nồng độ cao thì hàm lượng cAMP (3',5'-cyclic adenosine

monophosphate) trong tế bào rất thấp; và ngược lại, khi không có glucose hoặc có không đáng kể thì hàm lượng cAMP trong tế bào được tổng hợp tăng cao Vì vậy, cAMP được xem là chất chỉ thị (indicator) của sự vắng mặt glucose và là nhân tố

điều hoà dương tính của các operon lac nói riêng hay operon dị hóa nói chung

Khi môi trường nội bào có hàm lượng cAMP cao, cAMP kết hợp với protein hoạt hóa dị hóa CAP tạo phức hợp CAP-cAMP và làm tăng ái lực của CAP đối với promoter Phức hợp CAP-cAMP gắn vào vị trí CAP, ở đây xảy ra sự tương tác giữa protein CAP với RNA polymerase chính điều này giúp RNA polymerase gia

tăng ái lực với promoter và tăng cường hoạt động phiên mã trong operon lac [28],

[87]

Kết hợp cơ chế điều hòa âm và dương ở operon lac

Môi trường nuôi cấy có sự hiện diện glucose và không có chất cảm ứng lactose thì

không có mRNA của operon lac được tạo ra (Hình 1.14A) Điều này được giải

thích như sau: protein ức chế được mã hóa bởi gen lacI gắn vào lac operator và ứcchế toàn bộ quá trình phiên mã của operon lac bất kể sự hiện diện của cAMP

trong tế bào cao hay thấp

Môi trường nuôi cấy có sự hiện diện glucose được duy trì sao cho hàm lượng cAMP trong tế bào thấp và có chất cảm ứng lactose thì có ít mRNA của operon

lac được tạo ra (Hình 1.14B) Điều này được giải thích như sau: khi có lactose thì

protein ức chế bất hoạt không gắn vào được operator, cAMP trong tế bào thấp nênphức hợp cAMP-CAP không được tạo ra để gắn vào promoter lac dẫn đến RNA

polymerase có ái lực yếu với promoter nên ít mRNA của operon lac được tạo ra

Môi trường nuôi cấy không có sự hiện diện glucose do đó hàm lượng cAMP trong

tế bào cao và có chất cảm ứng lactose thì mRNA của operon lac được tạo ra nhiều

(Hình 1.14C) Điều này được giải thích như sau: khi có lactose thì protein ức chế

bị bất hoạt không gắn vào được operator, cAMP trong tế bào cao nên cAMP gắn với CAP tạo thành phức hợp cAMP-CAP và phức hợp này gắn vào vị trí CAP dẫnđến gia tăng ái lực của RNA polymerase với promoter nên quá trình phiên mã được tăng cường và mRNA của operon lac được tạo ra nhiều [28], [87]

Hình 1.14: Cơ chế kiểm soát âm và dương ở operon lac

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chủng chủ E coli BL21(DE3) Star [F– ompT hsdSB(rB–, mB–) gal dcm

rne131 (DE3)] dùng để biểu hiện gen trong vector pNanogen (Nanogen)

2.1.2 Vector

Vector pNanogen được sử dụng làm vector dòng hoá và biểu hiện proteindạng thể vùi được thiết kế bởi phòng Nghiên cứu-phát triển của công ty DượcNanogen, bao gồm trình tự sao chép ori, f1 (+) origin, gen kháng kanamycin, trình

tự promoter T7 lac, gen lacIq, vùng MCS

Đoạn gen mã hoá protein được chèn vào vùng MCS (Multi Cloning Sites)

của vector pNanogen và sự biểu hiện của protein chịu sự kiểm soát của T7promoter Promoter này sẽ hoạt động khi T7 RNA polymerase của tế bào chủ E.

coli BL21(DE3) Star bám vào Trên vector pNanogen cũng chứa gen lacI mã hoá

cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên promoter T7, ngăn cản sự

phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG Protein sẽ được biểu hiện theo cơchế kiểm soát âm của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG được bổ sungvào môi trường nuôi cấy Lượng protein tổng hợp với tốc độ cao nên chúng cuộnkhông đúng cấu trúc và tồn tại dưới dạng thể vùi Bên cạnh đó, vector pNanogencòn mang gen kháng kháng sinh kanamycin do đó môi trường chọn lọc được bổsung kanamycin

