Trong tế bào E. coli, protein tái tổ hợp thường biểu hiện dạng thể vùi (inclusion body) không tan trong tế bào chất. Thể vùi được hình thành do tốc độ tổng hợp protein cao, các phân tử protein mới được tạo ra không kịp tự gấp cuộn mà kết tụ lại với nhau qua tương tác kị nước thành một thực thể không tan trong tế bào chất. Việc hình thành thể vùi thường xảy ra khi một protein được biểu hiện vượt mức (over-expression) trong tế bào. Do đó việc kiểm soát hợp lý tốc độ tăng trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, hay tốc độ trao đổi chất của tế bào chủ có ảnh hưởng phần nào đến đặc tính của protein tái tổ hợp trong tế bào chất, có thể dẫn đến sự hình thành
thể vùi hay không. Ngoài ra việc đồng biểu hiện (co-expression) protein tái tổ hợp với các chaperone phân tử cũng giúp giới hạn việc hình thành thể vùi [67], [70].
1.4.3 Chủng E. coli, hệ thống vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong biểu
hiện protein
1.4.3.1 Chủng E. coli BL21(DE3) Star
Một trong những chủng E. coli được ứng dụng rộng rãi cho mục tiêu biểu hiện các protein tái tổ hợp là E. coli BL21. Tất cả các chủng E. coli BL21 đều không có protease được mã hoá bởi gen lon và thiếu protease màng ngoài được mã hoá bởi gen ompT. Vì vậy, protein tái tổ hợp sẽ tồn tại bền vững trong tế bào E. coli BL21 so với những chủng chủ khác có những protease này.
Enzym RNase E là sản phẩm phiên mã của gen rne131 có chức năng phân hủy mRNA. Chủng E. coli BL21(DE3) Star mang đột biến gen rne131, vì thế chủng này có khả năng gia tăng tính ổn định của mRNA và gia tăng sự biểu hiện của protein ngoại lai.
E. coli BL21(DE3) Star có chứa thể tiềm tan của thực khuẩn thể DE3 (một chuyển
thể của thực khuẩn thể ) mang đoạn DNA chứa gen lacI, promoter lacUV5 và gen mã hoá T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase được đặt dưới sự kiểm soát phiên mã của promoter lacUV5. Đây là một promoter được cảm ứng bởi lactose hoặc Isopropyl thio--D-galactosidase (IPTG). Do vậy, khi bổ sung IPTG vào môi trường nuôi cấy, gen mã hoá cho T7 RNA polymerase sẽ được hoạt hoá, T7 RNA polymerase tạo thành xúc tác việc phiên mã gen mục tiêu trên vector biểu hiện [67], [70] [79].
1.4.3.2 Hệ thống vector biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi sử dụng promoter T7
Đoạn gen mã hoá protein được chèn vào vùng MCS (Multi Cloning Sites) của vector và sự biểu hiện protein chịu sự kiểm soát của T7 promoter. Promoter này sẽ hoạt động khi T7 RNA polymerase của tế bào chủ E. coli BL21(DE3) Star bám vào. Trên vector biểu hiện cũng chứa gen lacI mã hoá cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên promoter T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG. Protein sẽ được biểu hiện theo sự kiểm soát của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG hoặc lactose được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.
Operon lac bao gồm 3 gen cấu trúc: lacZ, lacY, lacA dưới sự kiểm soát của một promoter, về phía thượng lưu của promoter có gen điều hòa lacI. Chức năng của mỗi gen như sau:
Gen điều hòa lacI mã hóa protein ức chế, protein ức chế gắn vào operator ngăn cản sự phiên mã của RNA polymerase.
Gen lacA mã hóa cho enzym transacetylase.
Gen lacY mã hóa cho enzym permease (enzym vận chuyển lactose vào trong tế bào).
Gen lacZ mã hóa enzym -galactosidase, enzym -galactosidase có 2 chức năng: đồng phân hóa đường α-lactose thành allolactose, enzym thủy phân đường lactose thành galactose và glucose).
