Một trong những chủng E. coli được ứng dụng rộng rãi cho mục tiêu biểu hiện các protein tái tổ hợp là E. coli BL21. Tất cả các chủng E. coli BL21 đều không có protease được mã hoá bởi gen lon và thiếu protease màng ngoài được mã hoá bởi gen ompT. Vì vậy, protein tái tổ hợp sẽ tồn tại bền vững trong tế bào E. coli BL21 so với những chủng chủ khác có những protease này.
Enzym RNase E là sản phẩm phiên mã của gen rne131 có chức năng phân hủy mRNA. Chủng E. coli BL21(DE3) Star mang đột biến gen rne131, vì thế chủng này có khả năng gia tăng tính ổn định của mRNA và gia tăng sự biểu hiện của protein ngoại lai.
E. coli BL21(DE3) Star có chứa thể tiềm tan của thực khuẩn thể DE3 (một chuyển
thể của thực khuẩn thể ) mang đoạn DNA chứa gen lacI, promoter lacUV5 và gen mã hoá T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase được đặt dưới sự kiểm soát phiên mã của promoter lacUV5. Đây là một promoter được cảm ứng bởi lactose hoặc Isopropyl thio--D-galactosidase (IPTG). Do vậy, khi bổ sung IPTG vào môi trường nuôi cấy, gen mã hoá cho T7 RNA polymerase sẽ được hoạt hoá, T7 RNA polymerase tạo thành xúc tác việc phiên mã gen mục tiêu trên vector biểu hiện [67], [70] [79].
1.4.3.2 Hệ thống vector biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi sử dụng promoter T7
Đoạn gen mã hoá protein được chèn vào vùng MCS (Multi Cloning Sites) của vector và sự biểu hiện protein chịu sự kiểm soát của T7 promoter. Promoter này sẽ hoạt động khi T7 RNA polymerase của tế bào chủ E. coli BL21(DE3) Star bám vào. Trên vector biểu hiện cũng chứa gen lacI mã hoá cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên promoter T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG. Protein sẽ được biểu hiện theo sự kiểm soát của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG hoặc lactose được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Operon lac bao gồm 3 gen cấu trúc: lacZ, lacY, lacA dưới sự kiểm soát của một promoter, về phía thượng lưu của promoter có gen điều hòa lacI. Chức năng của mỗi gen như sau:
Gen điều hòa lacI mã hóa protein ức chế, protein ức chế gắn vào operator ngăn cản sự phiên mã của RNA polymerase.
Gen lacA mã hóa cho enzym transacetylase.
Gen lacY mã hóa cho enzym permease (enzym vận chuyển lactose vào trong tế bào).
Gen lacZ mã hóa enzym -galactosidase, enzym -galactosidase có 2 chức năng: đồng phân hóa đường α-lactose thành allolactose, enzym thủy phân đường lactose thành galactose và glucose).
Hệ thống operon lac sử dụng promoter lac có 2 cơ chế điều hòa sự biểu hiện gen: dưới sự kiểm soát âm bởi protein ức chế và dưới sự kiểm soát dương bởi protein CRP (cAMP receptor protein) còn có thể được gọi CAP (Catabolite Activator Protein, protein hoạt hóa dị hóa) [28], [87].
Cơ chế điều hòa âm
Khi môi trường không có lactose, protein ức chế được mã hóa bởi gen lacI gắn vào operator và ức chế phiên mã, sự ức chế này không hoàn toàn mà có sự phiên mã vượt cho phép tạo một số -galactosidase và các permease trên màng. Khi môi trường có lactose, -galactosidase xúc tác sự thủy phân lactose cũng như xúc tác phản ứng đồng phân hóa chuyển lactose thành -1,6-allolactose. Allolactose có ái lực cao với protein ức chế nên gắn được vào monomer của protein ức chế và làm thay đổi cấu trúc tetramer. Điều này làm giảm ái lực của protein ức chế với DNA, khiến protein ức chế rời khỏi operator. Sự phiên mã của operon được diễn ra để tạo các sản phẩm của gen, trong đó có enzym -galactosidase. Enzym - galactosidase thuỷ phân lactose trong môi trường, giúp vi sinh vật thu năng lượng. Tuy nhiên, theo thời gian, nồng độ lactose trong môi trường giảm, kéo theo sự giảm đồng phân allolactose. Điều này dẫn đến sự hoạt hóa protein ức chế trở lại gắn vào operator và ức chế sự phiên mã [28], [87].
Hình 1.13: Cơ chế điều hòa âm của hệ thống operon lac.
Cơ chế điều hòa dương
Trong môi trường nuôi cấy có mặt đồng thời cả lactose và glucose thì operon lac bị bất hoạt, hiện tượng này gọi là ức chế dị hoá. Các nghiên cứu cho thấy, khi glucose có mặt ở nồng độ cao thì hàm lượng cAMP (3',5'-cyclic adenosine
monophosphate) trong tế bào rất thấp; và ngược lại, khi không có glucose hoặc có không đáng kể thì hàm lượng cAMP trong tế bào được tổng hợp tăng cao. Vì vậy, cAMP được xem là chất chỉ thị (indicator) của sự vắng mặt glucose và là nhân tố điều hoà dương tính của các operon lac nói riêng hay operon dị hóa nói chung. Khi môi trường nội bào có hàm lượng cAMP cao, cAMP kết hợp với protein hoạt hóa dị hóa CAP tạo phức hợp CAP-cAMP và làm tăng ái lực của CAP đối với promoter. Phức hợp CAP-cAMP gắn vào vị trí CAP, ở đây xảy ra sự tương tác giữa protein CAP với RNA polymerase chính điều này giúp RNA polymerase gia tăng ái lực với promoter và tăng cường hoạt động phiên mã trong operon lac [28], [87].
Kết hợp cơ chế điều hòa âm và dương ở operon lac
Môi trường nuôi cấy có sự hiện diện glucose và không có chất cảm ứng lactose thì không có mRNA của operon lac được tạo ra (Hình 1.14A). Điều này được giải thích như sau: protein ức chế được mã hóa bởi gen lacI gắn vào lac operator và ức chế toàn bộ quá trình phiên mã của operon lac bất kể sự hiện diện của cAMP trong tế bào cao hay thấp.
Môi trường nuôi cấy có sự hiện diện glucose được duy trì sao cho hàm lượng cAMP trong tế bào thấp và có chất cảm ứng lactose thì có ít mRNA của operon
lac được tạo ra (Hình 1.14B). Điều này được giải thích như sau: khi có lactose thì
protein ức chế bất hoạt không gắn vào được operator, cAMP trong tế bào thấp nên phức hợp cAMP-CAP không được tạo ra để gắn vào promoter lac dẫn đến RNA polymerase có ái lực yếu với promoter nên ít mRNA của operon lac được tạo ra.
Môi trường nuôi cấy không có sự hiện diện glucose do đó hàm lượng cAMP trong tế bào cao và có chất cảm ứng lactose thì mRNA của operon lac được tạo ra nhiều
(Hình 1.14C). Điều này được giải thích như sau: khi có lactose thì protein ức chế
bị bất hoạt không gắn vào được operator, cAMP trong tế bào cao nên cAMP gắn với CAP tạo thành phức hợp cAMP-CAP và phức hợp này gắn vào vị trí CAP dẫn đến gia tăng ái lực của RNA polymerase với promoter nên quá trình phiên mã được tăng cường và mRNA của operon lac được tạo ra nhiều [28], [87].
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU