Nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và thu nhận hIGF 1 (human insulin like growth factor 1) từ escherichia coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DƢƠNG LONG DUY NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN hIGF-1 (HUMAN INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1) TÁI TỔ HỢP TỪ E coli Chuyên ngành: DI TRUYỀN Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến GS.TS Trần Linh Thước, người thầy tạo điều kiện tốt cho em học tập hoàn thành luận văn Em chân thành cảm ơn TS Đặng Thị Phương Thảo, cô người động viên, quan tâm giúp đỡ định hướng cho em suốt trình nghiên cứu sống Chân thành cảm ơn chị Phương Hiếu anh Văn Đức dìu dắt em ngày đầu bước chân vào lab A Xin cảm ơn chị Kim Hằng chị Mỹ Trinh bảo giúp đỡ em nhiều thời gian vừa qua Cảm ơn tất anh chị bạn BM CNSH Phân tử & Môi trường, PTN CNSH Phân Tử A ln bên mình, chia sẻ niềm vui, nỗi buồn ngày tháng làm việc Lab A Và hết, xin cảm ơn mẹ anh chị ln quan tâm, chăm sóc tạo điều kiện cho việc học Gia đình niềm tự hào, động lực để vươn tới thành công Một lần nữa, xin cảm ơn tất người! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9/2012 Dương Long Duy Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mục lục MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ii LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhân tố tăng trƣởng hIGF-1 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Đặc điểm gene mã hóa cấu trúc phân tử protein hIGF-1 1.1.3 Đặc điểm hoạt động hIGF-1 1.1.4 Chức hIGF-1 thể sống 1.1.5 Các hướng ứng dụng hIGF-1 1.1.5.1 Điều trị bệnh IGFD 1.1.5.2 Điều trị số bệnh khác 1.1.5.3 Ứng dụng khác hIGF-1 10 1.1.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 giới Việt Nam 11 1.2 Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp Escherichia coli .13 1.3 Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu tế bào E coli 14 1.4 Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp 17 1.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro 18 PHẦN II: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 Vật liệu 22 2.1.1 Dụng cụ thiết bị .22 2.1.2 Hóa chất môi trường 23 2.1.3 Nguyên vật liệu 28 2.2 Phƣơng pháp 30 2.2.1 Thu nhận gene higf-1 từ phIGF1 phản ứng PCR 32 2.2.2 Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 34 2.2.3 Tạo dòng tế bào E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 37 2.2.4 Tạo dòng tế bào E coli Origami(DE3) mang vector pET22b-higf1 .40 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Mục lục 2.2.5 Cảm ứng biểu protein hIGF-1 E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 40 2.2.6 Tinh chế thu nhận hIGF-1 44 2.2.7 Kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 thu nhận 45 PHẦN III: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 43 3.1 Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 48 3.1.1 Thu nhận gene higf-1 chuẩn bị vector pET-22b 49 3.1.2 Tạo dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 50 3.2 Tạo dòng tế bào E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 55 3.3 Cảm ứng biểu protein hIGF-1 .57 3.3.1 Phân tích biểu protein hIGF-1 tế bào chất E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 Tricine SDS-PAGE 57 3.3.2 Khẳng định biểu hIGF-1 Western blot .58 3.4 Tinh chế thu nhận kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 .59 PHẦN IV: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 64 Kết luận 65 Đề nghị .65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 70 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALS Acid Labile Subunit Amp Ampicillin Ampr Ampicillin resistance bp base pair DNA Deoxyribose Nucleic Acid dH2O distilled water (nước cất) dNTP deoxyNucleotide TriPhosphate DTT DiThioThreitol E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid EMEA European Medicines Agency FDA Food and Drug Administration FPLC Fast Performance Liquid Chromatography GH Growth Hormone HRP HorseRadish Peroxidase IPTG IsoPropyl-β-D-Thio-Galactoside hIGF-1 human Insulin-like Growth Factor IGF1R IGF-1 Receptor IGFBP Insulin-Like Growth Factor Binding Protein kDa kilo Dalton LB Môi trường Luria-Bertani MCS Multiple Cloning Site PBST Phosphate Buffered Saline Tween PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribose Nucleic Acid RNase Enzyme thuỷ giải RNA SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis -i- Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục bảng hình DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết đo nồng độ plasmid pET-22b 50 Bảng 3.2 Lượng hIGF-1 phân đoạn tinh chế 62 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử hIGF-1 Hình 1.2 Các đường truyền tín hiệu tế bào kích hoạt hIGF-1 Hình 1.3 Một số sản phẩm rhIGF-1 thị trường 12 Hình 1.4 Các phương pháp sắc ký sử dụng để tinh chế protein 17 Hình 1.5 Nguyên tắc chung phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro 18 Hình 2.1 Cấu trúc plasmid pET-22b .28 Hình 2.2 Thang chuẩn protein DNA 29 Hình 2.3 Chương trình PCR 33 Hình 3.1 Quy trình tạo dịng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 48 Hình 3.2 Thu nhận gene higf-1 49 Hình 3.3 Kết biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 51 Hình 3.4 Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 52 Hình 3.5 Sơ đồ vị trí chèn gene higf-1 vị trí bắt cặp mồi vector pET22b-higf1 53 Hình 3.6 Kết kiểm tra plasmid pET22b-higf1 phản ứng PCR với cặp mồi T7 pro/T7 ter cặp mồi 5’-NdeI-higf1 /T7 ter .54 Hình 3.7 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 vào tế bào E coli Origami(DE3) 56 Hình 3.8 Kết PCR khuẩn lạc E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 với cặp mồi T7 pro/T7 ter 56 Hình 3.9 Kết kiểm tra biểu protein hIGF-1 điện di Tricine-SDSPAGE .58 Hình 3.10 Chứng minh biểu protein hIGF-1 lai Western 59 -ii- Luận văn Thạc sĩ Sinh học Danh mục bảng hình Hình 3.11 Sắc ký đồ tinh chế thu nhận hIGF-1 sắc ký trao đổi cation 60 Hình 3.12 Kết phân tích Tricine SDS-PAGE phân đoạn protein thu nhận từ trình tinh chế sắc ký trao đổi cation .61 Hình 3.13 Kết phân tích độ tinh mẫu trước sau tinh chế phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ) .62 Hình 3.14 Ảnh hưởng hIGF-1 sau tinh chế lên khả tăng sinh dòng tế bào MCF-7 .63 -iii- Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu LỜI MỞ ĐẦU hIGF-1 hay gọi somatomedin C protein hormone tạo chủ yếu gan nhờ kích thích hormone tăng trưởng GH (Growth Hormone) hIGF-1 có vai trị kích thích tăng trưởng phát triển hầu hết loại tế bào thể đặc biệt tế bào - xương, tế bào gan, tế bào thần kinh, tế bào da, tế bào tạo máu … Bên cạnh hIGF-1 cịn giúp cân chu trình chuyển hố protein, lipid, carbohydrate nhiều loại hormone hợp chất sinh học khác Sự thiếu hụt hIGF-1 trẻ gây bệnh IGFD (Insulin-like growth factor deficiency) Trẻ bị mắc bệnh IGFD bị lùn so với trẻ bình thường phát triển khơng cân đối lượng GH bình thường Nguyên nhân đột biến gene mã hóa cho hIGF-1 thụ thể GH không đáp ứng với GH…Do để đảm bảo cho trẻ thiếu hụt hIGF-1 có khả phát triển bình thường việc phục hồi lượng hIGF-1 máu mức bình thường cần thiết Hiện khơng có phương thuốc chữa trị hiệu cho bệnh nhân mắc bệnh IGFD giai đoạn muộn, cách tốt để chữa trị IGFD phát sớm bệnh nhân mắc bệnh tiêm bổ sung đủ lượng hIGF-1 cần thiết cách sử dụng rhIGF-1 Vào năm 2005 sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp gồm Increlex (Tercia) Iplex (Insmed) FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc thực phẩm, Hoa Kỳ) chấp nhận sử dụng thuốc để điều trị trẻ bị lùn thiếu hụt hIGF1 Trong năm qua quan có chức cho phép trẻ em có tầm vóc nhỏ, lùn điều trị với rhIGF-1 ngày tăng lên Một số nghiên cứu gần cho thấy hIGF-1 có tác dụng tích cực việc điều trị số bệnh thần kinh, suy tim, tổn thương bỏng, bệnh xơ cứng cột bên teo cơ, đái tháo đường loại 1, làm giảm lượng mỡ thể hIGF-1 sử dụng công nghệ mỹ phẩm làm đẹp da sử dụng cho vận động viên thể dục thể thao để tăng lượng bắp tăng cường trình đồng hóa giúp tăng cường thể lực Ngồi ra, có nhiều nghiên cứu tiến hành để làm rõ vai trò khả ứng dụng hIGF-1 Trang Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu Tại Việt Nam sản phẩm hIGF-1 chủ yếu nhập từ nước với giá thành cao Việc nghiên cứu tìm quy trình sản xuất protein với hiệu suất cao, đơn giản rẻ tiền nhằm sản xuất sản lượng lớn hIGF-1 giá rẻ phục vụ cho việc điều trị bệnh phục vụ nghiên cứu ứng dụng nước cần thiết Do đó, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Phân tử Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh tiến hành nghiên cứu sản xuất protein hIGF-1 công nghệ DNA tái tổ hợp Trong khn khổ chương trình nghiên cứu, luận văn thực nhằm: “Nghiên cứu tạo dòng, biểu thu nhận hIGF-1 (human insulin-like growth factor 1) từ Escherichia coli” Luận văn bao gồm nội dung sau: Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b Tạo chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 Tạo chủng tế bào E coli Origami(DE3) mang vector tái tổ hợp pET22bhigf1 Cảm ứng biểu thu nhận thể vùi có chứa hIGF-1 từ chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 Hòa tan thể vùi tái gấp cuộn hIGF-1 Tinh chế thu nhận hIGF-1 sau tái gấp cuộn Kiểm tra hoạt tính hIGF-1 thu nhận Trang Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tổng quan tài liệu PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận higf-1 Vì khơng mang gene higf-1 kết PCR cho vạch có kích thước khoảng 309bp (là đoạn DNA từ vùng thượng lưu đến vùng hạ lưu vùng MCS plasmid pET-22b) (Hình 3.6, giếng 3) Kết PCR plasmid pET22bhigf1 với cặp mồi 5’-NdeI-higf1/T7 ter cho kích thước khoảng 355bp (Hình 3.6, giếng 5) tương ứng với kích thước gene higf-1 cộng với kích thước đoạn DNA vùng hạ lưu vùng MCS Như thu vector tái tổ hợp mang gene mục tiêu higf-1 gắn chiều phiên mã Plasmid tái tổ hợp đặt tên pET22b-higf1 d Kiểm tra trình tự gene higf-1 plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 Nhằm khẳng định độ xác trình tự so với thiết kế ban đầu đồng khung dịch mã promoter plasmid Plasmid tái tổ hợp pET22bhigf1 thu nhận sau trình kiểm tra tiến hành giải trình tự theo phương pháp Sanger cải tiến máy Big Dye TM terminator cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) Kết giải trình tự đem so sánh với đoạn gene higf-1 thiết kế dựa vào trình tự cơng bố ngân hàng gen Giải trình tự cho thấy trình tự gene mã hóa cho hIGF-1 plasmid tương đồng 100% với trình tự gene thiết kế gene higf-1 chèn khung dịch mã Như thành cơng việc thiết kế tạo dịng vector tái tổ hợp biểu gene higf-1 Vector sử dụng thí nghiệm nhằm biểu protein hIGF-1 E coli 3.2.Tạo dòng tế bào E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 Plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 biến nạp vào tế bào E coli Origami(DE3) nhằm biểu protein hIGF-1 Plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 có mang gene kháng kháng sinh ampicillin tế bào E coli Origami(DE3) có mang gene kháng kanamycin nên khuẩn lạc E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 mọc mơi trường có ampicillin kanamycin Do thể biến nạp sàng lọc đĩa mơi trường LB-Amp100-Kana40 Kết biến