Hệ thống operon lac sử dụng promoter lac có 2 cơ chế điều hòa sự biểu hiện gen: dưới sự kiểm soát âm bởi protein ức chế và dưới sự kiểm soát dương bởi protein CRP (cAMP receptor protein) còn có thể được gọi CAP (Catabolite Activator Protein, protein hoạt hóa dị hóa) [28], [87].
Cơ chế điều hòa âm
Khi môi trường không có lactose, protein ức chế được mã hóa bởi gen lacI gắn vào operator và ức chế phiên mã, sự ức chế này không hoàn toàn mà có sự phiên mã vượt cho phép tạo một số -galactosidase và các permease trên màng. Khi môi trường có lactose, -galactosidase xúc tác sự thủy phân lactose cũng như xúc tác phản ứng đồng phân hóa chuyển lactose thành -1,6-allolactose. Allolactose có ái lực cao với protein ức chế nên gắn được vào monomer của protein ức chế và làm thay đổi cấu trúc tetramer. Điều này làm giảm ái lực của protein ức chế với DNA, khiến protein ức chế rời khỏi operator. Sự phiên mã của operon được diễn ra để tạo các sản phẩm của gen, trong đó có enzym -galactosidase. Enzym - galactosidase thuỷ phân lactose trong môi trường, giúp vi sinh vật thu năng lượng. Tuy nhiên, theo thời gian, nồng độ lactose trong môi trường giảm, kéo theo sự giảm đồng phân allolactose. Điều này dẫn đến sự hoạt hóa protein ức chế trở lại gắn vào operator và ức chế sự phiên mã [28], [87].
Hình 1.13: Cơ chế điều hòa âm của hệ thống operon lac.
Cơ chế điều hòa dương
Trong môi trường nuôi cấy có mặt đồng thời cả lactose và glucose thì operon lac bị bất hoạt, hiện tượng này gọi là ức chế dị hoá. Các nghiên cứu cho thấy, khi glucose có mặt ở nồng độ cao thì hàm lượng cAMP (3',5'-cyclic adenosine
monophosphate) trong tế bào rất thấp; và ngược lại, khi không có glucose hoặc có không đáng kể thì hàm lượng cAMP trong tế bào được tổng hợp tăng cao. Vì vậy, cAMP được xem là chất chỉ thị (indicator) của sự vắng mặt glucose và là nhân tố điều hoà dương tính của các operon lac nói riêng hay operon dị hóa nói chung. Khi môi trường nội bào có hàm lượng cAMP cao, cAMP kết hợp với protein hoạt hóa dị hóa CAP tạo phức hợp CAP-cAMP và làm tăng ái lực của CAP đối với promoter. Phức hợp CAP-cAMP gắn vào vị trí CAP, ở đây xảy ra sự tương tác giữa protein CAP với RNA polymerase chính điều này giúp RNA polymerase gia tăng ái lực với promoter và tăng cường hoạt động phiên mã trong operon lac [28], [87].
Kết hợp cơ chế điều hòa âm và dương ở operon lac
Môi trường nuôi cấy có sự hiện diện glucose và không có chất cảm ứng lactose thì không có mRNA của operon lac được tạo ra (Hình 1.14A). Điều này được giải thích như sau: protein ức chế được mã hóa bởi gen lacI gắn vào lac operator và ức chế toàn bộ quá trình phiên mã của operon lac bất kể sự hiện diện của cAMP trong tế bào cao hay thấp.
Môi trường nuôi cấy có sự hiện diện glucose được duy trì sao cho hàm lượng cAMP trong tế bào thấp và có chất cảm ứng lactose thì có ít mRNA của operon
lac được tạo ra (Hình 1.14B). Điều này được giải thích như sau: khi có lactose thì
protein ức chế bất hoạt không gắn vào được operator, cAMP trong tế bào thấp nên phức hợp cAMP-CAP không được tạo ra để gắn vào promoter lac dẫn đến RNA polymerase có ái lực yếu với promoter nên ít mRNA của operon lac được tạo ra.
