Các enzyme cắt giới hạn được dùng để cắt DNA là NdeI và HinIII, các dung dịch đệm cho phản ứng cắt tương ứng có nguồn gốc từ Fermentas.
2.2.3 Hóa chất cho phản ứng PCR
Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR như đệm PCR 10X và dNTP được cung cấp kèm theo DNA polymerase: Pfu DNA polymerase (Fermentas). 2.2.4 Hóa chất dùng cho tinh sạch DNA từ gel Agarose
Bộ Kit MEGA SpinTM Agarose Gel Extraction Kit (Intron) dùng để tinh chế DNA được thu nhận từ gel agarose. Quy trình gồm các bước: làm tan gel, hấp thu DNA, rửa và dung ly để thu nhận DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.5 Hóa chất dùng để hóa biến nạp plasmid
Môi trường LB pha trong 1 lít: Thành phần như Bảng 2.3
Bảng 2.3: Thành phần môi trường LB
Thành phần Đơn vị Khối lượng
Pepton (Merck) g 10
Cao nấm men (Merck) g 5
Môi trường LBkan: Môi trường LB bổ sung kháng sinh kanamycin sao cho nồng độ kháng sinh cuối cùng đạt 70 µg/ml.
2.2.6 Hóa chất dùng cho điện di protein
Gel Polyacrylamide 100 x 100 x 0,75 mm nồng độ 14% polyacrylamide, dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue, ethanol tuyệt đối, glacial acetic acid), dung dịch giải nhuộm.
2.2.7 Hóa chất dùng cho Western blot Màng lai nitrocellulose Màng lai nitrocellulose
Đệm chuyển protein lên màng lai (Townbin): Đệm chạy điện di SDS-PAGE bổ sung 20% methanol
Đệm TBS pH 7,5: 6,1 g Tris (M=121,14); 9 g NaCl; Thêm nước cất đủ 900 ml, chỉnh pH đến 7,5 bằng axit HCl 38%; Thêm nước cất đủ 1 lít. Lọc và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch đệm khóa màng: Skim milk 5% pha trong dung dịch TBS pH 7,5, chỉ pha trước khi sử dụng.
Dung dịch cộng hợp: 1 µg/ml protein A cộng hợp có gắn men PO (Sigma) pha trong dung dịch TBS, pH 7,5, chỉ pha trước khi sử dụng.
Dung dịch TMB màng
2.2.8 Hóa chất dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp mục tiêu IPTG (Merck).
2.2.9 Hóa chất dùng làm ELISA
Dung dịch đệm rửa phiến: bổ sung 0,5 ml Tween 20 trong 1 lít PBS pH 7,2. Dung dịch đệm citrat-acetate pH 6 pha trong 1 lit: 1,05 g Acid citric; 13,23 g Natri citrat; 6,12 g Natri acetat; 284 μl Acid acetic.
Dung dịch TMB 0,3% trong DMSO: 0,3 g 3,3’,5,5’Tetramethylbenzidin; 100 ml Dimethyl sulfoxid.
Cơ chất TMB: Dung dịch đệm citrat-acetat pH 6,: 9,0 ml; Dung dịch TMB 0,3% trong DMSO: 0,7 ml; Dung dịch H2O2 0,3%: 0,3 ml.
Chuẩn IFN-γ (Prospec).
Kháng thể kháng IFN-γ (Sigma). Protein A (Sigma).
2.2.10 Hóa chất để hòa tan IFN-γ từ tế bào E. coli
Đệm 1 (Đệm phá tế bào): 50 mM NaCl; 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base, pH 8. Đệm 2 (Đệm rửa lần 1): 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base; Triton 100X 1%, pH 8. Đệm 3 (Đệm rửa lần 2): 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base, pH 8. Đệm 4 (Đệm hòa tan protein thể vùi): 6 M Guanidine chloride; 5 mM EDTA; 50 mM Tris-base.
