Ngoài các dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm, còn có các thiết bị sau: - Máy ly tâm lạnh Mikro22R (Hettich Zentrifugen)
- Máy đo quang phổ Ultrospec 2000 - Máy lắc ổn nhiệt (Stuart Scientific) - Máy đo nồng độ DNA Nanodrop - Máy PCR (Biorad)
- Máy Vortex (IKA, Mỹ) - Máy đo pH (Orion, Anh)
- Máy đo quang phổ chuyên dụng GeneQuanpro (Amersham Biosciences) - Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences)
- Máy hút chân không
- Máy heat nhiệt Dri-Block DB-2D (Techne, Mỹ) - Máy khuấy từ VWR 360 (Mỹ)
- Cân kỹ thuật TE612, cân phân tích CP224S (Sartorius, Đức) - Thiết bị chuyển màng lai Hoefer mini VE
- Nồi hấp Autoclave (SS325-TOMY) - Bộ điện di protein (Biorad)
- Bộ điện di DNA Horizon 58 (Life technology) - Hộp đèn soi tia tử ngoại Hoefer (UVTM-19-230V) - Tủ ấm Memmert (Đức)
- Tủ sấy Memmert (Đức) - Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ) - Bộ lọc hóa chất
- Các loại tủ lạnh sâu -80oC, tủ lạnh -30oC, các loại tủ mát 4oC và 10oC (Nhật)
- Hệ thống tinh chế protein FPLC (AKTA - Tủ nuôi tế bào động vật
2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng a. Hóa chất
Phản ứng PCR
- Dung dịch MgCl2 25mM, MgSO4 25mM (Fermentas, Đức)
- Taq polymerase (1u/µl), pfu polymerase (2,5u/μl) (Fermentas, Đức)
- dNTPs 8mM (Fermentas, Đức)
- Buffer 10X tương ứng (Fermentas, Đức) - Mồi đặc hiệu T7 pro/ T7 ter (IDT, Hoa Kỳ)
- Mồi 5’-NdeI-higf1/3’-BamHI-higf1 (IDT, Hoa Kỳ)
- MiliQ (dd H2O)
Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
- Dung dịch I: Glucose 50mM; Tris-HCl 2,5mM pH 8,0; EDTA 10mM pH 8,0 - Dung dịch II (pha ngay trước khi sử dụng): 100µl SDS 10%; 40µl NaOH
5N; 860µl dH2O
- Dung dịch III: KOAc 5M; Glacial acetic acid 0,2M; pH 4,8 - Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0) (giữ ở 4oC)
- Chloroform - Rnase 10mg/ml (giữ ở -20oC) - Isopropanol lạnh (giữ ở -20oC) - Ethanol 100% lạnh (giữ ở -20oC) - Sodium acetate 3M (pH 5,2) - Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC)
Hóa chất sử dụng cho phản ứng nối
- Enzyme T4 DNA ligase 10u/µl (Fermentas) - Buffer ligation10X tương ứng (Fermentas).
