3.1.1 Thu nhận gen IFN-γ
Đoạn gen IFN-γ người được tổng hợp từ công ty TopGen (Montreal, Canada) và được chèn vào plasmid pUC57. Gen IFN-γ người có kích thước 427 bp và ở hai đầu mút có chứa trình tự cắt của hai enzyme NdeI và HindIII .
Chúng tôi hóa biến nạp plasmid pUC57-IFN-γ vào tế bào E. coli TOP10F’ và tiến hành sàng lọc tế bào E. coli TOP10F’ mang plasmid pUC57-IFN-γ. Sau đó, plasmid này được tách chiết từ E. coli TOP10F’/pUC57-IFN-γ bằng bộ kit DNASpinTM Plasmid DNA Extraction Kit (Intron) theo hướng dẫn của nhà sản xuấtvà được lưu giữ ở -70oC.
Tiến hành xử lý plasmid pUC57-IFN-γ bằng cặp enzyme NdeI và HindIII. Sản phẩm từ phản ứng cắt được điện di trên gel agarose 1%.
Hình 3.1: Kết quả thu nhận đoạn gen IFN-γ
A: (1) Plasmid pUC57-IFN-γ chưa mở vòng; (2) pUC57-IFN-γ mở
vòng bằng NdeI và HindIII; (3) thang DNA (10 Kb)
B: (1) Thang DNA; (2) pUC57-IFN-γ mở vòng bằng NdeI và HindIII; (3) IFNγ chuẩn
Trên Hình 3.1 cho thấy plasmid pUC57-IFN-γ cắt bằng NdeI và HindIII cho một vạch có kích thước khoảng 430 bp đúng như kích thước gen IFN-γ đã thiết kế. Sau đó, vạch có kích thước 430 bp này được tinh sạch bằng bộ kit Agarose gel extraction kit (Intron) để chuẩn bị cho bước dòng hóa tiếp theo vào vector pNanogen.
3.1.2 Tạo dòng vector tái tổ hợp mang gen IFN-γ
Gen IFN-γ và vector pNanogen được xử lý bằng cặp enzyme NdeI-HindIII và tiến hành chạy điện di DNA. Sau đó, sản phẩm xử lý được tinh sạch bằng bộ kit Agarose gel extraction kit (Intron). Tiến hành nối vector pNanogen và đoạn gen IFN-γ tạo thành vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ. Trong vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ, gen mã hóa cho protein IFN-γ được điều khiển bởi promoter T7
(Hình 3.2). Promoter này sẽ hoạt động khi T7 RNA polymerase của tế bào chủ E.
coli BL21(DE3) Star bám vào. Trên vector pNanogenIFN-γ cũng chứa gen lacI
mã hoá cho một protein ức chế gắn vào vùng operator lac trên promoter T7, ngăn cản sự phiên mã cho đến khi có sự cảm ứng bởi IPTG (Isopropyl β-D-
ori Kan r f1 origin T7 ter T7 pro Nde I (600 bp ) Hind III (173 bp ) lac I Hình 3. 2 : Vector pNanogenIFN - γ
Protein IFN-γ sẽ được biểu hiện theo cơ chế kiểm soát âm của hệ thống operon lac khi chất cảm ứng IPTG được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, do đó chúng tôi
dùng IPTG là chất cảm ứng sinh tổng hợp protein IFN-γ. Do protein IFN-γ được tạo ra với tốc độ cao, các phân tử protein mới được tạo ra không kịp tự gấp cuộn mà kết tụ lại với nhau qua tương tác kị nước thành một thực thể không tan trong tế bào chất tạo thành thể vùi (inclusion body). Bên cạnh đó, vector pNanogenIFN-γ có gen chọn lọc kháng kháng sinh Kanamycin, vì vậy môi trường có bổ sung 70 µg/ml kháng sinh Kanamycin được sử dụng để nuôi cấy chọn lọc cho chủng vi khuẩn có mang vector pNanogenIFN-γ.
Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào E. coli TOP10F’. Thể biến nạp E. coli TOP10F’/pNanogenIFN-γ được sàng lọc trên môi trường LBKan agar.
