Tách chiết protein IFN-γ

Sau khi thu được sinh khối từ quá trình lên men, protein IFN-γ được tách chiết và hòa tan theo quy trình ở Mục 2.4.10, Trang 36.

10 1 7 kDa

Hình 3.11: SDS-PAGE công đoạn tách chiết protein IFN-γ

(1): Mẫu IFN-γ sau khi lên men; (2): mẫu IFN-γ sau khi tách chiết; (3): IFNγ chuẩn; (4): Thang protein

Kết quả SDS-PAGE (Hình 3.11) thấytại giếng 1 có sự biểu hiện vượt mức của protein có trọng lượng phân tử tương ứng với kích thước của protein IFN-γ chuẩn (giếng 3), trong khi ở giếng 2 một lượng lớn các tạp chất đã bị loại bỏ sau quá trình tách chiết. Bên cạnh đó, protein IFN-γ thu được ở dạng thể vùi đã được hòa tan trong 6M Guanidine chloride để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo.

Sau khi hòa tan và ly tâm, chúng tôi thu được thể tích là 280 ml có nồng độ protein tổng số 2,45 mg/ml (đo bằng phương pháp Bradford) và kết quả ELISA hàm lượng protein IFN-γ tương ứng là 204,4 mg, chiếm khoảng 30% trong tổng số protein. Lượng mẫu này sẽ được dùng vào quá trình tinh sạch protein IFN-γ.

3.4.2 Tinh sạch protein IFN-γ

Mẫu protein IFN-γ sau khi thu nhận từ quá trình tách chiết sẽ được dùng vào quá trình tinh chế. Các bước của quá trình tinh chế bao gồm: Tái gấp cuộn, phương pháp lọc gel lần 1, trao đổi cation và lọc gel lần 2.

Tái gấp cuộn

Lượng mẫu thu được từ công đoạn lên men được tái gấp cuộn bằng dung dịch đệm tái gấp cuộn sao cho nồng độ protein tổng số cuối cùng là 400 μg/ml (tổng thể tích dung dịch đệm sử dụng là 1700 ml). Mẫu được tái gấp cuộn trong thời gian 30 giờ ở 40C. Lượng mẫu này sẽ dùng vào công đoạn lọc gel lần 1.

Phương pháp lọc gellần 1

Bơm 250 ml mẫu đã tái gấp cuộn vào cột cột XK5060, mẫu được phân tách ra khỏi cột bằng dung dịch đệm 20 mM Tris-base pH 8; quan sát và thu nhận các peak dựa trên phổ đồ (Hình 3.12).

Manual run 6:10_UV

Manual run 6:10_Cond

Manual run 6:10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 mAU 0 1000 2000 Peak 1 Peak 2 Peak mu ố i Hình 3.12: Phổ đồ phương pháp lọc gel lần 1

Mẫu sau khi được thu nhận dựa trên phổ đồ (Hình 3.12, peak 1 và peak 2) sẽ được tiến hành điện di SDS-PAGE để xác định peak chứa protein IFN-γ (Hình

3.13).

10 1 7 kDa

Hình 3.13: SDS-PAGE phương pháp lọc gel lần 1 (1) Thang protein; (2) Peak 1; (3) Peak 2; (4) IFN-γ chuẩn

Qua kết quả phân tích SDS-PAGE (Hình 3.13) nhận thấy tại giếng 2 (peak 1) có sự xuất hiện một vạch protein có kích thước tương ứng với kích thước protein IFN-γ chuẩn (giếng 4). Trong trường hợp của giếng 3 (peak 2) hầu như không thấy xuất hiện vạch protein này. Do đó, peak 1 được thu nhận để tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.

Trao đổi cation

Nhằm loại bỏ các tạp chất, mẫu thu được từ phương pháp lọc gel lần 1 sẽ được bám vào cột trao đổi cation XK2620 và tiến hành rửa giải theo giá trị tăng dần của pH (dung dịch rửa 1 và 2) nhằm loại bỏ các chất tạp có pI nhỏ hơn pI của protein IFN-γ. Cuối cùng dùng dung dịch ly giải để ly giải mẫu ra khỏi cột (Hình

3.14).

Manual run 5:10_UV Manual run 5:10_Cond Manual run 5:10_Logbook 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 mAU 200 400 600 800 1000 1200 ml Peak 1 Peak 2

Hình 3.14: Phổ đồ giai đoạn cation

Thu nhận và tiến hành chạy điện di SDS-PAGE peak thu được (Hình 3.15)

10 1 7 kDa

Hình 3.15: Kết quả SDS-PAGE công đoạn cation

(1) Thang protein; (2) Mẫu đã qua công đoạn cation; (3) IFN-γ chuẩn

Kết quả điện di SDS-PAGE Hình 3.15 cho thấy ở giếng 2 phần lớn các tạp chất đã được loại bỏ, còn lại monomer và có thể là dimer của protein IFN-γ cùng với các protein có trọng lượng phân tử cao. Các tạp chất này sẽ được loại bỏ thông qua bước lọc gel tiếp theo.

Lọc gel lần 2

Cột gel 50 x 78 mm (V = 1500 ml) được nhồi với gel Superdex 75 để tách những tạp chất còn lại ra khỏi mẫu. Mẫu sau khi thu được từ công đoạn chạy cation sẽ được nạp vào cột với lượng mẫu là 40 ml mỗi lần/cột 50 x 78 mm, tốc độ dòng 4 ml/phút, nhiệt độ cột là 200C. Kết quả thu được với các peak tách nhau khá rõ trên phổ đồ (Hình 3.16).