nạp (Hình 3.7) cho thấy đĩa tế bào E coli Origami(DE3) có bổ sung plasmid (hình B) có xuất khuẩn lạc đĩa chứng âm mẫu tế bào E coli Origami(DE3) khơng bổ sung plasmid (hình A) khơng xuất Trang 55 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận khuẩn lạc Điều chứng tỏ plasmid pET22b-higf1 biến nạp thành công vào tế bào E coli Origami(DE3) Hình 3.7 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 vào tế bào E coli Origami(DE3) A-Đối chứng, B-Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp Hình 3.8 Kết PCR khuẩn lạc E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 với cặp mồi T7 pro/T7 ter 1-Thang DNA 1kb plus; 2-Gene higf-1; 3-Sản phẩm PCR plasmid pET-22b mồi T7 pro/T7 ter; 4-Sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 mồi T7 pro/ T7 ter Trang 56 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận Để kiểm tra chắn khuẩn lạc E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 mọc đĩa biến nạp có chứa plasmid tái tổ hợp tiến hành kiểm tra thể biến nạp phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7 pro/T7 ter Kết PCR khuẩn lạc (Hình 3.8) cho thấy có vạch có kích thước khoảng 443bp kích thước gene higf-1 chèn vào plasmid cộng với kích thước vùng thượng lưu vùng hạ lưu vùng MCS plasmid pET-22b Như chúng tơi thu nhận dịng tế E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 3.3.Cảm ứng biểu protein hIGF-1 3.3.1.Phân tích biểu protein hIGF-1 tế bào chất E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 Tricine SDS-PAGE Để biểu vượt mức protein hIGF-1, cảm ứng chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 IPTG (isopropyl thio-β-D-galactoside) Khi bổ sung IPTG vào môi trường nuôi cấy, IPTG gắn vào lac repressor, làm protein thay đổi cấu hình khơng thể gắn vào lac operator Nhờ gene mã hóa cho T7 RNA polymerase biểu tạo enzyme T7 RNA polymerase IPTG giải phóng promoter T7 vector pET khỏi kiểm soát lac repressor Enzyme T7 RNA polymerase tạo thành gắn vào promoter T7 hoạt hóa giúp biểu gene mục tiêu tạo dòng vào vector Tiến hành nuôi cấy chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 5ml môi trường LB lỏng với nồng độ kháng sinh ampicillin 100μg/ml đạt OD600 = 0,4 – 0,6 tiến hành cảm ứng IPTG nồng độ cuối 0.5mM khoảng thời gian Sau thu sinh khối, phá tế bào để thu nhận mẫu protein tổng số, protein pha tủa protein pha tan Tiến hành đồng thời với mẫu đối chứng mẫu tế bào E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 không cảm ứng mẫu tế bào E coli Origami không mang plasmid tái tổ hợp Các mẫu protein xử lý biến tính để chạy Tricine-SDS-PAGE kiểm tra Kết phân tích Tricine SDS-PAGE (Hình 3.9) cho thấy giếng mẫu protein tổng số protein pha tủa chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 cảm ứng biểu có xuất vạch protein to đậm nằm vạch 14,4kDa thang chuẩn LMW tương ứng với kích thước 7,6kDa protein hIGF-1 Mặt khác, giếng mẫu tế bào E coli Trang 57 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận Origami không mang plasmid tái tổ hợp khơng có vạch protein Như mẫu protein tổng số mẫu protein pha tủa chủng E coli Origami(DE3)/ pET22b-higf1 cảm ứng cho vạch protein có kích thước tương ứng với protein hIGF-1 phần lớn nằm pha tủa, nên có khả chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 tổng hợp protein hIGF-1 dạng thể vùi Để chứng minh protein biểu vượt mức tế bào chất E coli hIGF-1, tiến hành lai Western với kháng thể đặc hiệu kháng hIGF-1 Hình 3.9 Kết kiểm tra biểu protein hIGF-1 điện di Tricine-SDSPAGE 1-Thang phân tử lượng thấp (LMW), 2-Chủng E coli Origami(DE3), 3Chủng E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 (-IPTG), 4-Chủng E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 (+ITPG) (protein tổng số), 5-Chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 (+IPTG) (protein pha tan), 6-Chủng E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 (+IPTG) (protein pha tủa) 3.3.2 Khẳng định biểu hIGF-1 Western blot Để khẳng định protein biểu ghi nhận từ kết Tricine-SDSPAGE hIGF-1, tiến hành lai Western với kháng thể đặc hiệu kháng protein hIGF-1 phát nhờ kháng thể IgG chuột có gắn HRP Các mẫu protein chạy điện di Tricine-SDS-PAGE theo thứ tự, sau tiến hành chuyển thẩm protein lên màng nitrocellulose, lai kháng thể phim Các vị trí có Trang 58 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận protein hIGF-1 gắn với kháng thể đặc hiệu kháng hIGF-1 cho tín hiệu làm đen phim, nên xuất vạch đen phim vị trí So sánh phim điện di, ta xác định vị trí protein hIGF-1 Kết lai Western trình bày Hình 3.10 Hình 3.10 Chứng minh biểu protein hIGF-1 lai Western (A): Phân tích điện di Tricine SDS-PAGE (B): Kết lai Western với kháng thể kháng hIGF-1 1-Thang phân tử lượng thấp (LWM), 2-Chủng E coli Origami(DE3), 3Chủng E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 (-IPTG), 4-Chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 (+ITPG) (protein tổng số), 5-Chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 (+IPTG) (protein pha tan), 6-Chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 (+IPTG) (protein pha tủa) Kết lai Western (Hình 3.10.B) cho thấy có xuất vạch lai khoảng 7,6kDa pha tổng pha tủa tương ứng với vạch protein biểu vượt mức gel điện di Tricine SDS-PAGE (giếng 4, 6) Như khẳng định protein biểu vượt mức cảm ứng IPTG gel Tricine-SDSPAGE protein hIGF-1 chủ yếu tồn dạng thể vùi tế bào chất E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 3.4 Tinh chế thu nhận kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 Chúng tiến hành nuôi cấy cảm ứng biểu protein hIGF-1 thể tích lớn Lượng sinh khối tươi chủng E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 thu nhận Trang 59 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận từ 1l môi trường LB 4,52 g Hịa sinh khối dung dịch ly giải sau tiến hành phá tế bào máy phá tế bào áp suất Thể vùi thu nhận sau trình ly tâm rửa dung dịch wash I, wash II wash III để loại bỏ thành phần tạp tế bào E coli Thể vùi hòa tan dung dịch hòa tan pha loãng dung dịch tái gấp cuộn, tái gấp cuộn điều kiện khuấy nhẹ vòng 24 25 oC Sau đó, dung dịch tái gấp cuộn chỉnh pH 4,0 acetic acid để ổn định 4oC vòng 4-6 tiến hành tinh chế thu nhận hIGF-1 sắc ký trao đổi cation Tiến hành tinh chế protein hIGF-1 hệ thống FPLC (AKTA explorer) sử dụng cột sắc ký trao đổi cation SPFF 5ml (Amersham Bioscience) Cân cột dung dịch NaOAc 25mM pH 4,0, thể tích nạp mẫu 100ml với tốc độ nạp mẫu 4ml/phút Protein hIGF-1 dung ly NaCl nồng độ 500mM, 1M pH 4,0 dung dịch NH4OAc 100mM pH 7,0 Sắc ký đồ thể Hình 3.11 Hình 3.11 Sắc ký đồ tinh chế thu nhận hIGF-1 sắc ký trao đổi cation Dựa vào sắc ký đồ cho thấy dung ly NaCl pH 4,0 nồng độ 500mM 1M không dung ly protein mục tiêu khỏi cột Điều chứng tỏ hIGF-1 bám chặt cột SP pH 4,0 sử dụng lực ion để dung ly không hiệu trường hợp Mặc khác dung ly NH4OAc 100mM pH 7,0 lại cho peak với cường độ tín hiệu thu nhận 120mAU thể tích mẫu thu 14,5ml với nồng độ protein đo phương pháp Trang 60 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận Bradford 0,065mg/ml Để kiểm tra độ tinh protein thu nhận bước dung ly, tiến hành điện di Tricine SDS-PAGE phân đoạn protein thu nhận từ trình tinh chế Kết phân đoạn phân tích Tricine SDS-PAGE trình bày Hình 3.12 Hình 3.12 Kết phân tích Tricine SDS-PAGE phân đoạn protein thu nhận từ trình tinh chế sắc ký trao đổi cation 1-Thang LMW, 2-Dịch tái gấp cuộn, 3-Dịch tái gấp cuộn sau