a. Thu nhận và hòa tan thể vùi hIGF-1
Để thu nhận lượng lớn thể vùi phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, tiến hành biểu hiện protein mục tiêu ở dung tích lớn. Đối với lượng lớn sinh khối thu được, việc sử dụng sóng siêu âm để thu nhận thể vùi là không khả thi. Do đó, người ta thường phá tế bào bằng áp suất. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc, các tế bào sẽ di chuyển trong các đường ống có tiết diện nhỏ, dưới tác dụng của áp suất cao, các tế bào bị vỡ ra. Thu nhận thể vùi sau khi phá tế bào bằng ly tâm. Thể vùi tươi cần được xử lý rửa để loại bỏ các thành phần tạp của tế bào chủ lẫn với thể vùi như DNA bộ gene, phospholipid, các protein gắn màng, các protein khó tan của tế bào chủ. Thể vùi sau khi rửa được hòa tan bằng dung dịch hòa tan thể vùi để làm nguyên liệu cho quá trình tái gấp cuộn.
- Tiến hành cấy chủng E. coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 và biểu hiện protein mục tiêu như điều kiện ở mục a phần 2.2.5 với thể tích nuôi cấy là 1lít.
- Ly tâm thu nhận sinh khối và hòa sinh khối bằng dung dịch ly giải.
- Phá tế bào bằng máy áp suất Microfluidizer Processor M-110EH (Hoa Kỳ). - Ly tâm thu nhận thể vùi sau đó rửa thể vùi lần lượt bằng dung dịch Wash I, Wash II và Wash III.
- Thể vùi sau khi rửa được hòa tan bằng dung dịch hòa tan thể vùi với tỉ lệ 10mg/ml.
- Ly tâm 13000 vòng/phút 4oC trong 30 phút và thu nhận dịch nổi.
b. Tái gấp cuộn protein hIGF-1
Thể vùi sau khi hòa tan được pha loãng sang dung dịch tái gấp cuộn để đưa hIGF-1 về dạng cấu hình đúng. Dung dịch tái gấp cuộn có chứa các tác nhân biến tính ở nồng độ thấp như urea 2M để ngăn cản quá trình kết cụm của hIGF-1, hệ đệm pH để duy trì pH tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn, cặp oxy hóa-khử để tạo cầu nối disulfide. Cầu nối disulfide được tạo thành chủ yếu ở pH kiềm và nhiệt độ thấp cho hiệu quả tái gấp cuộn cao hơn.
- Pha loãng dịch hòa tan thể vùi sang dung dịch tái gấp cuộn với tỉ lệ 1:10 (v/v).
- Chỉnh pH lên 10,5 bằng NaOH 5N. - Khuấy nhẹ ở 25oC trong vòng 24 giờ. - Chỉnh pH về 4,0 bằng acid acetic.
- Giữ ổn định ở 4oC trong khoảng 4-6 giờ.
c. Tinh chế thu nhận hIGF-1
Dung dịch protein hIGF-1 sau tái gấp cuộn được tinh chế bằng phương pháp sắc ký trao đổi cation trên hệ thống sắc ký AKTA Explorer (GE Healthcare) với cột sắc ký Hitrap SP FF 5ml (GE Healthcare). Quá trình tinh chế được tiến hành như sau:
- Cân bằng cột bằng dung dịch NaOAc 25 mM pH 4,0. - Nạp mẫu vào hệ thống.
- Rửa các thành phần gắn không đặc hiệu bằng dung dịch NaOAc 25 mM pH 4,0.
- Dung ly lần lượt bằng dung dịch NaCl 500 mM pH 4,0, NaCl 1M pH 4,0 và NH4OAc 100mM pH 7,0.
- Thu nhận và kiểm tra các phân đoạn protein bằng điện di Tricine SDS-PAGE và định lượng bằng phương pháp Bradford.
2.2.7. Kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 thu nhận đƣợc
Hoạt tính sinh học của hIGF-1 thu nhận sau quá trình tinh chế có thể được đánh giá thông qua thử nghiệm in vitro sử dụng dòng tế bào MCF-7. Dòng tế bào này có nhiều thụ thể hIGF-1 trên bề mặt. Khi có sự hiện diện của hIGF-1 có hoạt tính trong môi trường nuôi cấy, hIGF-1 sẽ gắn lên các thụ thể và kích thích sự tăng sinh các tế bào này. Do đó, dựa vào số lượng tế bào MCF-7 tăng sinh trong môi trường nuôi cấy ở mẫu bổ sung hIGF-1 và mẫu tế bào không bổ sung hIGF-1, ta có thể xác định mẫu hIGF-1 tinh chế được có hoạt tính sinh học hay không.
- Tế bào MCF-7 được kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược. Chọn tế bào thử nghiệm ở trạng thái đang tăng sinh tốt, trong môi trường nuôi cấy có ít hoặc không có tế bào nổi, tế bào bám đạt 80-90% bề mặt đĩa. Đổ bỏ môi trường nuôi cấy.
- Bổ sung 1ml dung dịch 0,25% Trypsin-0,53mM EDTA, ủ tế bào ở 37oC, CO2 5%, 5 phút.