Tinh chế DNA
- Binding buffer I, Wash buffer, Elution buffer (Biobasic, Canada)
Chuẩn bị tế bào vi khuẩn khả nạp
- Dung dịch CaCl2 100mM, hỗn hợp dung dịch MgCl2 20mM và CaCl2 80mM vô trùng (giữ 4oC)
- dH2O vô trùng
Điện di DNA trên gel agarose
- Dung dịch TAE: Tris acetate 40mM; EDTA 0,1M (pH 8,0)
- Dung dịch nạp mẫu DNA 6X: Bromophenol blue 0,25%; xylene cyanol 0,25%; glycerol 30% (pha trong TAE)
- Agarose (Biobasic, Canada)
- Ethidium bromide 10% (Merck, Đức)
Phản ứng cắt hạn chế
- Enzyme cắt hạn chế NdeI 10u/µl, BamHI 10u/µl (Fermentas, Đức) - Buffer Tango 10X (Fermentas, Đức)
- MiliQ
Cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu
- IPTG 1M
Phá tế bào vi khuẩn
- Dung dịch ly giải: Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, pH 8,0
- Dung dịch rửa thể vùi: Wash I (Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, TritonX-100 1%), Wash II (Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, SOC 1%), Wash III (Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, NaCl 1M)
Điện di Tricine SDS-PAGE
- Dung dịch pha gel-3X
Tris-HCl 3M SDS 0,3% pH 8,45 - Dung dịch đệm cực dương Tris-HCl 0,1M pH 8,9 - Dung dịch đệm cực âm Tris-HCl 0,1M Tricine 0,1M SDS 0,1%
- Gel phân tích 16%
Dung dịch pha gel 3X (pH 8,45) 3,3ml
Nước cất 1,7ml 30% acrylamid 0,8% bisacrylamid 3,96ml Glycerol 1ml Ammonium persulfate 10% 30μl TEMED 4μl - Gel gom 4%: Nước cất 1,64ml Dung dịch đệm gel 3X (pH 8,45) 0,6ml 30% acrylamid 0,8% bisacrylamid 0,24ml Ammonium persulfate 10% 20μl TEMED 2μl - Dung dịch nạp mẫu (6X) Tris HCl 0,35M SDS 10,28% Glycerol 36% DTT 0,6M Bromophenol blue 0,012% pH 6,8
- Dung dịch nhuộm gel
Coomassie brilliant blue 0,625g
Ethanol tuyệt đối 112,5ml
Glacial acetic acid 25ml
dH2O đủ 250ml
- Dung dịch giải nhuộm
Acetic acid 100% 100ml
Ethanol tuyệt đối 100ml
dH2O đủ 1000ml
- Dung dịch nhuộm bạc (Ag)
Dung dịch cố định 2: ethanol 100ml, dH2O 100ml Dung dịch natrithiosulfate 0,02 %
Dung dịch AgNO3 0,2%
Dung dịch hiện bạc: Na2CO310g, HCHO 37% 0,54ml, dH2O 500ml Dung dịch ngừng phản ứng: glycine 0,5g, dH2O 100ml
Lai Western - Dung dịch chuyển màng Tris HCl 3g Glycine 14,4g SDS 1g dH2O 800ml
Methanol (thêm vào trước khi sử dụng) 200ml
- Dung dịch PBST (Phosphate Buffered Saline Tween) dùng để pha loãng và rửa Na2HPO4 11,5g NaH2PO4 2,96g NaCl 5,84g Tween 20 1ml dH2O đủ 1000ml - Dung dịch khóa màng Sữa gầy 0,5g Dung dịch PBST 10ml
- Dung dịch kháng thể sơ cấp đặc hiệu cho protein mục tiêu và kháng thể thứ cấp có đánh dấu HRP-antibody Horseradish Peroxidase antibody)
Kháng thể 1l
Dung dịch PBST 10ml
- Dung dịch hiện phim HyperfilmTM ECL của Amersham Biosciences
Dung dịch hòa tan thể vùi
- Urea 4M, Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, pH 12,5 Dung dịch tái gấp cuộn protein hIGF-1
- Urea 2M, Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, cysteine 5mM, cystine 0,5mM, Tween 80 0,1%, pH 10,5
Tinh chế protein hIGF-1
- Binding buffer: NaOAc 25mM, pH 4,0
- Elution buffer: NaCl 1M pH 4,0 và NH4OAc 100mM pH 7,0
Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford
- Dung dịch Albumine 10mg/ml - Dung dịch thuốc thử Bradford
Coomassie brilliant blue 100mg
Ethanol 95% 50ml
Acid phosphoric 85% 100ml
dH2O đủ 1000ml
Nuôi cấy tế bào động vật
- Dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) 1X: NaCl 8g, KCl 0,2g, Na2HPO4 1,44g, KH2PO4 0,24g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH 7,4
- Dung dịch FBS (Fetal Bovine Serum) (GIBCOTM, Mexico) - DMSO (Merck, Đức)
- Dung dịch Trypan Blue 0.22%
- Dung dịch kháng sinh: Penicillin 100g/ml, Streptomycin 100g/ml -Dung dịch 0,25% Trypsin-0,53mM EDTA
b. Môi trƣờng
- Môi trƣờng Luria-Bertani (LB): Trypton 10g/l, NaCl 5g/l, cao nấm men
5g/l.