Môi trường nuôi cấy không có sự hiện diện glucose do đó hàm lượng cAMP trong tế bào cao và có chất cảm ứng lactose thì mRNA của operon lac được tạo ra nhiều
(Hình 1.14C). Điều này được giải thích như sau: khi có lactose thì protein ức chế
bị bất hoạt không gắn vào được operator, cAMP trong tế bào cao nên cAMP gắn với CAP tạo thành phức hợp cAMP-CAP và phức hợp này gắn vào vị trí CAP dẫn đến gia tăng ái lực của RNA polymerase với promoter nên quá trình phiên mã được tăng cường và mRNA của operon lac được tạo ra nhiều [28], [87]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.1.1 Chủng vi sinh vật
Chủng chủ E. coli TOP10F’ [{lacIq Tn10 (TetR)} mcrA Δ(mrr-
hsdRMSmcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU
galK rpsL endA1 nupG] được dùng để dòng hóa các gen và tạo vector tái tổ hợp
(Invitrogen).
Chủng chủ E. coli BL21(DE3) Star [F– ompT hsdSB(rB–, mB–) gal dcm
rne131 (DE3)] dùng để biểu hiện gen trong vector pNanogen (Nanogen).
2.1.2 Vector
Vector pNanogen được sử dụng làm vector dòng hoá và biểu hiện protein dạng thể vùi được thiết kế bởi phòng Nghiên cứu-phát triển của công ty Dược Nanogen, bao gồm trình tự sao chép ori, f1 (+) origin, gen kháng kanamycin, trình tự promoter T7 lac, gen lacIq, vùng MCS.
MCS pNanogen 4900 bp Hình 2. 1 : Vector pNanogenIFN - γ
Đoạn gen mã hoá protein được chèn vào vùng MCS (Multi Cloning Sites) của vector pNanogen và sự biểu hiện của protein chịu sự kiểm soát của T7 promoter. Promoter này sẽ hoạt động khi T7 RNA polymerase của tế bào chủ E.
coli BL21(DE3) Star bám vào. Trên vector pNanogen cũng chứa gen lacI mã hoá
cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên promoter T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG. Protein sẽ được biểu hiện theo cơ chế kiểm soát âm của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Lượng protein tổng hợp với tốc độ cao nên chúng cuộn không đúng cấu trúc và tồn tại dưới dạng thể vùi. Bên cạnh đó, vector pNanogen còn mang gen kháng kháng sinh kanamycin do đó môi trường chọn lọc được bổ sung kanamycin.
2.1.3 Gen IFN-γ
Dựa vào trình tự protein công bố trên Dược điển châu Âu (EP6.0) có Uniprot number: P01579 (Bảng 2.1). Công ty Công Nghệ Sinh Học Dược Nanogen đã tiến hành tổng hợp nhân tạo từ công ty TopGen (Montreal, Canada) với các đặc điểm sau: Thiết kế một gen tổng hợp được dùng để biểu hiện protein của Eukaryote mang các codon “ưa thích” ở prokaryote; có trình tự nhận biết bởi enzyme NdeI,
HindIII lần lượt ở vị trí trước codon methionin và sau codon kết thúc dịch mã để
thuận lợi cho việc dòng hóa gen vào các vector biểu hiện. Gen IFN-γ tổng hợp được lưu trữ trong plasmid pUC57 và đặt tên là pUC57-IFN-γ (Bảng 2.1). Plasmid này được cung cấp bởi công ty TopGen và được sử dụng như khuôn để thu nhận gen IFN-γ phục vụ cho việc tạo dòng vector mang gen sinh tổng hợp protein IFN- γ.
Bảng 2.1: Trình tự protein IFN-γ công bố trên dược điển châu Âu và trình tự gen IFN-γ được tổng hợp. Protein sequence: MQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIV SFY FKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNV QRK AIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRG SC1010 Gene Synthesis:
Gene name: IFNG, Length: 427 bp, Vector name: pUC57, Sequence:
CATATGCAGGACCCATACGTTAAAGAAGCAGAAAATCTGAAAAAGTACTT CA ACGCTGGTCACAGCGATGTAGCAGATAACGGTACCCTGTTCCTGGGTATTC TG AAAAACTGGAAAGAAGAATCTGACCGTAAAATCATGCAGTCTCAAATTGT CTC CTTCTACTTCAAACTGTTTAAAAACTTCAAAGATGATCAGTCTATTCAGAA AA GCGTTGAAACCATCAAAGAGGATATGAACGTTAAATTCTTCAACTCTAACA AG AAGAAACGCGATGATTTCGAAAAACTGACCAACTATTCCGTAACTGACCT GAA TGTACAACGTAAAGCTATCCACGAACTGATTCAGGTAATGGCGGAACTGA GCC CGGCTGCCAAAACCGGCAAGCGTAAGCGTTCCCAGATGCTGTTCCGCGGT TAA GCTT
2.1.4 Các mồi dùng cho giải trình tự
Cặp mồi T7 pro và T7 ter (Novagen) được dùng để giải trình tự gen IFN-γ.