2.1.3 Gen IFN-γ)

Dựa vào trình tự protein công bố trên Dược điển châu Âu (EP6.0) có Uniprot

number: P01579 (Bảng 2.1) Công ty Công Nghệ Sinh Học Dược Nanogen đã tiến

hành tổng hợp nhân tạo từ công ty TopGen (Montreal, Canada) với các đặc điểmsau: Thiết kế một gen tổng hợp được dùng để biểu hiện protein của Eukaryote

mang các codon “ưa thích” ở prokaryote; có trình tự nhận biết bởi enzyme NdeI,

HindIII lần lượt ở vị trí trước codon methionin và sau codon kết thúc dịch mã để

thuận lợi cho việc dòng hóa gen vào các vector biểu hiện Gen IFN-γ) tổng hợp

được lưu trữ trong plasmid pUC57 và đặt tên là pUC57-IFN-γ) (Bảng 2.1) Plasmid

này được cung cấp bởi công ty TopGen và được sử dụng như khuôn để thu nhận

MCS

pNanogen 4900 bp

Hình 2.1: Vector pNanogenIFN-γ

gen γ) phục vụ cho việc tạo dòng vector mang gen sinh tổng hợp protein

TTAA GCTT

2.1.4 Các mồi dùng cho giải trình tự

Cặp mồi T7 pro và T7 ter (Novagen) được dùng để giải trình tự gen IFN-γ)

Bảng 2.2: Các mồi dùng trong giải trình tự gen

Tên mồi Mục đích Trình tự các nucleotide theo chiều 5’ → 3’

2.1.5 Các thang chuẩn dùng cho điện di

Hình 2.2: Các thang chuẩn dùng trong kỹ thuật điện di

A: Thang chuẩn DNA 10kb (Massruler), B: Thang chuẩn protein Spectramulticolor broadrange (MBI Fermentas)

2.1.6 Các kháng thể dùng cho lai Western blot

Kháng thể sơ cấp: kháng thể đa dòng kháng đặc hiệu với protein IFN-γ) từ chuộtdo công ty Công Nghệ Sinh Học Dược Nanogen cung cấp

Kháng thể thứ cấp: kháng thể kháng Ig chuột cộng hợp với men PO (Peroxidase) (Sigma)

2.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong luận văn được cung cấp bởi các công tyMerck, Amersham, Bio-Basic, Wako, Sigma, MBI Fermentas

2.2.1 Các hóa chất dùng cho điện di DNA

Đệm TAE 1X, đệm nạp mẫu, dung dịch nhuộm DNA trên gel (Ethidiumbromide), gel Agarose (Bio-Basic, Mỹ)

2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn

Các enzyme cắt giới hạn được dùng để cắt DNA là NdeI và HinIII, các

dung dịch đệm cho phản ứng cắt tương ứng có nguồn gốc từ Fermentas 2.2.3 Hóa chất cho phản ứng PCR

Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR như đệm PCR 10X và dNTP

được cung cấp kèm theo DNA polymerase: Pfu DNA polymerase (Fermentas)

2.2.4 Hóa chất dùng cho tinh sạch DNA từ gel Agarose

Bộ Kit MEGA SpinTM Agarose Gel Extraction Kit (Intron) dùng để tinh chế DNAđược thu nhận từ gel agarose Quy trình gồm các bước: làm tan gel, hấp thu DNA,rửa và dung ly để thu nhận DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.2.5 Hóa chất dùng để hóa biến nạp plasmid

Môi trường LB pha trong 1 lít: Thành phần như Bảng 2.3

2.2.6 Hóa chất dùng cho điện di protein

Gel Polyacrylamide 100 x 100 x 0,75 mm nồng độ 14% polyacrylamide,dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue, ethanol tuyệt đối, glacial aceticacid), dung dịch giải nhuộm

2.2.7 Hóa chất dùng cho Western blot

Dung dịch TMB 0,3% trong DMSO: 0,3 g 3,3’,5,5’Tetramethylbenzidin; 100 mlDimethyl sulfoxid

Cơ chất TMB: Dung dịch đệm citrat-acetat pH 6,: 9,0 ml; Dung dịch TMB 0,3%trong DMSO: 0,7 ml; Dung dịch H2O2 0,3%: 0,3 ml

Chuẩn IFN-γ) (Prospec)

Kháng thể kháng IFN-γ) (Sigma) Protein A (Sigma)

