Quá trình tinh sạch protein IFN-γ thu nhận từ quá trình lên men được thực hiện thông qua các bước: Tái gấp cuộn, lọc gel lần 1, trao đổi cation và lọc gel lần 2 [16], [19], [40], [44], [70], [71], [78].
Tái gấp cuộn (re-folding)
Chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pNanogenIFN-γ sẽ sinh tổng hợp protein IFN-γ trong suốt quá trình cảm ứng. Sau khi cảm ứng, thu protein IFN-γ từ vi khuẩn. Quá trình thu nhận protein IFN-γ từ E. coli khiến cho protein không còn giữ nguyên cấu trúc ban đầu. Tái gấp cuộn là giai đoạn giúp cho protein trở về trạng thái có hoạt tính sinh học.
Sử dụng đệm tái gấp cuộn để tiến hành pha loãng lượng protein vừa thu được, sao cho nồng độ protein cuối cùng nằm trong khoảng từ 350-400 µg/ml và mẫu được tái gấp cuộn trong thời gian ít nhất là 24 giờ ở 4-80C. Mẫu này sẽ được dùng để tiến hành công đoạn lọc gel lần 1 tiếp theo.
Để giảm độ dẫn điện, lọc gel lần 1 và loại protein tạp, mẫu sau khi được tái gấp cuộn sẽ được trao đổi qua một dung dịch đệm mong muốn với gel sử dụng là Sephadex G-25, hạt gel sẽ phân tách các protein theo kích thước phân tử: các protein có kích thước lớn sẽ ra trước, các protein có kích thước nhỏ ra sau.
Chúng tôi tiến hành nhồi cột XK5060 với thể tích gel là 980 ml, dung dịch đệm sử dụng là 20 mM Tris-base pH 8. Lượng mẫu bơm vào cột chiếm khoảng 20%- 30% thể tích cột. Quan sát phổ đồ, thu nhận các peak và tiến hành chạy SDSPAGE để xác định peak chứa protein mục tiêu. Thu nhận peak chứa protein IFN-γ và dùng cho công đoạn trao đổi cation tiếp theo.
Trao đổi cation (cation exchange chromatography)
Nhằm loại bỏ hầu hết các loại tạp chất không mong muốn chúng tôi tiến hành công đoạn trao đổi cation với loại gel sử dụng là SP-Sepharose (mang điện tích âm). Ứng dụng giá trị pI của protein IFN-γ (pI= 9,1) và pH của dung dịch đệm để loại bỏ các tạp chất. Do hạt gel mang điện tích âm nên mẫu chỉ bám được khi mang điện tích dương, tức pH (của dung dịch chứa mẫu, pH 8) < pI (của mẫu); khi pH (của dung dịch rửa) > pI của protein thì các protein khác (các tạp chất) sẽ mang điện tích âm và bị loại bỏ ra khỏi cột.
Sử dụng cột sắc ký XK2620 với thể tích gel 30 ml được dùng để hấp phụ lượng mẫu thu được từ công đoạn lọc gel lần 1. Sau khi rửa qua 2 dung dịch rửa, chúng tôi tiến hành ly giải mẫu ra khỏi cột, quan sát phổ đồ và tiến hành thu mẫu.
Mẫu thu được sẽ được dùng vào công đoạn lọc gel.
Phương pháp sắc ký lọc gel lần 2 (gel filtration chromatography 2)
Nhằm loại bỏ các tạp chất có trọng lượng phân tử lớn, chúng tôi tiến hành công đoạn lọc gel. Gel được sử dụng là Superdex 75 có khả năng phân tách các protein theo trọng lượng phân tử (phân tử có trọng lượng lớn sẽ ra trước, các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn sẽ ra sau). Do đó, cột gel phải có chiều dài đủ lớn, nhiệt độ và tốc độ dòng hợp lý để tách những tạp chất còn lại ra khỏi mẫu. Chúng tôi sử dụng cột XK50100 với thể tích gel 1.500 ml, tiến hành bơm mẫu vào cột sao cho V(mẫu bơm) ≤ 3%Vcột. Mẫu được phân tách trong cột với tốc độ dòng 4 ml/phút, nhiệt độ 190C-230C.