Bảng 2.2: Các mồi dùng trong giải trình tự gen
Tên mồi Mục đích Trình tự các nucleotide theo chiều 5’ → 3’
T7 pro Giải trình tự TAATACGACTCACTATAGGG
T7 ter Giải trình tự GCTAGTTATTGCTCAGCGG
2.1.5 Các thang chuẩn dùng cho điện di
A: Thang chuẩn DNA 10kb (Massruler), B: Thang chuẩn protein Spectra multicolor broadrange (MBI Fermentas) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.6 Các kháng thể dùng cho lai Western blot
Kháng thể sơ cấp: kháng thể đa dòng kháng đặc hiệu với protein IFN-γ từ chuột do công ty Công Nghệ Sinh Học Dược Nanogen cung cấp.
Kháng thể thứ cấp: kháng thể kháng Ig chuột cộng hợp với men PO (Peroxidase) (Sigma).
2.2 Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong luận văn được cung cấp bởi các công ty Merck, Amersham, Bio-Basic, Wako, Sigma, MBI Fermentas.
2.2.1 Các hóa chất dùng cho điện di DNA
Đệm TAE 1X, đệm nạp mẫu, dung dịch nhuộm DNA trên gel (Ethidium bromide), gel Agarose (Bio-Basic, Mỹ).
2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn
Các enzyme cắt giới hạn được dùng để cắt DNA là NdeI và HinIII, các dung dịch đệm cho phản ứng cắt tương ứng có nguồn gốc từ Fermentas.
2.2.3 Hóa chất cho phản ứng PCR
Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR như đệm PCR 10X và dNTP được cung cấp kèm theo DNA polymerase: Pfu DNA polymerase (Fermentas). 2.2.4 Hóa chất dùng cho tinh sạch DNA từ gel Agarose
Bộ Kit MEGA SpinTM Agarose Gel Extraction Kit (Intron) dùng để tinh chế DNA được thu nhận từ gel agarose. Quy trình gồm các bước: làm tan gel, hấp thu DNA, rửa và dung ly để thu nhận DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.5 Hóa chất dùng để hóa biến nạp plasmid
Môi trường LB pha trong 1 lít: Thành phần như Bảng 2.3
Bảng 2.3: Thành phần môi trường LB
Thành phần Đơn vị Khối lượng
Pepton (Merck) g 10
Cao nấm men (Merck) g 5
Môi trường LBkan: Môi trường LB bổ sung kháng sinh kanamycin sao cho nồng độ kháng sinh cuối cùng đạt 70 µg/ml.
2.2.6 Hóa chất dùng cho điện di protein
Gel Polyacrylamide 100 x 100 x 0,75 mm nồng độ 14% polyacrylamide, dung dịch nhuộm gel (Coomassie brilliant blue, ethanol tuyệt đối, glacial acetic acid), dung dịch giải nhuộm.
2.2.7 Hóa chất dùng cho Western blot Màng lai nitrocellulose Màng lai nitrocellulose
Đệm chuyển protein lên màng lai (Townbin): Đệm chạy điện di SDS-PAGE bổ sung 20% methanol
Đệm TBS pH 7,5: 6,1 g Tris (M=121,14); 9 g NaCl; Thêm nước cất đủ 900 ml, chỉnh pH đến 7,5 bằng axit HCl 38%; Thêm nước cất đủ 1 lít. Lọc và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch đệm khóa màng: Skim milk 5% pha trong dung dịch TBS pH 7,5, chỉ pha trước khi sử dụng.
Dung dịch cộng hợp: 1 µg/ml protein A cộng hợp có gắn men PO (Sigma) pha trong dung dịch TBS, pH 7,5, chỉ pha trước khi sử dụng.