Thể biến nạp E. coli TOP10F’ mang vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ được sàng lọc bằng phương pháp PCR khuẩn lạc, sử dụng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator. Nếu vector pNanogen không được gắn thêm gen IFN-γ thì sản phẩm PCR sẽ có kích thước khoảng 320 bp, nếu vector pNanogen mang đoạn gen IFN-γ thì sản phẩm PCR sẽ có kích thước khoảng 630 bp. Kết quả PCR khuẩn lạc được trình bày trên Hình 3.3.
Hình 3.3: Kết quả PCR khuẩn lạc để sàng lọc dòng tái tổ hợp
(1) Chứng âm; (2) PCR vector pNanogen; (3-11) PCR khuẩn lạc; (12) Thang DNA
Kết quả điện di agarose gel Hình 3.3 nhận thấy tại các giếng 2, 5, 7 và 10 có sự xuất hiện một vạch DNA có kích thước khoảng 320 bp, tương ứng với vector pNanogen không mang gen IFN-γ. Trong khi đó, tại các giếng 3, 4, 6, 8, 9 và 11 có sự xuất hiện một vạch có kích thước khoảng 630 bp, tương ứng với kích thước của đoạn gen IFN-γ đã được chèn vào vector. Chúng tôi chọn những khuẩn lạc ở các giếng 3, 4, 6, 8, 9 và 11 để nuôi cấy trong môi trường LBkan. Sau đó, tiến hành tách chiết vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ và lưu trữ ở -700C.
Việc chèn gen IFN-γ vào vector pNanogen được kiểm tra bằng phản ứng cắt giữa vector pNanogenIFN-γ với enzyme NdeI/HindIII và bằng phương pháp giải trình tự.
pNanogen/HindIII-NdeI
IFN-γ
Hình 3.4: Kết quả kiểm tra vector pNanogenIFN-γ bằng phản ứng cắt với enzyme NdeI/HindIII
Giếng 1, thang DNA 10kb. Giếng 2, sản phẩm cắt bằng enzyme NdeI/HindIII
Kết quả điện di agarose gel có sự xuất hiện hai vạch có kích thước lần lượt khoảng 5000 bp và 430 bp (Hình 3.4), tương ứng với kích thước của vector pNanogen và đoạn gen IFN-γ.
Kết quả giải trình tự vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ với cặp mồi T7 promoter- F/T7 terminator-R cũng cho thấy đoạn gen IFN-γ chèn trong vector pNanogen có độ tương đồng đạt 100% so với trình tự gen IFN-γ người được thiết kế (Bảng phụ
lục 14 và 15).
Như vậy, chúng tôi đã thu nhận thành công vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ mang đoạn gen có khả năng biểu hiện protein IFN-γ.
3.1.3 Tạo dòng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ biểu hiện protein IFN-γ Vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ sau khi được tách chiết và thu nhận từ dòng tế Vector tái tổ hợp pNanogenIFN-γ sau khi được tách chiết và thu nhận từ dòng tế bào E. coli TOP10F’/pNanogenIFN-γ được biến nạp vào tế bào E. coli
BL21(DE3) Star. Thể biến nạp được sàng lọc trên môi trường LBKan agar. Có sự xuất hiện của các khuẩn lạc ở đĩa chứa E. coli BL21(DE3) Star đã được biến nạp với vector pNanogenIFN-γ, trong khi ở đĩa chứa chủng E. coli BL21(DE3) Star đối chứng không thấy xuất hiện các khuẩn lạc.
Chúng tôi sử dụng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7-pro và T7ter để tái khẳng định các thể biến nạp mọc trên môi trường LBkan là có mang vector pNanogenIFN-γ (kết quả không trình bày). Các thể biến nạp này được đặt tên là
E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ và được sử dụng làm ngân hàng chủng
gốc nhằm phục vụ nghiên cứu cũng như sản xuất.