2.2.10 Hóa chất để hòa tan IFN-γ) từ tế bào E coli

Đệm 1 (Đệm phá tế bào): 50 mM NaCl; 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base, pH 8 Đệm 2 (Đệm rửa lần 1): 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base; Triton 100X 1%, pH 8.Đệm 3 (Đệm rửa lần 2): 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base, pH 8 Đệm 4 (Đệm hòatan protein thể vùi): 6 M Guanidine chloride; 5 mM EDTA; 50 mM Tris-base

2.2.11 Hóa chất dùng để tinh chế protein tái tổ hợp

Dung dịch đệm dùng tái gấp cuộn: 20 mM Tris-base; 2 mM R-cystein; 2mM O-cystein; 1,2 M Guanidine chloride; 0,4 M L-arginine; 25 mM EDTA

Dung dịch đệm sắc ký rây phân tử: 20 mM Tris-base pH 8

Dung dịch đệm trao đổi cation: Dung dịch rửa 1: 20 mM Tris-base pH 8; dungdịch rửa 2: 20 mM Tris-base pH 9; dung dịch ly giải mẫu: 20 mM Tris-base + 1 MNaCl pH 8

Dung dịch đệm lọc gel: 25 mM Acetate pH 4,6 + 0,15 M NaCl

2.3 Dụng cụ và thiết bị

pH kế (MettlerToledo)

Máy đo OD (Bionate)

Bộ điện di chạy DNA (Bio-rad) Bộ điện di chạy protein (Bio-rad) Máy siêu âm (Sonicator 3000) Máy ly tâm lạnh (Hanil)

Máy sắc ký AKTA (Amersham)

Cột sắc ký XK5060, XK2620, XK50100 (GE Healthcare) Gel (Sephadex G-25, SP-Sepharose, Superdex 75)

2.4 Phương pháp

2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp

Tiến hành cấy một khuẩn lạc E coli vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB,

nuôi cấy lắc hoạt hóa qua đêm ở 200 v/p (vòng/phút), 37oC Sáng hôm sau, hút200 l dịch sinh khối đã được hoạt hóa vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LBvà nuôi cấy tiếp tục ở điều kiện như sau: 200 v/p, 37oC cho đến khi giá trị OD600đạt 0,8–1,0; tiến hành ly tâm thu sinh khối ở 10.000 v/p, 40C, 10 phút Sau đó, bổsung 1 ml MgCl2–CaCl2 lạnh vô trùng vào effendorf chứa sinh khối E coli vừamới được ly tâm ở trên và huyền phù kỹ, ly tâm 10.000 v/p trong 10 phút ở 40Cthu phần cặn Tiếp tục bổ sung 1 ml MgCl2–CaCl2 lạnh vô trùng, ủ trong đá 15phút và ly tâm thu phần cặn ở 10.000 v/p, 4oC trong 10 phút Sau cùng, bổ sung200 l CaCl2 lạnh + 20% glycerol vào phần cặn thu nhận ở bước trên, huyền phùkỹ và lưu giữ ở -70oC

2.4.2 Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli khả nạp

DNA vector có nồng độ nhỏ hơn 50 ng được trộn đều vào 200 μl tế bào E coli

khả nạp, và giữ trong bể đá 30 phút Hỗn hợp trên được chuyển nhanh vào bể ổnnhiệt 42oC, để yên 60 giây; sau đó nhanh chóng chuyển hỗn hợp trên trở lại bể đátrong 1-2 phút Bổ sung 1 ml môi trường LB vào hỗn hợp đó và tiến hành nuôi cấy

lắc ở 37oC trong 45 phút Cuối cùng, hút 200 μl dịch trên trải lên môi trường LB1,5% agar đã hấp khử trùng có bổ sung kháng sinh thích hợp, ủ ở 37oC qua đêm Tiến hành đồng thời một mẫu đối chứng không có vector

2.4.3 Cắt mở vòng vector pNanogen bởi cặp enzyme NdeI/HindIII

Tiến hành nuôi cấy chủng E coli TOP10F’ mang vector pNanogen, sau đó tách

chiết và thu nhận vector bằng bộ kit DNA-SpinTM Plasmid DNA Extraction Kit(Intron)theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Vector pNanogen sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

1%

Thực hiện phản ứng cắt ở 37oC trong 4 giờ bằng các enzyme NdeI và

HindIII, trong phản ứng cắt có thành phần như sau:

Enzyme HindIII (10U/µl) 2 µl Enzyme

dung dịch H2O vừa đủ 100 µl

Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra và tiến hành tinh chếbằng bộ kit MEGA SpinTM Agarose Gel Extraction Kit (Intron)