Dung dịch TMB màng
2.2.8 Hóa chất dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp mục tiêu IPTG (Merck).
2.2.9 Hóa chất dùng làm ELISA
Dung dịch đệm rửa phiến: bổ sung 0,5 ml Tween 20 trong 1 lít PBS pH 7,2. Dung dịch đệm citrat-acetate pH 6 pha trong 1 lit: 1,05 g Acid citric; 13,23 g Natri citrat; 6,12 g Natri acetat; 284 μl Acid acetic. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch TMB 0,3% trong DMSO: 0,3 g 3,3’,5,5’Tetramethylbenzidin; 100 ml Dimethyl sulfoxid.
Cơ chất TMB: Dung dịch đệm citrat-acetat pH 6,: 9,0 ml; Dung dịch TMB 0,3% trong DMSO: 0,7 ml; Dung dịch H2O2 0,3%: 0,3 ml.
Chuẩn IFN-γ (Prospec).
Kháng thể kháng IFN-γ (Sigma). Protein A (Sigma).
2.2.10 Hóa chất để hòa tan IFN-γ từ tế bào E. coli
Đệm 1 (Đệm phá tế bào): 50 mM NaCl; 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base, pH 8. Đệm 2 (Đệm rửa lần 1): 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base; Triton 100X 1%, pH 8. Đệm 3 (Đệm rửa lần 2): 1 mM EDTA; 20 mM Tris-base, pH 8. Đệm 4 (Đệm hòa tan protein thể vùi): 6 M Guanidine chloride; 5 mM EDTA; 50 mM Tris-base.
2.2.11 Hóa chất dùng để tinh chế protein tái tổ hợp
Dung dịch đệm dùng tái gấp cuộn: 20 mM Tris-base; 2 mM R-cystein; 2 mM O-cystein; 1,2 M Guanidine chloride; 0,4 M L-arginine; 25 mM EDTA.
Dung dịch đệm sắc ký rây phân tử: 20 mM Tris-base pH 8.
Dung dịch đệm trao đổi cation: Dung dịch rửa 1: 20 mM Tris-base pH 8; dung dịch rửa 2: 20 mM Tris-base pH 9; dung dịch ly giải mẫu: 20 mM Tris-base + 1 M NaCl pH 8.
Dung dịch đệm lọc gel: 25 mM Acetate pH 4,6 + 0,15 M NaCl.
2.3 Dụng cụ và thiết bị pH kế (Mettler Toledo)
Máy đo OD (Bionate)
Bộ điện di chạy DNA (Bio-rad) Bộ điện di chạy protein (Bio-rad) Máy siêu âm (Sonicator 3000) Máy ly tâm lạnh (Hanil)
Máy sắc ký AKTA (Amersham)
Cột sắc ký XK5060, XK2620, XK50100 (GE Healthcare) Gel (Sephadex G-25, SP-Sepharose, Superdex 75)
2.4 Phương pháp
2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Tiến hành cấy một khuẩn lạc E. coli vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc hoạt hóa qua đêm ở 200 v/p (vòng/phút), 37oC. Sáng hôm sau, hút 200 l dịch sinh khối đã được hoạt hóa vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB và nuôi cấy tiếp tục ở điều kiện như sau: 200 v/p, 37oC cho đến khi giá trị OD600 đạt 0,8–1,0; tiến hành ly tâm thu sinh khối ở 10.000 v/p, 40C, 10 phút. Sau đó, bổ sung 1 ml MgCl2–CaCl2 lạnh vô trùng vào effendorf chứa sinh khối E. coli vừa mới được ly tâm ở trên và huyền phù kỹ, ly tâm 10.000 v/p trong 10 phút ở 40C thu phần cặn. Tiếp tục bổ sung 1 ml MgCl2–CaCl2 lạnh vô trùng, ủ trong đá 15 phút và ly tâm thu phần cặn ở 10.000 v/p, 4oC trong 10 phút. Sau cùng, bổ sung 200 l CaCl2 lạnh + 20% glycerol vào phần cặn thu nhận ở bước trên, huyền phù kỹ và lưu giữ ở -70oC.