3.1.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γtrên môi trường LB
Chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ được tiến hành nuôi cấy ở 200 v/p, 37oC trên môi trường LBKan. Sau mỗi 30 phút nuôi cấy, tiến hành thu dịch sinh khối và đo OD600. Kết quả đo OD600 trên môi trường LB được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả đo OD600 trên môi trường LB, kết quả lặp lại 3 lần Thời gian (giờ) 0 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 OD 0,026 0,0 6 0,0 7 0,09 0,12 0,2 0,3 0,5 0,6 7 1,1 5 1,7 2 Thời gian (giờ) 6,5 7 7,5 8 8,5 9 10 11 11,5 12 12,5 13 OD 2,47 2,7 2,9 3 3,09 3,18 3,28 3,32 3,32 3,31 3,2 3,1 Từ kết quả thu được ở Bảng 3.1 chúng tôi tiến hành dựng đường cong tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ trên môi trường LBkan. Đường cong tăng trưởng này sẽ được sử dụng để khảo sát các điều kiện của quá trình lên men tổng hợp protein IFN-γ.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
3.5 0 2 4 6 8 10 12 14 Giờ OD Hình 3. 5 : Đư ờng cong tăng tr ư ởng của chủng E. coli
BL21(DE3) Star mang vector tái t
ổ
hợp pNanogenIFN-γ
Chủng E. coli BL21 (DE3) Star/pNanogenIFN-γ cần 3 giờ để thích nghi với điều kiện môi trường nuôi cấy, chúng bắt đầu đi vào pha log sau 4 giờ nuôi cấy (OD = 0,5), đi vào pha ổn định sau 10 giờ nuôi cấy (OD= 3,28) và sau 12 giờ 30 phút nuôi cấy (OD = 3,2) sẽ bắt đầu đi vào pha suy tàn (Hình 3.5).
3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men biểu hiện protein IFN-γ
3.2.1 Khảo sát thời điểm cảm ứng biểu hiện IFN-γ
Thông thường, giai đoạn pha log là giai đoạn tế bào đang phát triển mạnh, nồng độ tế bào đủ để cảm ứng sinh tổng hợp protein. Dựa vào đường cong tăng trưởng, thời điểm cảm ứng tối ưu cho sự biểu hiện protein IFN-γ tại các thời điểm được khảo sát lần lượt là 5 giờ 30 phút; 6 giờ; 6 giờ 30 phút; 7 giờ; 7 giờ 30 phút và 8 giờ, nuôi cấy ở điều kiện 37oC, tốc độ lắc 200 v/p, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,5 mM.
Tế bào nuôi cấy ở các thời điểm cảm ứng được pha loãng về cùng một giá trị OD (OD= 0,5) và tiến hành chạy điện di SDS-PAGE. Bên cạnh đó, chúng tôi kiểm tra protein được biểu hiện này bằng lai Western blot với kháng thể kháng IFN-γ.
(A) (B) Hình 3. 6 : Kh
ảo sát thời điểm cả
m ứng IPTG 10 1 7 k Da
(A) SDS-PAGE; (B) Western blot
A: (1)Thang protein ; (2) chuẩn IFN-γ; (3) chứng âm; (4-9) Cảm ứng sau 5 giờ 30 phút; 6 giờ; 6 giờ 30 phút; 7 giờ; 7 giờ
30 phút và 8 giờ B: (1) Chuẩn IFN-γ; (2-3) Mẫu IFN-γ; (4)
Thang protein
Kết quả điện di SDS-PAGE xuất hiện sự biểu hiện vượt mức protein (Hình 3.6A,
giếng 4, 5, 6, 7, 8, và 9) có vạch kích thước tương ứng với kích thước của protein IFN-γ chuẩn (giếng 2), trong khi đó không thấy biểu hiện protein này ở chủng đối chứng âm (chủng không được cảm ứng). Tại các giếng 2 và 3 (Hình 3.6B) xuất hiện một vạch lai tương ứng với mẫu IFN-γ chuẩn (giếng 1), điều này cho thấy các protein biểu hiện vượt mức có phản ứng lai đặc hiệu với kháng thể kháng IFN-
γ, các protein biểu hiện vượt mức đó là protein IFN-γ. Kết quả diện di SDS-PAGE cũng xác định thời điểm cảm ứng sau 5 giờ 30 phút nuôi cấy cho hàm lượng protein IFN-γ là cao nhất.
Mẫu thu được tại các thời điểm khảo sát được định lượng bằng kỹ thuật ELISA với kháng thể kháng IFN-γ để khẳng định kết quả SDS-PAGE (Bảng 3.2 và Bảng phụ lục 1).