- Môi trƣờng LB agar: Môi trường LB lỏng bổ sung thêm 2% agar.
- Môi trƣờng LB-Amp100: Môi trường LB bổ sung thêm ampicillin nồng độ
cuối là 100g/ml.
- Môi trƣờng LB-Amp100-Kana40-agar: Môi trường LB bổ sung thêm ampicillin nồng độ cuối là 100g/ml, kanamycin nồng độ cuối là 40g/ml và 2% agar.
- Môi trƣờng DMEM/F12: là môi trường cơ bản được sử dụng để nuôi cấy tế
bào động vật.
2.1.3. Nguyên vật liệu
Tất cả các nguyên vật liệu đều được cung cấp bởi bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
a. Chủng vi sinh vật
- Chủng Escherichia coli DH5 {F- endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi - recA1 gyrA96 lacU169 (80 lacZ M15)} dùng để dòng hóa.
- Chủng chủ Escherichia coli Origami (DE3) [F-ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522: Tn10 trxB (KanR, TetR)] dùng để biểu hiện vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu.
b. Plasmid
- Plasmid phIGF1 có chứa trình tự gene higf-1 mã hóa cho hIGF-1, dùng để thu nhận gene higf-1 bằng phản ứng PCR.
- Plasmid pET-22b (Novagen) mang gene kháng kháng sinh ampicillin, có vùng MCS, trình tự khởi đầu sao chép, T7 promoter, T7 terminator và lac operator.
c. Dòng tế bào MCF-7 (ATCC)
Được sử dụng để kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1. Đây là dòng tế bào ung thư vú có biểu hiện các thụ thể của hIGF-1 trên bề mặt tế bào. hIGF-1 có khả năng kích thích dòng tế bào này tăng sinh.
d. Các thang chuẩn
Hình 2.2. Thang chuẩn protein và DNA
e. Các vật liệu khác
- Mồi: T7 pro/T7 ter, 5’-NdeI-higf1/3’-BamHI-higf1 đặc hiệu cho gen higf-1
được thiết kế bởi Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử & Môi trường, trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP. HCM và đặt tổng hợp tại công ty IDT (Hoa Kỳ).
- Màng lai Hybond ECL (nitrocellulose), HyperfilmTM ECL (Amersham Biosciences).
- Kháng thể đơn dòng kháng hIGF-1 (R&D system, Hoa Kỳ)
- Kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột có đánh dấu Horseradish peroxidase (Piera, India).
2.2. PHƢƠNG PHÁP
Để tiếp cận mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo tiến trình thực nghiệm như sau:
Plasmid phIGF-1 Plasmid pET22b
PCR thu nhận gene higf-1
Cắt gene bằng cặp enzyme
NdeI và BamHI
Cắt plasmid pET22b bằng cặp enzyme NdeI và BamHI
Nối gene mục tiêu vào plamid bằng phản ứng nối với sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase.
Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α khả nạp
PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cho gene higf-1
Tách chiết plasmid từ thể biến nạp cho kết quả PCR dương tính Sàng lọc trên môi trường LB-Amp100
Thu nhận dòng plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 và dòng tế bào
E. coli DH5α/pET22b-higf-1
Biến nạp plasmid pET22b-higf1 vào chủng tế bào
E. coli Origami(DE3)
Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 từ chủng E. coli
Origami(DE3)/pET22b-higf1 bằng IPTG.
Phân tích sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng phương pháp Tricine SDS-PAGE và xác nhận sự biểu hiện bằng phương pháp lai Western
với kháng thể đặc hiệu kháng protein hIGF-1.