2.2.11 Hóa chất dùng để tinh chế protein tái tổ hợp
Dung dịch đệm dùng tái gấp cuộn: 20 mM Tris-base; 2 mM R-cystein; 2 mM O-cystein; 1,2 M Guanidine chloride; 0,4 M L-arginine; 25 mM EDTA.
Dung dịch đệm sắc ký rây phân tử: 20 mM Tris-base pH 8. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch đệm trao đổi cation: Dung dịch rửa 1: 20 mM Tris-base pH 8; dung dịch rửa 2: 20 mM Tris-base pH 9; dung dịch ly giải mẫu: 20 mM Tris-base + 1 M NaCl pH 8.
Dung dịch đệm lọc gel: 25 mM Acetate pH 4,6 + 0,15 M NaCl.
2.3 Dụng cụ và thiết bị pH kế (Mettler Toledo)
Máy đo OD (Bionate)
Bộ điện di chạy DNA (Bio-rad) Bộ điện di chạy protein (Bio-rad) Máy siêu âm (Sonicator 3000) Máy ly tâm lạnh (Hanil)
Máy sắc ký AKTA (Amersham)
Cột sắc ký XK5060, XK2620, XK50100 (GE Healthcare) Gel (Sephadex G-25, SP-Sepharose, Superdex 75)
2.4 Phương pháp
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Tiến hành cấy một khuẩn lạc E. coli vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc hoạt hóa qua đêm ở 200 v/p (vòng/phút), 37oC. Sáng hôm sau, hút 200 l dịch sinh khối đã được hoạt hóa vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB và nuôi cấy tiếp tục ở điều kiện như sau: 200 v/p, 37oC cho đến khi giá trị OD600 đạt 0,8–1,0; tiến hành ly tâm thu sinh khối ở 10.000 v/p, 40C, 10 phút. Sau đó, bổ sung 1 ml MgCl2–CaCl2 lạnh vô trùng vào effendorf chứa sinh khối E. coli vừa mới được ly tâm ở trên và huyền phù kỹ, ly tâm 10.000 v/p trong 10 phút ở 40C thu phần cặn. Tiếp tục bổ sung 1 ml MgCl2–CaCl2 lạnh vô trùng, ủ trong đá 15 phút và ly tâm thu phần cặn ở 10.000 v/p, 4oC trong 10 phút. Sau cùng, bổ sung 200 l CaCl2 lạnh + 20% glycerol vào phần cặn thu nhận ở bước trên, huyền phù kỹ và lưu giữ ở -70oC.
2.4.2 Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli khả nạp
DNA vector có nồng độ nhỏ hơn 50 ng được trộn đều vào 200 μl tế bào E. coli khả nạp, và giữ trong bể đá 30 phút. Hỗn hợp trên được chuyển nhanh vào bể ổn nhiệt 42oC, để yên 60 giây; sau đó nhanh chóng chuyển hỗn hợp trên trở lại bể đá trong 1-2 phút. Bổ sung 1 ml môi trường LB vào hỗn hợp đó và tiến hành nuôi cấy lắc ở 37oC trong 45 phút. Cuối cùng, hút 200 μl dịch trên trải lên môi trường LB 1,5% agar đã hấp khử trùng có bổ sung kháng sinh thích hợp, ủ ở 37oC qua đêm. Tiến hành đồng thời một mẫu đối chứng không có vector.
2.4.3 Cắt mở vòng vector pNanogen bởi cặp enzyme NdeI/HindIII
Tiến hành nuôi cấy chủng E. coli TOP10F’ mang vector pNanogen, sau đó tách chiết và thu nhận vector bằng bộ kit DNA-SpinTM Plasmid DNA Extraction Kit (Intron)theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Vector pNanogen sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Thực hiện phản ứng cắt ở 37oC trong 4 giờ bằng các enzyme NdeI và
HindIII, trong phản ứng cắt có thành phần như sau:
Đệm R 10X 10 µl Enzyme HindIII (10U/µl) 2 µl Enzyme
NdeI (10U/µl) 2 µl
dung dịch H2O vừa đủ 100 µl
Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra và tiến hành tinh chế bằng bộ kit MEGA SpinTM Agarose Gel Extraction Kit (Intron).
