tạo dòng biểu hiện

TẠO DÒNG BIỂU HIỆN CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA VECTOR TẠO DÒNG BIỂU HIỆN PHIÊN MÃ & DỊCH MÃ IN VITRO DỊCH MÃ IN VITRO  Các hệ thống dòch mã in vitro thông dụng : Dòch chiết thô có chứa : 70/80S RNA, tRNA, aminoacyl-tRNA  Tế bào hồng synthetases, nhân tố khởi cầu lưới thỏ động/kéo dài/kết thúc +  Mầm lúa mì aa, ATP/GTP, cofactor (Mg2+,  E coli K+, ), hệ thống tái tạo lượng (creatine phosphate/phosphokinase  Phương pháp (eukaryote), phosphoenol pyruvate - Chuẩn : RNA tinh  protein (HC lưới, lúa mì) (prokaryote) - Phối hợp : DNA  RNA  protein (kết hợp hệ thống phiên mã (RNA pol cuûa phage + promoter T3, T7, SP6 (E coli)  Yêu cầu dòch mã hiệu Eukaryote Prokaryote 5’-7methylG cap Trình tự S-D : 5’UAAGGAGGUGA3’ 3’ polyA tail Trình tự “Kozak” : TẠO DÒNG BIỂU HIỆN TRONG E COLI Yêu cầu  Phiên mã hiệu : promoter mạnh điều khiển được, có trình tự terminator (ngừng phiên mã) mạnh Promoter thông dụng : - lacZ, điều hòa chất cảm ứng IPTG - Lambda PL, điều hòa protein nhạy nhiệt tế bào chủ tiết - T7, điều hòa promoter khác (lac promoter)  Dòch mã hiệu : chứa trình tự liên kết ribosome (ribosome binding site-rbs) + codon khởi đầu AUG (GUC) + trình tự Shine-Dalgarno, codon ưa chuộng  Dòch mã khung đọc (in frame)  Biến đổi sau dòch mã : sử dụng chủng E coli biến đổi di truyền  Thêm số đặc tính khác : Bảo đảm tính ổn đònh : tạo fusion protein đầu N, biến đổi hóa học đầu N (acetyl hóa)/thêm số aa đặc biệt (Met, Ser, Ala, Thr, Val, Gly, ) ; sử dụng chủng chủ đột biến số gene mã hóa protease Tạo thuận lợi cho việc thu nhận protein (gắn thêm trình tự tiết) : gắn trình tự tín hiệu tạo fusion protein với protein tiết tự nhiên (MalE) hay protein vùng TẠO DÒNG ĐỒNG KHUNG KẾT QUẢ CẢM ỨNG TỔNG HP PROTEIN Ở E COLI MỘT HỆ THỐNG TẠO DÒNG BIỂU HIỆN Ở E COLI Ví dụ : Chủng BL21 DE đột biến proteases Lon, OmpT Chủng Rosetta cung cấp tRNAs cho codon  Tinh protein dựa lực trình tự mục tiêu ligand cố đònh: - Polyhistidine-tag (hexa histidine-tag – 6XHis-tag) : dựa lực chuỗi His với ion Ni 2+ cố đònh thông qua chelators (NTA-nitriloacetic acid, IDA-iminodiacetic acid) - GST-tag : dựa lực glutathione-S-transferase với glutathione cố đònh - FLAG-tag : DYKDDDDK, sử dụng kháng thể antiFLAG M1, 2, để tinh ; làm tăng tính tan protein có chứa trình tự nhận biết cuûa enterokinase - MBP-tag (Maltose Binding Protein) / maltose : protein vùng periplasmic, tăng khả thu nhận protein E coli, sử dụng giá thể chứa maltose để tinh TINH SẠCH PROTEIN ĐÁNH DẤU Các bước :  Tạo dòng gene mục tiêu vào vector có mang trình tự dùng tinh (+ trình tự chất protease)  Biến nạp vào E coli cảm ứng tạo fusion protein  Thu dòch tế bào  cột, bead,  Thủy giải protease đặc hiệu  Thu nhận protein TTH TINH SẠCH PROTEIN ĐÁNH DẤU HISTIDINE THỦY GIẢI FUSION PROTEIN ĐỂ THU NHẬN PROTEIN MỤC TIÊU Các protease đặc hiệu sử dụng : Thrombin Leu-Val-Pro-ArgGly-Ser His-tag/GST fusion protein Factor Xa Ile-Glu/Asp-Gly-Arg  Enterokinase Asp-Asp-Asp-Asp-Lys  MBP fusion protein TẠO DÒNG TRONG NẤM MEN Vì dùng vector nấm men ? Phù hợp cho sản xuất lớn sử dụng an toàn, tạo dòng trình tự kích thước lớn, chế hoạt động eukaryote (điều hòa, spliing, glyosyl hóa, …) Phù hợp với protein chứa liên kết disulfide glycosyl hóa Các loại vector : YIp : ổn đònh, YEp : số lớn, YRp : gắn chèn vào NST, YCp : thuận tiên cho nghiên cứu “bổ sung” , YAC : thu nhận trình tựtạo dòng lớn (> 40 kb), Ty : nhân sau gắn chèn vào NST Chủng chủ thường Pichia pastoris Ứng dụng : - Tổng hợp protein - Nghiên cứu điều hòa gene TẠO DÒNG BIỂU HIỆN & CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO ĐỘNG VẬT (TRANSFECTION) Kỹ thuật chuyển gene vào tế bào động vật, đặc biệt tế bào động vật có vú Mục tiêu : - Nghiên cứu biểu gene tế bào động vật, đặc biệt sản phẩm cần biến đổi sau dòch mã gene có chứa intron - Sản xuất protein dùng cho liệu pháp gene - Tạo động vật chuyển gene Một số vấn đề thực nghiệm Vector Gồm nhóm : (1) Plasmid, (2) Plasmid + trình tự eukaryote, (3) Vector dùng nhân gene gắn chèn vào gene tế bào chủ (1) Plasmid + hệ thống phiên mã ĐV có vú : nhân E coli  chuyển vào tế bào ĐV có vú, gene gắn chèn vào gene tế bào chủ biểu bền vững yếu (2) Plasmid + trình tự khởi đầu chép eukaryote + promoter/enhancer (SV40) : hệ thống biểu tạm thời CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Biện pháp chuyển Biện pháp hóa học : Calcium phosphate, DEAE dextran (polycation) Biện pháp lý học : Điện biến nạp, vi tiêm, liposome, Sử duïng vector virus : SV40, baculovirus, retrovirus, adenovirus, … Marker chọn lọc - Thymidine kinase (tk) : tổng hợp thymidine, chọn lọc môi trường HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) với tế bào chủ tk- Dihydrofolate reductase : kháng methotrexate, tế bào CHO dhfr- Aminoglycoside phosphotransferase (APH) : kháng kháng sinh hoï aminoglycoside (kanamycin, neomycin, geneticin – G418) – Hygromycin B phosphotransferase - XGPRT–HGPRT (Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase) : khaùng mycophenolic acid - Các thành phần vector TTH : Plasmid pBR322 chứa : replicon prokaryote (E coli) + gene kháng kháng sinh + số trình tự RE REPORTER GENE Reporter gene : gene mã hóa cho protein thò dễ nhận biết, nối với gene mục tiêu để phát xác đònh biểu gene mục tiêu Các hệ thống thông dụng : Protein Hoạt tính & đo lường  CAT (chloramphenicol acetyl Chuyển nhóm acetyl đánh dấu phóng xạ lên transferase) chloramphenicol ; phát sắc ký lớp mỏng/phóng xạ tự ghi Nay thay ELISA phát enzyme CAT  GAL (-galactosidase) Thủy giải galactoside không màu  có màu X-Gal/IPTG  GUS (-glucuronidase) Thủy giải glucuronide không màu  có màu MUG phát huỳnh quang, X glucuronide có màu  LUC (luciferase) Oxy hóa luciferin phát quang VÍ DỤ VỀ REPORTER GENE : GFP ... trình tự tín hiệu tạo fusion protein với protein tiết tự nhiên (MalE) hay protein vùng TẠO DÒNG ĐỒNG KHUNG KẾT QUẢ CẢM ỨNG TỔNG HP PROTEIN Ở E COLI MỘT HỆ THỐNG TẠO DÒNG BIỂU HIỆN Ở E COLI Ví... thu nhận trình t tạo dòng lớn (> 40 kb), Ty : nhân sau gắn chèn vào NST Chủng chủ thường Pichia pastoris Ứng dụng : - Tổng hợp protein - Nghiên cứu điều hòa gene TẠO DÒNG BIỂU HIỆN & CHUYỂN GENE...CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA VECTOR TẠO DÒNG BIỂU HIỆN PHIÊN MÃ & DỊCH MÃ IN VITRO DỊCH MÃ IN VITRO  Các hệ thống dòch mã in vitro thông dụng