qua cột SPFF, 4-Dung ly NH4OAc 100mM pH 7,0 Kết Tricine SDS-PAGE cho thấy giếng phân đoạn dịch tái gấp cuộn sau qua cột xuất vạch protein mục tiêu nhạt điều chứng tỏ hIGF-1 gắn lên cột SP lượng thất thoát sau qua cột thấp Kết Tricine SDS-PAGE phân đoạn dung ly NH4OAc 100mM pH 7,0 giếng cho thấy có vạch protein mục tiêu với độ tinh cao Điều chứng tỏ, hIGF-1 dung ly tốt với điều kiện tăng lực ion kết hợp với tăng pH Tuy nhiên phân đoạn dung ly lẫn vết vài protein tạp khác Do để thu hIGF-1 độ tinh cao cần phải tiến hành tinh chế thêm bước tinh chế khác để đạt độ tinh cao Trang 61 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận Bảng 3.2 Lượng hIGF-1 phân đoạn tinh chế Mẫu Trƣớc tinh chế Mẫu dung ly Thể tích (ml) Nồng độ protein (mg/ml) Tổng protein (mg) Độ tinh (%) Lƣợng hIGF-1 (mg) 100 0,061 6,1 33,0 2,013 14,5 0,065 2,61 81,7 0,77 Độ tinh mẫu protein sau tinh chế đánh giá sơ cách tính phần trăm protein hIGF-1 có mẫu sau tinh chế phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ) dựa kết điện di Tricine SDS-PAGE Kết phân tích trình bày Hình 3.13 Kết định lượng cho thấy, lượng protein hIGF-1 trước qua cột 2,013 mg lượng protein hIGF-1 sau tinh chế 0,77 mg Do hiệu suất thu hồi trình tinh chế 38,25% Hình 3.13 Kết phân tích độ tinh mẫu trước sau tinh chế phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ) Mẫu protein sau tinh chế tiến hành kiểm tra hoạt tính sinh học phương pháp thử hoạt tính in vitro dịng tế bào MCF-7 Tế bào MCF-7 với hình thái tốt, phát triển độ bao phủ khoảng 80% bề mặt đĩa tế bào sử dụng để kiểm tra hoạt tính hIGF-1 Tế bào ni cấy mơi trường DMEM/F12 bổ sung 0.5% FBS Tiến hành song song mẫu tế bào có bổ sung hIGFTrang 62 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết & Biện luận tinh chế pha loãng PBS mẫu tế bào bổ sung PBS để làm đối chứng âm Ủ tế bào điều kiện 37oC 5% CO2 vịng ngày sau bổ sung dịch Cell counting kit tỉ lệ 1:10 (v/v) vào giếng đĩa thí nghiệm ủ tiếp 37oC 5% CO2 vòng Quan sát đổi màu dịch tế bào giếng đo mật độ quang bước sóng 450nm máy Multiskan Ascent Kết sau ngày ni cấy, tế bào mẫu có bổ sung hIGF-1 sau tinh chế có khả kích thích tế bào MCF-7 tăng sinh, mẫu tế bào MCF-7 bổ sung PBS khơng có khả tăng sinh Sau ủ với cell counting kit, kết so màu bước sóng 450nm cho kết mẫu bổ sung hIGF-1 0,423 mẫu đối chứng không bổ sung hIGF-1 0,221 (Hình 3.14) Do khẳng định mẫu hIGF-1 thu nhận từ tinh chế có khả kích thích tăng sinh dịng tế bào MCF-7 Tuy nhiên hoạt tính kích thích tăng sinh lại chưa cao Ngun nhân q trình tái gấp cuộn chưa hiệu trình thử nghiệm hoạt tính dịng tế bào MCF-7 chưa tối ưu Hình 3.14 Ảnh hưởng hIGF-1 sau tinh chế lên khả tăng sinh dòng tế bào MCF-7 Trang 63 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết luận & Đề nghị PHẦN IV KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ Trang 64 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Kết luận & Đề nghị Kết luận Protein human Insulin-like growth factor (hIGF-1) nhân tố tăng trưởng tiết gan kích thích hormone tăng trưởng GH hIGF-1 định để điều trị bệnh lùn trẻ thiếu hụt hIGF-1 sử dụng để kích thích phát triển khối lượng vận động viên thể dục thể thao Nhiều nghiên cứu hIGF-1 có khả kiểm soát lượng glucose máu bệnh nhân đái tháo đường loại loại 2, có tác động tích cực đến số bệnh thần kinh bệnh Alzheimer, số bệnh tim mạch nhiều nghiên cứu ứng dụng chức hIGF-1 tiến hành Với mục tiêu thu nhận lượng lớn hIGF-1 nhằm mục đích phục vụ điều trị bệnh nghiên cứu, khuôn khổ luận văn này, tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo dòng, biểu thu nhận protein hIGF-1 (human Insulin-like growth factor 1) tái tổ hợp từ E coli ” thu kết sau: - Tạo thành cơng dịng plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 có mang gene higf-1 mã hóa cho protein hIGF-1 - Tạo thành cơng dịng tế bào E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 có khả biểu protein tái tổ hợp hIGF-1 - Biểu thành công protein hIGF-1 tế bào chất E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 - Bước đầu tái gấp cuộn tinh chế thu nhận protein hIGF-1 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học với độ tinh 81,7% từ thể vùi biểu chủng tế bào E coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 Đề nghị Với kết nêu trên, chúng tơi có số đề nghị sau: - Xây dựng quy trình lên men dòng tế bào E coli Origami(DE3)/pET22bhigf1 qui mơ pilot - Khảo sát tối ưu hóa quy trình tái gấp cuộn để thu nhận lượng protein hIGF-1 có hoạt tính sinh học cao - Tối ưu quy trình tinh chế thu nhận protein hIGF-1 - Tối ưu quy trình thử nghiệm hoạt tính protein hIGF-1 in vitro Trang 65 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH Balhara B., Misra M., Levitsky L.L 2012 "Recombinant human IGF-1 (insulin-like growth factor) therapy: Where we stand today?" Indian Journal of Pediatrics 79 (2): 244-249 Bonefeld K., Møller S 2011 "Insulin-like growth factor-I and the liver" Liver International : Official Journal of the International Association for the Study of the Liver.31 (7): 911-9 Buell G., Schulz M.F., Selzer G., Chollet A., Movva N.R., Semon D., Escanez S., Kawashima E 1985 "Optimizing the expression in E coli of a synthetic gene encoding somatomedin-C (IGF-I)" Nucleic Acids Research 13 (6): 1923-38 Camacho-Hübner C , Savage M 2001 "Insulin-like growth factor -I deficiency".Hormone Research 55: 17-20 Cianfarani S., Clemmons D R., and Savage M O 2005 IGF-I and IGF binding proteins basic research and clinical management Basel: Karger Casali N., Preston A 2003 E coli plasmid vectors: methods and applications Totowa, N.J.: Humana Press Collett-Solberg P.F., Misra M 2008 "The role of recombinant human insulinlike growth factor-I in treating children with short stature" Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 93 (1): 10-18 Conti E., Musumeci M.B., Assenza E., Quarta G., Autore C., Volpe M 2008 "Recombinant human insulin-like growth factor-1: A new cardiovascular disease treatment option?" Cardiovascular and Hematological Agents in Medicinal Chemistry (4): 258-271 Denley A., Cosgrove L.J., Booker G.W., Wallace J.C., Forbes B.E 2005 "Molecular interactions of the IGF system" Cytokine & Growth Factor Reviews 16 (4-5) 10 Firth S.M., Baxter R.C 2002 "Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins" Endocrine Reviews 23 (6): 824-54 Trang 66 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tài liệu tham khảo 11 GE Healthcare 2009 “Recombinant protein purification handbook: principles and methods” Uppsala, Sweden: GE Healthcare Bio-Sciences 12 Hettmer S., Dannecker L., Foell J., Elmlinger M.W., Dannecker G.E 2005 "Effects of insulin-like growth factors and insulin-like growth factor binding protein-2 on the in vitro proliferation of peripheral blood mononuclear cells" Human Immunology 66 (2): 95-103 13 Höppener J W., de Pagter-Holthuizen P., Geurts van Kessel A.H., Jansen M., Kittur S.D., Antonarakis S.E., Lips C.J., Sussenbach J.S 1985 "The human gene encoding insulin-like growth factor I is located on chromosome 12" Human Genetics 69 (2): 157-60 14 Karey K.P., Sirbasku D.A 1988 "Differential responsiveness of human breast cancer cell lines MCF-7 and T47D to growth factors and 17 betaestradiol" Cancer Research 48 (14): 4083-92 15 Kim R.J., Grimberg A 2007 Potential non-growth uses of rhIGF-I Growth, Genetics & Hormones.23 (1) 16 Le Roith D 2003 "The insulin-like