Sàng lọc thể biến nạp trên môi trường LB-Amp100-Kana40 và kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7pro/T7ter
Cảm ứng ở thể tích 1 lít LB, phá tế bào bằng áp suất, ly tâm và thu nhận thể vùi
Kiểm tra plasmid bằng các phương pháp: PCR với mồi đặc hiệu; cắt bằng cặp enzyme NdeI và BamHI; PCR với mồi thương mại T7pro/T7ter; giải trình tự.
2.2.1. Thu nhận gene higf-1 từ phIGF1 bằng phản ứng PCR
Plasmid phIGF-1 là plasmid có mang gene higf-1 mã hóa cho protein hIGF-1 được đặt tổng hợp theo thiết kế của Bộ môn CNSH Phân tử & Môi trường tại công ty IDT (Hoa Kỳ). Gene higf-1 được thu nhận với lượng lớn nhờ phản ứng PCR dùng cặp mồi 5’-NdeI-higf1 và 3’-BamHI-higf1 đặc hiệu cho gene có hai đầu là vị trí nhận biết của hai enzyme cắt đầu dính (đầu 5’-NdeI và 3’-BamHI) nhằm phục vụ cho công đoạn tạo dòng vào plasmid pET-22b.
PCR là kỹ thuật in vitro dùng để khuếch đại một trình tự DNA dựa trên phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase. Quá trình tổng hợp về cơ bản cũng giống với quá trình sao chép DNA trong tế bào khi được cung cấp đủ DNA khuôn mẫu, mồi, DNA polymerase, dNTP và dung dịch đệm. PCR gồm nhiều chu kì lặp đi lặp lại, mỗi chu kì gồm ba bước:
- Biến tính: tách DNA mạch đôi thành mạch đơn, nhiệt độ khoảng 94-95oC. Tinh chế thu nhận protein hIGF-1 bằng phương pháp sắc ký trao đổi cation trên hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp AKTA FPLC.
Đánh giá sơ bộ hoạt tính sinh học protein hIGF-1 trong mẫu dung ly từ quá trình tinh chế dựa trên khả năng kích thích tăng sinh dòng tế
bào MCF-7.
Thu nhận các phân đoạn tinh chế và phân tích bằng Tricine SDS- PAGE, định lượng protein hIGF-1 trong các phân đoạn tinh chế, đánh
giá hiệu suất thu hồi.
Rửa thể vùi bằng dung dịch wash I, wash II và wash III. Hòa tan thể vùi, pha loãng bằng dung dịch tái gấp cuộn và tái gấp cuộn.
- Bắt cặp: mồi bắt cặp với khuôn mẫu, do đó nhiệt độ này phụ thuộc nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi sử dụng, thường là 40-70oC.
- Kéo dài: DNA polymerase hoạt động gắn các nucleotide lần lượt vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Nhiệt độ kéo dài thường là 72oC.
Chương trình và thành phần phản ứng PCR được xác định dựa trên chương trình PCR chuẩn tuy nhiên có một số điều chỉnh để phù hợp với trình tự cần khuếch đại bao gồm: chiều dài của trình tự cần khuếch đại là 233bp nên thời gian kéo dài được chọn là 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp của mồi được xác định là 51oC dựa trên nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi 5’-NdeI-higf1 53,1oC và 3’-BamHI-higf1 là 54,7oC.
Hình 2.1. Chương trình PCR Thành phần phản ứng PCR như sau: dH2O 31l pfu Buffer 5l MgCl2 4l dNTP 5l
Mồi 5’-NdeI-higf1 0,5l Mồi 3’-BamHI-higf1 0,5l
phIGF1 2l
pfu DNA polymerase 0,5l
Tổng thể tích 50 l
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được tinh chế qua cột silica-gel để loại bỏ các thành phần phản ứng PCR và chỉ thu nhận DNA mục tiêu để đảm bảo độ tinh sạch cho các thao tác sau.
