Sau khi xác định được thời điểm cảm ứng là sau 5 giờ 30 phút nuôi cấy lắc và cảm ứng với 0,5 mM IPTG, tiến hành khảo sát thông số nhiệt độ. Nhiệt độ tối ưu để E.
coli sinh trưởng phát triển là 37oC, vì vậy khi khảo sát xoay quanh giá trị này sẽ tìm ra nhiệt độ tối ưu nhằm thu nhận lượng protein IFN-γ tối đa. Các giá trị khảo sát nhiệt độ lần lượt ở 25oC, 30oC, 35oC, 37oC, 42oC. Kết quả khảo sát được trình bày ở Hình 3.8. Hình 3. 8 : K ết quả k h
ảo sát theo nhiệt độ cảm ứng 10
1 7
kDa
(1) chứng âm; (2) chuẩn IFN-γ ; (3-7) Kết quả biểu hiện tương ứng với 25oC, 30oC, 35oC, 37oC, 42oC; (8) Thang protein.
Kết quả SDS-PAGE (Hình 3.8)tại các giếng 3, 4, 5, 6 và 7 xuất hiện sự biểu hiện vượt mức một vạch protein có kích thước tương ứng với kích thước protein IFN-γ chuẩn (giếng 2). Ở trường hợp chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFNγ không được cảm ứng bởi IPTG (giếng 1) không xuất hiện vạch protein này. Quá trình tổng hợp protein IFN-γ có mức độ biểu hiện cao nhất ở nhiệt độ nuôi cấy là 37oC (giếng 6).
Để khẳng định lại kết quả SDS-PAGE, protein thu được tại các nhiệt độ được định lượng bằng kỹ thuật ELISA (Bảng phụ lục 3),nhận thấy tại nhiệt độ nuôi cấy là 37oC thích hợp cho sự biểu hiện tối đa protein IFN-γ (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Hàm lượng protein IFN-γ tại các nhiệt độ, kết quả lặp lại 6 lần.
Nhiệt độ (oC) 25 30 35 37 42
Nồng độ protein
(mg/l) 13,04±0,58 13,75±0,54 31,98±0,58 37,40±0,59 32,16±0,68
Dựa trên kết quả ELISA tiến hành phân tích Anova (Minitab 15) thì cũng thu được kết quả tương tự (bảng phụ lục 8). Như vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ nuôi cấy là 37oC cho các khảo sát tiếp theo.