Bảng 3.2: Hàm lượng protein IFN-γ tại thời điểm cảm ứng, kết quả lặp lại 6 lần
Thời gian (giờ) 5,5 6 6,5 7 7,5 8 Nồng độ (mg/l) 34,94±0,3 9 30,33±0,4 2 25,06±0,6 2 21,97±0,52 14,87±0,5 9 10,04±0,30
Bảng kết quả ELISA cho thấy tại 5 giờ 30 phút thu được nồng độ protein IFN-γ cao nhất và đạt 34,94 mg/l. Bên cạnh đó, kết quả phân tích bằng phương pháp thống kê Anova (Minitab 15) trên kết quả định lượng cũng cho thấy thời điểm cảm ứng ở 5 giờ 30 phút là cao nhất (Bảng phụ lục 5).
Như vậy, chúng tôi chọn thời điểm cảm ứng là 5 giờ 30 phút sau khi bắt đầu nuôi cấy cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.2 Khảo sát nồng độ IPTG
IPTG là chất cảm ứng rất hiệu quả trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp nói chung hay protein IFN-γ nói riêng, tuy nhiên IPTG có giá thành cao nên việc tìm ra nồng độ thích hợp là yếu tố quan trọng vì sẽ giúp giảm chi phí trong quá trình sản xuất. Thông thường, nồng độ IPTG cảm ứng nằm trong khoảng 0,1-1 mM. Sau khi nuôi cấy lắc 5 giờ 30 phút trong môi trường LBkan sử dụng khoảng nồng độ 0,1-1 mM để khảo sát tìm ra nồng độ IPTG cảm ứng tối ưu trong quy trình biểu hiện protein IFN-γ. Kết quả khảo sát nồng độ IPTG tối ưu được trình bày ở Hình
10 1 7 kDa Hình 3.7: Khảo sát cảm ứng nồng độ IPTG
(1-10) kết quả biểu hiện IFN-γ ứng với 0,1-1 mM IPTG; (11) kết quả biểu hiện ứng
với 0,5 mM IPTG (chạy lại); (12) chuẩn IFN-γ; (13) chứng âm; (14) thang protein Tại giếng 1-10 kết quả SDS-PAGE (Hình 3.7) nhận thấy có sự biểu hiện vượt mức của protein có vạch kích thước tương ứng với kích thước của protein IFN-γ chuẩn (giếng 12), chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ không được cảm ứng bởi IPTG (giếng 13) không xuất hiện vạch protein này. Mức độ biểu hiện protein IFN-γ tăng theo nồng độ IPTG và đạt mức độ biểu hiện cao nhất từ giếng 5-10. Để khẳng định lại kết quả SDS-PAGE, chúng tôi tiến hành định lượng protein thu được bằng phương pháp ELISA (Bảng 3.3 và Bảng phụ lục 2).
Bảng 3.3: Hàm lượng protein IFN-γ tại các nồng độ IPTG, kết quả lặp lại 6 lần
IPTG (mM) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nồng độ protein (mg/l) 18,8±0,65 20,70±0,75 25,68±0,68 31,90±0,7 3 35,47±0,66 IPTG (mM) 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Nồng độ protein (mg/l) 35,25±0,7 1 35,15±0,6 2 35,22±0,3 0 35,24±0,8 8 35,25±0,48
Kết quả ELISA cho thấy lượng protein thu được tăng theo nồng độ IPTG và đạt giá trị cao nhất ở 0,5-1 mM. Mặt khác, khi phân tích kết quả ELISA bằng phương pháp thống kê Anova (Bảng phụ lục 6 và 7) thì thấy không có sự khác biệt về nồng độ protein IFN-γ thu được ở các nồng độ IPTG từ 0,5-1 mM. Vì vậy, để giảm chi phí sản xuất nồng độ IPTG được chọn để cảm ứng sinh tổng hợp protein IFN-γ là 0,5 mM cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy trong quá trình cảm ứng
Sau khi xác định được thời điểm cảm ứng là sau 5 giờ 30 phút nuôi cấy lắc và cảm ứng với 0,5 mM IPTG, tiến hành khảo sát thông số nhiệt độ. Nhiệt độ tối ưu để E.
coli sinh trưởng phát triển là 37oC, vì vậy khi khảo sát xoay quanh giá trị này sẽ tìm ra nhiệt độ tối ưu nhằm thu nhận lượng protein IFN-γ tối đa. Các giá trị khảo sát nhiệt độ lần lượt ở 25oC, 30oC, 35oC, 37oC, 42oC. Kết quả khảo sát được trình bày ở Hình 3.8. Hình 3. 8 : K ết quả k h
ảo sát theo nhiệt độ cảm ứng 10
1 7
kDa
(1) chứng âm; (2) chuẩn IFN-γ ; (3-7) Kết quả biểu hiện tương ứng với 25oC, 30oC, 35oC, 37oC, 42oC; (8) Thang protein.