Manual run 6:10_UV

Manual run 6:10_ 0 200 400 600 800 1000 1200 mAU 0 1000 Peak 1 Peak 2 Peak 3

Hình 3.16: Phổ đồ công đoạn lọc gel lần 2

Thu nhận riêng các peak và tiến hành điện di SDS-PAGE để xác định peak chứa protein mục tiêu (Hình 3.17).

1 7 kDa

Hình 3.17: Kết quả SDS-PAGE công đoạn lọc gel lần 2

(1) Thang protein; (2) peak 1; (3) peak 2; (4) peak 3; (5) IFN-γ chuẩn

Qua kết quả chạy điện di SDS-PAGE nhận thấy ở giếng 2 (peak 1) tương ứng với các tạp chất có trọng lượng phân tử cao nhất, ở giếng 3 (peak 2) có thể là dimer của protein IFN-γ, ở giếng 4 (peak 3) tương ứng với kích thước của phân tử protein IFN-γ chuẩn. Chúng tôi thu nhận peak 3 (giếng 4), và tiến hành chạy kiểm tra lại bằng lai western blot với kháng thể kháng protein IFN-γ và chạy HPLC.

Hình 3.18: SDS-PAGE (A) và western blot (B) các giai đoạn tinh chế (1) Thang protein (Fermentas) (2) phươp pháp lọc gel lần 1; (3) giai đoạn trao đổi cation;

(4) giai đoạn lọc gel lần 2; (5) IFN-γ chuẩn

Lượng tạp chất giảm dần qua mỗi giai đoạn tinh chế (Hình 3.18A,giếng 24), và protein IFN-γ được tinh sạch hoàn toàn qua bước lọc gel lần 2 (Hình 3.18A,giếng 4). Trong khi đó, protein thu được qua mỗi bước tinh chế cho phản ứng lai đặc hiệu với kháng thể kháng protein IFN-γ (Hình 3.18B), do đó protein thu được ở mỗi giai đoạn được khẳng định là protein IFN-γ mục tiêu.

pháp HPLC . K

ết quả đư ợc thể hiện tr ên Hình 3. 19 . A B C

Hình 3.19: Phổ đồ kiểm tra độ sạch của mẫu tinh chế IFN-γ bằng HPLC

(A) Đệm; (B) IFN-γ chuẩn; (C) Mẫu IFN-γ

Kết quả HPLC (Hình 3.19) cho thấy mẫu protein IFN-γ sau khi qua tinh chế (Hình 3.19C) xuất hiện một peak chính cùng với thời gian lưu là 38,673 phút so với protein IFN-γ chuẩn (Hình 3.19B), bên cạnh đó còn xuất hiện một peak nhỏ với thời gian lưu là 33,150 phút khác so với mẫu protein IFN-γ chuẩn và so với dung dịch đệm (Hình 3.19A), đây là thành phần tạp chất còn lại sau quá trình tinh chế. Tỉ lệ lượng tạp chất còn lại sau khi tinh chế là 2,78% (Bảng phụ lục 13). Lượng tạp chất này nằm trong khoảng cho phép 5% tạp chất sau tinh chế (theo tiêu chuẩn nguyên liệu của công ty Dược Nanogen).

Sau quá trình tinh chế chúng tôi thu được lượng mẫu là 200 ml với nồng độ 250 μg/ml (Đo bằng phương pháp ELISA), hiệu xuất quá trình tinh chế = (Tổng protein IFN-γ tinh sạch)/(tổng protein IFN-γ ban đầu) = 50 (mg)/204,4 (mg) = 24,5%.

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Kết luận- đề nghị Luận Văn Thạc Sỹ Sinh Học

4.1 Kết luận

Các kết quả thực nghiệm của luận văn có thể được tóm tắt như sau:  Đã tạo được vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ mang đoạn gen mã hóa protein IFN-γ và tạo thành công chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ có khả năng biểu hiện protein IFN-γ ở dạng thể vùi.

 Đã biểu hiện thành công protein IFN-γ bằng chất cảm ứng IPTG ở chủng E.

coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ trên môi trường LBkan.

 Đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và cảm ứng protein IFN-γ ở chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ: nuôi cấy lắc trong môi trường LBkan, tại 37oC, sau 5 giờ 30 phút nuôi cấy tiến hành cảm ứng với 0,5 mM IPTG và tiếp tục nuôi trong 6 giờ trước khi ly tâm thu sinh khối.

 Đã áp dụng thành công điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ có khả năng biểu hiện protein IFN-γ ở quy mô 500 ml.  Đã thu nhận protein IFN-γ sau quá trình lên men với hiệu suất tinh chế đạt 24,5%.

 Đã thành công trong việc tinh sạch protein IFN-γ với độ tinh sạch 97%.

4.2 Đề nghị

Với mục tiêu ứng dụng protein IFN-γ trong điều trị xơ gan và các bệnh về virut đang có xu hướng ngày càng gia tăng trên thế giới và Việt Nam, đề tài cần tiếp tục thực hiện các nghiên cứu sau:

 Hoàn thiện quy trình lên men áp dụng vào quy mô bán công nghiệp và công nghiệp.

 Hoàn thiện quy trình tinh chế protein IFN-γ để thu nhận lượng protein IFN-γ đạt hiệu xuất cao nhất.

 Gắn peg (polyethylene glycol) vào phân tử protein IFN-γ.  Thử nhiệm hoạt tính sinh học của protein IFN-γ.

 Tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng.

DANH MỤC BẢNG PHỤ LỤC