growth factor system" Experimental Diabesity Research (4) 17 Le Roith D., Bondy C., Yakar S., Liu J.L., Butler A 2001 "The somatomedin hypothesis: 2001" Endocrine Reviews 22 (1): 53-74 18 Makrides S.C 1996 "Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli" Microbiological Reviews 60 (3): 512-38 19 Mathews L.S., Hammer R.E., Behringer R.R., D'Ercole A.J., Bell G.I., Brinster R.L., Palmiter R.D 1988 "Growth enhancement of transgenic mice expressing human insulin-like growth factor I." Endocrinology 123 (6): 282733 20 Mayer M., Buchner J 2004 "Refolding of inclusion body proteins" Methods in Molecular Medicine 94: 239-54 21 Mukhopadhyay A 1997 "Inclusion bodies and purification of proteins in biologically active forms" Advances Biotechnology 56: 61-109 Trang 67 in Biochemical Engineering/ Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tài liệu tham khảo 22 Pollak M.N., Schernhammer E.S., Hankinson S.E 2004 "Insulin-like growth factors and neoplasia" Nature Reviews Cancer (7): 505-18 23 Raoul C., Aebischer P 2004 "ALS, IGF-1 and gene therapy: it's never too late to mend" Gene therapy – Basingstoke 11 (5): 429-430 24 Riss T.L., Karey K.P., Burleigh B.D., Parker D., Sirbasku D.A 1988 "Human Recombinant Insulin-like Growth Factor I I Development of a SerumFree Medium for Clonal Density Assay of Growth Factors Using BALB/c 3T3 Mouse Embryo Fibroblasts" In Vitro Cellular &Amp; Developmental Biology 24 (11): 1099-1106 25 Schägger H , von Jagow G 1987 "Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from to 100 kDa" Analytical Biochemistry 166 (2): 368-79 26 Sørensen H.P., Mortensen K.K 2005 "Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli" Journal of Biotechnology 115 (2): 113-28 27 Thomson A W (1998) The cytokine handbook San Diego: Academic Press 28 Timsit J., Savino W., Safieh B., Chanson P., Gagnerault M.C., Bach J.F., Dardenne M 1992 "Growth hormone and insulin-like growth factor-I stimulate hormonal function and proliferation of thymic epithelial cells" The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 75 (1): 183-8 29 Vai M., Brambilla L., Orlandi I., Rota N., Ranzi B.M., Alberghina L., Porro D 2000 "Improved Secretion of Native Human Insulin-Like Growth Factor from gas1 Mutant Saccharomyces cerevisiae Cells" Applied and Environmental Microbiology 66 (12): 5477-5479 30 Zeng G., Quon M.J 1996 "Insulin-stimulated production of nitric oxide is inhibited by wortmannin Direct measurement in vascular endothelial cells" The Journal of Clinical Investigation 98 (4): 894-8 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 31.http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2007/021884s001lbl.pdf Trang 68 Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tài liệu tham khảo 32.http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Orphan_designation/2 009/10/WC500006431.pdf 33.http://www.fda.gov/Drugs/ResourcesForYou/HealthProfessionals/ucm118121.ht m 34.http://www.increlex.com/pdf/Full_Prescribing_Information.pdf 35.http://www.megalife-usa.com/yue/proddetail.asp?id=11 36.http://www.revitropin.com/about-revitropin.htm Trang 69 ... 1. 1 Nhân tố tăng trƣởng hIGF- 1 1. 1 .1 Giới thiệu 1. 1.2 Đặc điểm gene mã hóa cấu trúc phân tử protein hIGF- 1 1. 1.3 Đặc điểm hoạt động hIGF- 1 1. 1.4 Chức hIGF- 1. .. hành nghiên cứu sản xuất protein hIGF- 1 công nghệ DNA tái tổ hợp Trong khuôn khổ chương trình nghiên cứu, luận văn thực nhằm: ? ?Nghiên cứu tạo dòng, biểu thu nhận hIGF- 1 (human insulin- like growth. .. 1. 1.5 Các hướng ứng dụng hIGF- 1 1. 1.5 .1 Điều trị bệnh IGFD 1. 1.5.2 Điều trị số bệnh khác 1. 1.5.3 Ứng dụng khác hIGF- 1 10 1. 1.6 Tình hình nghiên cứu sản