Kết quả SDS-PAGE (Hình 3.8)tại các giếng 3, 4, 5, 6 và 7 xuất hiện sự biểu hiện vượt mức một vạch protein có kích thước tương ứng với kích thước protein IFN-γ chuẩn (giếng 2). Ở trường hợp chủng E. coli BL21(DE3) Star/pNanogenIFNγ không được cảm ứng bởi IPTG (giếng 1) không xuất hiện vạch protein này. Quá trình tổng hợp protein IFN-γ có mức độ biểu hiện cao nhất ở nhiệt độ nuôi cấy là 37oC (giếng 6).
Để khẳng định lại kết quả SDS-PAGE, protein thu được tại các nhiệt độ được định lượng bằng kỹ thuật ELISA (Bảng phụ lục 3),nhận thấy tại nhiệt độ nuôi cấy là 37oC thích hợp cho sự biểu hiện tối đa protein IFN-γ (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Hàm lượng protein IFN-γ tại các nhiệt độ, kết quả lặp lại 6 lần.
Nhiệt độ (oC) 25 30 35 37 42
Nồng độ protein
(mg/l) 13,04±0,58 13,75±0,54 31,98±0,58 37,40±0,59 32,16±0,68
Dựa trên kết quả ELISA tiến hành phân tích Anova (Minitab 15) thì cũng thu được kết quả tương tự (bảng phụ lục 8). Như vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ nuôi cấy là 37oC cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.4 Khảo sát thời gian nuôi cấy sau cảm ứng ảnh hưởng đến sự biểu hiện
protein IFN-γ
Sau khi cảm ứng sinh tổng hợp protein, khoảng thời gian nuôi cấy sau cảm ứng cũng có ảnh hưởng lớn tới lượng protein thu nhận. Dựa vào đường cong tăng trưởng nhận thấy sau 12 giờ 30 phút lắc liên tục thì chủng E.coli BL21 (DE3) Star/pNanogenIFN-γ bắt đầu đi vào pha suy tàn. Do đó, tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy sau khi cảm ứng tại các mốc thời gian 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8 giờ. Kết quả
10 1 7 kDa
Hình 3.9: Khảo sát biểu hiện IFN-γ theo thời gian
(1) chứng âm; (2) chuẩn IFN-γ; (3-9) biểu hiện IFN-γ theo thời gian 2-8 giờ;
(10) Thang protein
Kết quả phân tích SDS–PAGE Hình 3.9 nhận thấy tại các giếng 3, 4, 5, 6, 7, 8 và 9 xuất hiện một vạch protein biểu hiện vượt mức có kích thước tương ứng với kích thước protein IFN-γ chuẩn (giếng 2). Trong trường hợp chủng E. coli
BL21(DE3) Star/pNanogenIFN-γ không được cảm ứng bởi IPTG (giếng 1) không xuất hiện vạch protein này. Sau khi bổ sung IPTG theo thời gian thì lượng prtein IFN-γ được tổng hợp tăng lên và đạt cao nhất sau 6-8 giờ cảm ứng (Hình 3.9, giếng 7, 8, 9). Kết quả kiểm tra ELISA tại các mốc thời gian này cũng cho thấy sau 6-8 giờ thu được nồng độ protein là cao nhất (Bảng 3.5 và Bảng phụ lục 4).
Bảng 3.5: Hàm lượng protein IFN-γ theo thời gian cảm ứng, kết quả lặp lại 6 lần.
Thời gian (giờ) 2 3 4 5
Nồng độ IFN-γ
(mg/l) 25,40±0,58 34,84±0,76 35,43±0,58 36,65±0,65
Thời gian (giờ) 6 7 8
Nồng độ IFN-γ (mg/l)
Bên cạnh đó, phân tích thống kê Anova (Minitab 15) dựa trên kết quả ELISA nhận thấy không có sự khác nhau về mặt thống kê ở các khoảng thời gian từ 6-8 giờ (Bảng phụ lục 10). Vì vậy, để tiết kiệm thời gian chúng tôi chọn thời