Xử lý mẫu
Nếu mẫu đã qua giai đoạn tinh chế (sạch) tiến hành pho loãng ở các nồng độ và thực hiện phản ứng.
Nếu mẫu thu được từ công đoạn lên men: Tiến hành thu sinh khối và phá màng bằng dung dịch lysis buffer (giải phóng protein dạng thể vùi), sau đó ly tâm thu dịch. Hòa tan dịch này trong 6 M Guanidine chloride và tiến hành pha loãng theo các nồng độ để thực hiện phản ứng.
Phủ phiến
- Mẫu IFN-γ được phủ vào các giếng của phiến 96 giếng. Các mẫu được pha loãng trong dung dịch đệm PBS 1X và mỗi giếng chứa thể tích mẫu là 100 μl. Từ giếng đầu, tiến hành pha loãng bậc 2 theo chiều dọc đi xuống.
- Tiến hành song song với mẫu là chuẩn đã có nồng độ xác định. Cũng tương tự với mẫu, chuẩn được pha loãng bậc 2 bằng PBS từ giếng đầu tiên theo hàng dọc. Giếng cuối cùng là trắng mẫu (chỉ có PBS để làm đối chứng).
- Ủ qua đêm.
- Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch đệm rửa phiến PBS pH7,2 có bổ sung Tween 20.
Khóa phiến
- Khóa phiến bằng 150 μl dung dịch BSA 1% cho mỗi giếng - Ủ phiến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch đệm rửa phiến PBS pH7,2 có bổ sung Tween 20
Ủ kháng thể thứ nhất
- Cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch kháng thể thứ nhất pha loãng 1000 lần - Ủ phiến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch đệm rửa phiến PBS pH7,2 có bổ sung Tween 20
Ủ kháng thể thứ hai
- Cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch kháng thể thứ hai pha loãng 1000 lần. - Ủ phiến 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa phiến 5 lần bằng dung dịch đệm rửa phiến PBS pH7,2 có bổ sung Tween 20
Ủ cơ chất
- Cho vào mỗi giếng 100 μl dung dịch cơ chất TMB.
- Ủ phiến 15 phút để phản ứng màu xảy ra ở nhiệt độ phòng
Dừng phản ứng
- Cho vào mỗi giếng 50 μl dung dịch H2SO4 1M.
- Đo mật độ quang các giếng ở bước sóng 450 nm (OD450) bằng máy đọc ELISA.
Tính kết quả:
- Dựng đường chuẩn dựa vào kết quả OD 450nm và nồng độ chuẩn. - Từ đường chuẩn sẽ tính ra nồng độ của mẫu.
Nồng độ mẫu tính dựa vào đường chuẩn nhân với độ pha loãng, khoảng số liệu không chênh lệch nhiều được lấy trung bình ta sẽ có nồng độ mẫu.