Phương pháp lai western blot

Một phần của tài liệu Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein IFNγ người trong hệ thống biểu hiện E. coli ở quy mô phòng thí nghiệm (Trang 45 - 46)

Điện di SDS-PAGE mẫu kết hợp với thang protein.

Ngâm gel trong dung dịch chuyển màng (Townbin) ít nhất 10 phút. Đồng thời chuẩn bị màng lai nitrocellulose, hai miếng giấy lọc có kích thước phù hợp với kích thước miếng gel. Ngâm màng lai, giấy lọc trong dung dịch Townbin ít nhất 10 phút. Tiếp theo, làm ướt các miếng xốp đệm với dung dịch Towbin, xếp theo thứ tự: cực âm, miếng xốp đệm, giấy lọc gel, gel, màng lai, giấy lọc, miếng xốp đệm, cực dương bộ chuyển màng (cẩn thận tránh sự tạo bọt khí giữa miếng gel và màng lai, tránh làm khô màng lai). Khóa bộ chuyển màng, thực hiện điện chuyển màng với các thông số: cường độ dòng điện 400mA, 120V, thời gian chuyển 120 phút.

Kết thúc quá trình chuyển màng lấy màng lai ra, ngâm màng lai trong dung dịch TBS 10-15 phút. Tiếp theo, đổ bỏ dung dịch TBS và cho vào nhẹ nhàng 10-15 ml dung dịch khóa màng sao cho dung dịch tiếp xúc ngập đều màng lai, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó, đổ bỏ dung dịch khóa màng và rửa màng lai 3 lần bằng dung dịch TBS, mỗi lần 5 phút. Sau khi rửa màng lai, ngâm màng lai trong dung dịch kháng thể sơ cấp kháng protein IFN-γ, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Tiếp tục rửa kỹ màng lai 30 phút bằng dung dịch TBS, mỗi lần rửa cách nhau 5 phút.

Tiếp tục, ngâm màng lai trong dung dịch kháng thể thứ cấp (kháng thể kháng kháng thể chuột cộng hợp men PO) trong 1 giờ, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng và rửa kỹ màng lai trong 30 phút bằng dung dịch TBS, mỗi lần rửa cách nhau 5 phút. Cuối cùng, đặt màng lai lên bìa trong, bổ sung cơ chất TMB sao cho cơ chất TMB phủ đều bề mặt màng lai, đợi 1-3 phút cho đến khi trên màng lai xuất hiện vạch protein mục tiêu và rửa màng lai lại bằng nước, sau đó đem phơi khô.

Một phần của tài liệu Tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein IFNγ người trong hệ thống biểu hiện E. coli ở quy mô phòng thí nghiệm (Trang 45 - 46)

Tải bản đầy đủ (DOCX)

(90 trang)
w