Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b

a. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit EZ-10 spin column DNA

Nhằm loại bỏ các thành phần không mong muốn và chỉ thu nhận DNA mục tiêu chúng tôi tiến hành tinh chế thu nhận DNA bằng cột silica gel. Các phân tử DNA với sự hiện diện của nồng độ muối cao sẽ gắn chặt lên các hạt silica gel trong khi đó các thành phần tạp khác không gắn lên được. Thu nhận DNA sau tinh sạch bằng cách sử dụng các dung dịch lực ion thấp như miliQ hay TE để dung ly DNA ra khỏi cột.

Cách tiến hành

- Thêm dung dịch binding vào sản phẩm PCR với tỉ lệ 3:1, huyền phù đều. - Chuyển hỗn hợp vào cột, để yên 2 phút. Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 1 phút, hút phần nước qua cột chuyển vào cột và thực hiện thêm một lần nữa. Sau đó loại bỏ phần nước qua cột này.

- Thêm 500l dung dịch rửa vào cột, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ phần nước rửa qua cột, thực hiện thêm một lần rửa nữa rồi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để đảm bảo đã loại hết dung dịch rửa.

- Thêm 30-50l dung dịch dung ly hay miliQ vào chính giữa cột, để yên khoảng 2 phút rồi ly tâm 10.000 vòng/phút. Thực hiện ly tâm thêm lần nữa để đạt hiệu suất thu hồi tốt. Mẫu sau khi tinh chế sẽ được bảo quản ở -20oC.

b. Thu nhận plasmid pET-22b bằng phƣơng pháp SDS-kiềm

Plasmid pET22b là plasmid sử dụng để biểu hiện gene mục tiêu trong tế bào

E. coli dựa trên lac operon và T7 promoter. Đây là plasmid thương mại được cung cấp bởi hãng Novagen (Đức). Plasmid được lưu trữ trong dòng tế bào E. coli

DH5α/pET-22b. Để thu nhận plamid pET-22b cho các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành thu nhận bằng phương pháp SDS-kiềm.

Trong phương pháp tách chiết plasmid bằng tác nhân kiềm SDS, màng tế bào bị phá vỡ đầu tiên bởi các tác nhân phá màng. Sau khi màng bị phá vỡ, dưới tác dụng của SDS, protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ đó DNA sẽ được bảo vệ khỏi sự tấn công của DNase. Mặt khác sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm DNA bao gồm cả DNA plasmid bị biến

tính. Ngay sau đó trung hòa nhanh dung dịch. Thao tác này có tác dụng phục hồi nhanh cấu trúc DNA. DNA bộ gen có kích thước lớn, cồng kềnh nên khó phục hồi hơn so với DNA plasmid. Do đó, DNA plasmid sẽ dễ dàng phục hồi cấu trúc và nằm trong phần dịch nổi sau khi li tâm. Ngược lại, protein của tế bào và DNA bộ gene sẽ bị tủa xuống. Sau đó DNA plasmid sẽ được tủa dưới tác dụng của isopropanol hay ethanol tuyệt đối và tủa được hòa lại trong dung dịch TE hay miliQ để cất giữ. Quy trình tách chiết được tiến hành theo quy trình chuẩn của Bộ môn CNSH Phân tử & Môi trường.

Cách tiến hành

- Cấy một khuẩn lạc đơn E. coli DH5α/pET-22b được chọn lọc từ các bước trước vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB đã bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 100g/ml, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút ở 37oC qua đêm.

- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút thu sinh khối vào 2 eppendorf 1,5ml, rửa sinh khối với 1 ml nước cất, và ly tâm thu lại sinh khối.

- Thêm 100l dung dịch I, vortex kỹ. Cho tiếp 200l dung dịch II vào và đảo nhẹ vài lần, rồi thêm tiếp 150l dung dịch III vào, đảo nhẹ và ủ ở tủ âm trong 15 phút.

- Ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút, thu phần dịch nổi. Bổ sung 10 l Rnase và ủ 37oC trong khoảng 1 giờ.

- Thêm 500l phenol pH 8 vào và đảo nhẹ vài lần, ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, thu lớp phía trên.

- Cho tiếp 500l chloroform rồi đảo nhẹ vài lần, ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, thu lớp phía trên.

- Bổ sung 40l muối NaOAC pH 5,2 và 1 ml ethanol tuyệt đối, ủ ở tủ âm khoảng 30 phút rồi ly tâm 13.000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút, thu tủa.

- Thêm 500l ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút, đổ bỏ phần nước, giữ tủa. Để eppendorf trên giấy thấm để làm khô tủa.

- Khi tủa khô và sạch nước thì thêm 20l dung dịch TE 1X hay miliQ để hoà tủa và cất giữ ở -20oC.

- Plasmid thu nhận được xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nanodrop®.

c. Xử lí plasmid pET-22b và gene higf-1 với NdeI và BamHI

Với mục tiêu nối gene higf-1 vào plasmid pET22b. Chúng tôi tiến hành cắt gene higf-1 và plasmid pET22b bằng cặp enzyme cắt giới hạn NdeI và BamHI nhằm tạo gene và plasmid có đầu dính của hai loại enzyme này. Thành phần cũng như điều kiện phản ứng cắt được tiến hành theo khuyến các của nhà sản xuất.

Thành phần phản ứng cắt gene higf-1 như sau:

dH2O 6l Buffer Tango 10X 4l Sản phẩm PCR 8l NdeI 1l BamHI 1l Tổng thể tích 20l

Hỗn hợp phản ứng cắt được ủ 37oC trong 4 giờ. Sau đó tinh chế sản phẩm cắt bằng bộ kit bộ kit EZ-10 spin column DNA.

Thành phần phản ứng cắt plasmid pET-22b như sau:

dH2O 6l Buffer Tango 10X 4l Plasmid pET-22b 8l NdeI 1l BamHI 1l Tổng thể tích 20l

Hỗn hợp phản ứng cắt được ủ ở 37oC, 4 giờ. Sau đó tinh chế sản phẩm cắt bằng bộ kit bộ kit EZ-10 spin column DNA.

d. Tạo vector tái tổ hợp pET22b-higf1

Gene higf-1 và plasmid pET-22b sau khi cắt tạo đầu dính của hai enzyme NdeI và BamHI sẽ được nối lại với nhau bằng phản ứng nối được xúc tác bởi enzyme T4 DNA ligase với tổng thể tích là 15l. Các plasmid tái tổ hợp thành công được đặt

tên là pET22b-higf1. Thành phần phản ứng nối và điều kiện phản ứng được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất như sau:

Buffer T4 ligase 1,5l Plamid pET-22b/NdeI & BamHI 2,5l Gene higf-1/NdeI & BamHI 10,0l

T4 DNA ligase 1l

Tổng thể tích 15l

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 4 giờ.