2.2.2. Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b
a. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit EZ-10 spin column DNA
Nhằm loại bỏ các thành phần không mong muốn và chỉ thu nhận DNA mục tiêu chúng tôi tiến hành tinh chế thu nhận DNA bằng cột silica gel. Các phân tử DNA với sự hiện diện của nồng độ muối cao sẽ gắn chặt lên các hạt silica gel trong khi đó các thành phần tạp khác không gắn lên được. Thu nhận DNA sau tinh sạch bằng cách sử dụng các dung dịch lực ion thấp như miliQ hay TE để dung ly DNA ra khỏi cột.
Cách tiến hành
- Thêm dung dịch binding vào sản phẩm PCR với tỉ lệ 3:1, huyền phù đều. - Chuyển hỗn hợp vào cột, để yên 2 phút. Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 1 phút, hút phần nước qua cột chuyển vào cột và thực hiện thêm một lần nữa. Sau đó loại bỏ phần nước qua cột này.
- Thêm 500l dung dịch rửa vào cột, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ phần nước rửa qua cột, thực hiện thêm một lần rửa nữa rồi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để đảm bảo đã loại hết dung dịch rửa.
- Thêm 30-50l dung dịch dung ly hay miliQ vào chính giữa cột, để yên khoảng 2 phút rồi ly tâm 10.000 vòng/phút. Thực hiện ly tâm thêm lần nữa để đạt hiệu suất thu hồi tốt. Mẫu sau khi tinh chế sẽ được bảo quản ở -20oC.
b. Thu nhận plasmid pET-22b bằng phƣơng pháp SDS-kiềm
Plasmid pET22b là plasmid sử dụng để biểu hiện gene mục tiêu trong tế bào
E. coli dựa trên lac operon và T7 promoter. Đây là plasmid thương mại được cung cấp bởi hãng Novagen (Đức). Plasmid được lưu trữ trong dòng tế bào E. coli
DH5α/pET-22b. Để thu nhận plamid pET-22b cho các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành thu nhận bằng phương pháp SDS-kiềm.
Trong phương pháp tách chiết plasmid bằng tác nhân kiềm SDS, màng tế bào bị phá vỡ đầu tiên bởi các tác nhân phá màng. Sau khi màng bị phá vỡ, dưới tác dụng của SDS, protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ đó DNA sẽ được bảo vệ khỏi sự tấn công của DNase. Mặt khác sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm DNA bao gồm cả DNA plasmid bị biến
tính. Ngay sau đó trung hòa nhanh dung dịch. Thao tác này có tác dụng phục hồi nhanh cấu trúc DNA. DNA bộ gen có kích thước lớn, cồng kềnh nên khó phục hồi hơn so với DNA plasmid. Do đó, DNA plasmid sẽ dễ dàng phục hồi cấu trúc và nằm trong phần dịch nổi sau khi li tâm. Ngược lại, protein của tế bào và DNA bộ gene sẽ bị tủa xuống. Sau đó DNA plasmid sẽ được tủa dưới tác dụng của isopropanol hay ethanol tuyệt đối và tủa được hòa lại trong dung dịch TE hay miliQ để cất giữ. Quy trình tách chiết được tiến hành theo quy trình chuẩn của Bộ môn CNSH Phân tử & Môi trường.
Cách tiến hành
- Cấy một khuẩn lạc đơn E. coli DH5α/pET-22b được chọn lọc từ các bước trước vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB đã bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 100g/ml, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút ở 37oC qua đêm.
- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút thu sinh khối vào 2 eppendorf 1,5ml, rửa sinh khối với 1 ml nước cất, và ly tâm thu lại sinh khối.
- Thêm 100l dung dịch I, vortex kỹ. Cho tiếp 200l dung dịch II vào và đảo nhẹ vài lần, rồi thêm tiếp 150l dung dịch III vào, đảo nhẹ và ủ ở tủ âm trong 15 phút.
- Ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút, thu phần dịch nổi. Bổ sung 10 l Rnase và ủ 37oC trong khoảng 1 giờ.
- Thêm 500l phenol pH 8 vào và đảo nhẹ vài lần, ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, thu lớp phía trên.
- Cho tiếp 500l chloroform rồi đảo nhẹ vài lần, ly tâm 13.000 vòng/phút ở