2.4.4 Tạo vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ
Thực hiện phản ứng nối gen IFN-γ đã được tinh sạch sau khi xử lý với hai enzyme
NdeI/HindIII vào vector pNanogen cũng đã được xử lý bởi cặp enzyme NdeI/HindIII nhờ enzyme T4 ligase. Các vector tái tổ hợp được nối thành công và
đặt tên là pNanogenIFN-γ.
Thực hiện phản ứng nối ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ bằng enzyme T4 ligase, trong phản ứng nối có các thành phần như sau:
Gen IFN-γ 6 μg
Vector pNanogen 2 μg
Dung dịch đệm 10X 2 μl
Enzyme T4 DNA ligase 1 μl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nước cất đủ 20 μl
Hỗn hợp phản ứng nối được biến nạp vào E. coli Top10F’ với kháng sinh là Kanamycin (70 μg/ml).
2.4.5 PCR khuẩn lạc
Với các khuẩn lạc thu nhận từ quá trình hóa biến nạp, tiến hành đánh số và dùng tăm vô trùng chấm nhẹ lên khuẩn lạc cấy sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LBKan, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC.
Thu sinh khối tế bào và tách chiết vector theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kiểm tra vector tách chiết bằng phản ứng PCR với mồi T7 promoter/T7 terminator. Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần như sau: Dung dịch đệm Pfu DNA polymerase 10X 10 μl dNTP 10X 10 μl MgSO4 (25 mM) 10 μl
Vector pNanogenIFN-γ (100 ng/μl) 1 μl
Mồi T7 pro (10 pmol/μl) 1 μl
Mồi T7 ter (10 pmol/μl) 1 μl
Pfu DNA polymerase 2,5 U
Nước cất đủ 100 μl
Tất cả các thành phần phản ứng được cho vào eppendorf 0,2 ml và đặt vào máy điều nhiệt với chương trình phản ứng được trình bày trên Hình 2.3.
Hình 2.3: Điều kiện phản ứng PCR
Sản phẩm thu được sau phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
2.4.6 Quy trình nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ sinh tổng hợp protein IFN-γở quy mô phòng thí nghiệm hợp protein IFN-γở quy mô phòng thí nghiệm
Nhân giống cấp 1
Tiến hành cấy một khuẩn lạc đơn chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ từ đĩa petri cho vào erlen (250 ml) chứa 25 ml môi trường LBKan đã được thanh trùng, nuôi cấy lắc hoạt hóa qua đêm ở 200 v/p, 37oC. Dịch nuôi cấy qua đêm này được sử dụng tiếp theo cho quá trình nuôi cấy và sinh tổng hợp protein IFN-γ.
Cảm ứng sinh tổng hợp protein IFN-γ ở quy mô phòng thí nghiệm
Hút 2,5 ml giống cấp 1 đã được hoạt hóa qua đêm cho vào erlen (250 ml) chứa 50 ml môi trường LBKan (hay tỷ lệ nạp giống cấp 1 chiếm 5% tổng thể tích môi trường nuôi cấy), tiến hành nuôi cấy ở 200 v/p, 37oC cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấy ở giữa thời điểm của pha tăng trưởng (pha log) tiến hành cảm ứng IPTG tại các nồng độ đang tiến hành khảo sát. Sau khi cảm ứng bằng IPTG,
tiếp tục nuôi cấy trong khoảng thời gian khảo sát. Kết thúc quá trình nuôi cấy khảo sát, tiến hành ly tâm thu sinh khối để tiến hành phân tích bằng các kỹ thuật: điện di SDS– PAGE, lai Western blot và đo quang phổ OD600. Đồng thời tiến hành nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ trên môi trường LB không được cảm ứng IPTG xem như đối chứng âm.