2.4.4 Tạo vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ)

Thực hiện phản ứng nối gen IFN-γ) đã được tinh sạch sau khi xử lý với hai enzyme

NdeI/HindIII vào vector pNanogen cũng đã được xử lý bởi cặp enzymeNdeI/HindIII nhờ enzyme T4 ligase Các vector tái tổ hợp được nối thành công và

Enzyme T4 DNA ligase 1 μl

Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào E coli Top10F’ với kháng sinh là

Kanamycin (70 μg/ml) 2.4.5 PCR khuẩn lạc

Với các khuẩn lạc thu nhận từ quá trình hóa biến nạp, tiến hành đánh số và dùngtăm vô trùng chấm nhẹ lên khuẩn lạc cấy sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trườngLBKan, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC

Thu sinh khối tế bào và tách chiết vector theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kiểmtra vector tách chiết bằng phản ứng PCR với mồi T7 promoter/T7 terminator Phảnứng PCR được thực hiện với các thành phần như sau: Dung dịch đệm Pfu DNApolymerase 10X 10 μl dNTP 10X 10 μl MgSO4 (25 mM) 10 μl

Vector pNanogenIFN-γ) (100 ng/μl) 1 μl

Tất cả các thành phần phản ứng được cho vào eppendorf 0,2 ml và đặt vào máy

điều nhiệt với chương trình phản ứng được trình bày trên Hình 2.3

Hình 2.3: Điều kiện phản ứng PCR

Sản phẩm thu được sau phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gelagarose 1%

2.4.6 Quy trình nuôi cấy chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ) sinh tổnghợp protein IFN-γ) ở quy mô phòng thí nghiệm

Nhân giống cấp 1

Tiến hành cấy một khuẩn lạc đơn chủng E coli BL21(DE3)

Star/pNanogenIFN-γ) từ đĩa petri cho vào erlen (250 ml) chứa 25 ml môi trườngLBKan đã được thanh trùng, nuôi cấy lắc hoạt hóa qua đêm ở 200 v/p, 37oC Dịchnuôi cấy qua đêm này được sử dụng tiếp theo cho quá trình nuôi cấy và sinh tổnghợp protein IFN-γ)

Cảm ứng sinh tổng hợp protein IFN-γ) ở quy mô phòng thí nghiệm

Hút 2,5 ml giống cấp 1 đã được hoạt hóa qua đêm cho vào erlen (250 ml)chứa 50 ml môi trường LBKan (hay tỷ lệ nạp giống cấp 1 chiếm 5% tổng thể tíchmôi trường nuôi cấy), tiến hành nuôi cấy ở 200 v/p, 37oC cho đến khi giá trị OD600của dịch nuôi cấy ở giữa thời điểm của pha tăng trưởng (pha log) tiến hành cảmứng IPTG tại các nồng độ đang tiến hành khảo sát Sau khi cảm ứng bằng IPTG,tiếp tục nuôi cấy trong khoảng thời gian khảo sát Kết thúc quá trình nuôi cấy khảosát, tiến hành ly tâm thu sinh khối để tiến hành phân tích bằng các kỹ thuật: điện diSDS– PAGE, lai Western blot và đo quang phổ OD600 Đồng thời tiến hành nuôi

cấy chủng E coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ) trên môi trường LB không

được cảm ứng IPTG xem như đối chứng âm

2.4.7 Phương pháp điện di SDS-PAGE

Kết thúc quá trình nuôi cấy, thu 200 μl dịch nuôi cấy cho vào eppendorf và ly tâmở 13.000 v/p, 4oC trong 3 phút Sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi, bổ sung 50 μl nướccất và 50 μl dung dịch nạp mẫu 2X vào eppendorf, huyền phù thật kỹ, đun cáchthủy 10 phút ở 100oC, sau đó làm lạnh nhanh Ly tâm 13.000 v/p, 4oC trong 10phút, thu dịch nổi và nạp cùng một lượng mẫu từ 10–15 μl vào mỗi giếng của gelgom trong bản gel polyacrylamide 14% (100 x 100 x 0,75 mm), sau đó điện di vớicường độ 2 mA/giếng mẫu

Kết thúc quá trình điện di, lấy gel ra khỏi tấm kính và cắt bỏ phần gel gom.Nhuộm gel với dung dịch nhuộm trong 30-45 phút, sau đó tiến hành giải nhuộmbằng dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt và vạch proteinxuất hiện rõ So sánh các vạch protein của mẫu với mẫu chứng âm, xác định vạch