2.4.7 Phương pháp điện di SDS-PAGE
Kết thúc quá trình nuôi cấy, thu 200 μl dịch nuôi cấy cho vào eppendorf và ly tâm ở 13.000 v/p, 4oC trong 3 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi, bổ sung 50 μl nước cất và 50 μl dung dịch nạp mẫu 2X vào eppendorf, huyền phù thật kỹ, đun cách thủy 10 phút ở 100oC, sau đó làm lạnh nhanh. Ly tâm 13.000 v/p, 4oC trong 10 phút, thu dịch nổi và nạp cùng một lượng mẫu từ 10–15 μl vào mỗi giếng của gel gom trong bản gel polyacrylamide 14% (100 x 100 x 0,75 mm), sau đó điện di với cường độ 2 mA/giếng mẫu.
Kết thúc quá trình điện di, lấy gel ra khỏi tấm kính và cắt bỏ phần gel gom. Nhuộm gel với dung dịch nhuộm trong 30-45 phút, sau đó tiến hành giải nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt và vạch protein xuất hiện rõ. So sánh các vạch protein của mẫu với mẫu chứng âm, xác định vạch protein mục tiêu và so sánh vạch protein mục tiêu với thang protein, xác định kích thước của protein mục tiêu.
2.4.8 Phương pháp lai western blot
Điện di SDS-PAGE mẫu kết hợp với thang protein.
Ngâm gel trong dung dịch chuyển màng (Townbin) ít nhất 10 phút. Đồng thời chuẩn bị màng lai nitrocellulose, hai miếng giấy lọc có kích thước phù hợp với kích thước miếng gel. Ngâm màng lai, giấy lọc trong dung dịch Townbin ít nhất 10 phút. Tiếp theo, làm ướt các miếng xốp đệm với dung dịch Towbin, xếp theo thứ tự: cực âm, miếng xốp đệm, giấy lọc gel, gel, màng lai, giấy lọc, miếng xốp đệm, cực dương bộ chuyển màng (cẩn thận tránh sự tạo bọt khí giữa miếng gel và màng lai, tránh làm khô màng lai). Khóa bộ chuyển màng, thực hiện điện chuyển màng với các thông số: cường độ dòng điện 400mA, 120V, thời gian chuyển 120 phút.
Kết thúc quá trình chuyển màng lấy màng lai ra, ngâm màng lai trong dung dịch TBS 10-15 phút. Tiếp theo, đổ bỏ dung dịch TBS và cho vào nhẹ nhàng 10-15 ml dung dịch khóa màng sao cho dung dịch tiếp xúc ngập đều màng lai, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó, đổ bỏ dung dịch khóa màng và rửa màng lai 3 lần bằng dung dịch TBS, mỗi lần 5 phút. Sau khi rửa màng lai, ngâm màng lai trong dung dịch kháng thể sơ cấp kháng protein IFN-γ, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Tiếp tục rửa kỹ màng lai 30 phút bằng dung dịch TBS, mỗi lần rửa cách nhau 5 phút.
Tiếp tục, ngâm màng lai trong dung dịch kháng thể thứ cấp (kháng thể kháng kháng thể chuột cộng hợp men PO) trong 1 giờ, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng và rửa kỹ màng lai trong 30 phút bằng dung dịch TBS, mỗi lần rửa cách nhau 5 phút. Cuối cùng, đặt màng lai lên bìa trong, bổ sung cơ chất TMB sao cho cơ chất TMB phủ đều bề mặt màng lai, đợi 1-3 phút cho đến khi trên màng lai xuất hiện vạch protein mục tiêu và rửa màng lai lại bằng nước, sau đó đem phơi khô.
2.4.9 Phương pháp ELISA
Xử lý mẫu
Nếu mẫu đã qua giai đoạn tinh chế (sạch) tiến hành pho loãng ở các nồng độ và thực hiện phản ứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nếu mẫu thu được từ công đoạn lên men: Tiến hành thu sinh khối và phá màng bằng dung dịch lysis buffer (giải phóng protein dạng thể vùi), sau đó ly tâm thu dịch. Hòa tan dịch này trong 6 M Guanidine chloride và tiến hành pha loãng theo các nồng độ để thực hiện phản ứng.
Phủ phiến
- Mẫu IFN-γ được phủ vào các giếng của phiến 96 giếng. Các mẫu được pha loãng trong dung dịch đệm PBS 1X và mỗi giếng chứa thể tích mẫu là 100 μl. Từ giếng đầu, tiến hành pha loãng bậc 2 theo chiều dọc đi xuống.
- Tiến hành song song với mẫu là chuẩn đã có nồng độ xác định. Cũng tương tự với mẫu, chuẩn được pha loãng bậc 2 bằng PBS từ giếng đầu tiên theo hàng dọc. Giếng cuối cùng là trắng mẫu (chỉ có PBS để làm đối chứng).
- Ủ qua đêm.
- Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch đệm rửa phiến PBS pH7,2 có bổ sung Tween 20.
Khóa phiến
- Khóa phiến bằng 150 μl dung dịch BSA 1% cho mỗi giếng - Ủ phiến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch đệm rửa phiến PBS pH7,2 có bổ sung Tween 20
Ủ kháng thể thứ nhất
- Cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch kháng thể thứ nhất pha loãng 1000 lần - Ủ phiến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch đệm rửa phiến PBS pH7,2 có bổ sung Tween 20
Ủ kháng thể thứ hai
- Cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch kháng thể thứ hai pha loãng 1000 lần. - Ủ phiến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch đệm rửa phiến PBS pH7,2 có bổ sung Tween 20
Ủ cơ chất
- Cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch cơ chất TMB.
- Ủ phiến 15 phút để phản ứng màu xảy ra ở nhiệt độ phòng
Dừng phản ứng
- Cho vào mỗi giếng 50 μl dung dịch H2SO4 1M.
- Đo mật độ quang các giếng ở bước sóng 450 nm (OD450) bằng máy đọc ELISA.
Tính kết quả:
- Dựng đường chuẩn dựa vào kết quả OD 450nm và nồng độ chuẩn. - Từ đường chuẩn sẽ tính ra nồng độ của mẫu.
Nồng độ mẫu tính dựa vào đường chuẩn nhân với độ pha loãng, khoảng số liệu không chênh lệch nhiều được lấy trung bình ta sẽ có nồng độ mẫu.
2.4.10 Thu nhận protein IFN-γtừ tế bào E. coli
Các bước tách chiết protein IFN-γ [16], [19], [40], [70], [78].
- Hòa sinh khối tế bào sau khi ly tâm vào dung dịch đệm 1 với tỉ lệ giữa xác tế bào:đệm 1 là 1 g:12 ml, đồng nhất, ủ 4oC, 1 giờ. Siêu âm 6 phút. Ly tâm (7.000 v/p, 30 phút, 4oC) và thu tế bào.
- Hòa tế bào sau ly tâm vào dung dịch đệm 2 với tỉ lệ giữa xác tế bào:đệm 2 là 1 g:12 ml, đồng nhất mẫu, ủ 4oC, 1 giờ. Ly tâm 13.000 v/p, 30 phút, 4oC, thu tế bào.
- Hòa tế bào sau ly tâm vào dung dịch đệm 3 với tỉ lệ giữa xác tế bào:đệm 3 là 1 g:12 ml, đồng nhất mẫu, ủ 4oC, 1 giờ. Ly tâm 13.000 v/p, 30 phút, 4oC, thu tế bào.
- Hòa tế bào sau ly tâm vào dung dịch đệm 4 với tỉ lệ giữa xác tế bào:đệm 4 là 1 g:12 ml, đồng nhất mẫu. Ly tâm 13.000 v/p, 30 phút, 4oC, thu dịch có chứa protein IFN-γ đã được hòa tan phục vụ cho các thí nghiệm về sau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.11 Tinh sạch protein IFN-γ
Quá trình tinh sạch protein IFN-γ thu nhận từ quá trình lên men được thực hiện