- Bổ sung 1ml môi trường DMEM/F12 + 0,5% FBS vào và huyền phù nhẹ. - Ly tâm 1300 vòng/phút, trong 5 phút. Thu sinh khối tế bào.
- Hòa tế bào bằng 1ml môi trường DMEM/F12 + 0,5% FBS.
- Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu sau khi nhuộm Trypan Blue.
- Bổ sung môi trường DMEM/F12 + 0,5% FBS để mật độ tế bào đạt 105 tế bào/ml.
- Bổ sung dịch tế bào vào 6 giếng trên đĩa 96 giếng, mỗi giếng 50µl.
- Bổ sung 50µl mẫu hIGF-1 đã được pha loãng bằng PBS vào 3 giếng, 3 giếng còn lại chỉ bổ sung PBS để làm chứng âm.
- Ủ đĩa trong tủ ấm 370C, CO2 5% trong 72 giờ.
- Bổ sung cell counting kit 8 tỉ lệ 1/10 (v/v) vào mỗi giếng, ủ đĩa trong tủ ấm 370C, CO2 5% trong 3 giờ.
PHẦN III
3.1.Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b
Để tạo dòng vector biểu hiện gene higf-1 trong E. coli chúng tôi sử dụng vector biểu hiện pET-22b làm vector khung và tiến hành thực nghiệm theo quy trình sau:
3.1.1.Thu nhận gene higf-1 và chuẩn bị vector pET-22b
Để dòng hóa gene mã hóa cho protein hIGF-1 vào plasmid pET-22b, trước tiên chúng tôi tiến hành thu nhận gene mục tiêu bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene là 5’-NdeI-higf1 và 3’-BamHI-higf1. Phản ứng PCR được thực hiện trên khuôn mẫu là plasmid phIGF-1, đây là plasmid mang gene higf-1 được thiết kế tối ưu cho việc biểu hiện trong E. coli và đặt tổng hợp từ công ty IDT (Integrated DNA Technologies), Hoa Kỳ. Sản phẩm PCR được điện di phân tích trên gel agarose 1%, kết quả thực nghiệm được trình bày trong Hình 3.2.
Hình 3.2. Thu nhận gene higf-1. 1: Sản phẩm PCR thu nhận gene higf-1; 2: Thang chuẩn DNA 1 kb plus.
Kết quả điện di cho thấy giếng 1 chỉ có một vạch duy nhất có kích thước tương ứng với kích thước của gene higf-1, 233bp. Như vậy, cùng với các kết quả phân tích và thiết kế mồi đặc hiệu cho gene higf-1, chúng tôi có thể khẳng định đã thu nhận được gene higf-1. Gene này sẽ được kiểm chứng về trình tự trong các thí nghiệm sau.
Gene higf-1 thu nhận bằng phản ứng PCR được tinh chế qua cột silica-gel rồi xử lý với hai enzyme cắt giới hạn BamHI và NdeI nhằm thu nhận gene higf-1 có hai đầu dính của hai enzyme này. Sản phẩm cắt giới hạn gene higf-1 được tinh sạch qua cột silica-gel để chuẩn bị cho phản ứng nối vào vector mang gene.
Song song với việc thu nhận gene mục tiêu, chúng tôi cũng tiến hành thu nhận và chuẩn bị vector mang gene (pET-22b). Plasmid pET-22b được tách chiết bằng phương pháp SDS-kiềm từ chủng E. coli DH5α/pET-22b. Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid sau khi tách chiết được xác định bằng máy đo Nanodrop®. Kết quả được trình bày trên Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pET-22b
Chỉ số Kết quả
OD260/OD280 1,95
Nồng độ (ng/µl) 4337
Plasmid pET-22b thu nhận được có nồng độ khá cao và độ tinh sạch nằm trong khoảng cho phép (1,8 < OD260/OD280 < 2,0). Plasmid này sau đó được cắt mở vòng bằng cặp enzyme BamHI và NdeI. Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột silica- gel và được sử dụng để thực hiện phản ứng nối đầu dính tạo vector tái tổ hợp.
3.1.2. Tạo dòng E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1
a. Nối gene higf-1 vào vector pET-22b và sàng lọc vector tái tổ hợp trong E. coli.
Plasmid vector sau khi được cắt mở vòng bằng hai enzyme cắt giới hạn có đầu dính tương ứng với đầu dính đã thiết kế và tạo trên gene mục tiêu. Do vậy trong phản ứng nối, dưới xúc tác của enzyme T4 DNA ligase, các đầu dính tương ứng sẽ nối với nhau cho sản phẩm vector tái tổ hợp mang gene mục tiêu. Các vector tái tổ hợp mang gene mục tiêu được khuếch đại trong tế bào chủ E. coli và được sàng lọc bằng gene chỉ thị trên vector. Do vector được sử dụng là vector pET-22b mang gene chỉ thị là gene kháng kháng sinh ampicillin, nên các vector tái tổ hợp sẽ mang gene kháng kháng sinh ampicillin cho phép tế bào chủ E. coli mang vector này có khả
năng sống trong môi trường có ampicillin. Với cơ sở lý luận như đã trình bày chúng tôi tiến hành biến nạp sản phẩm nối vector và gene mục tiêu vào tế bào chủ E. coli
DH5α.
Tế bào E. coli DH5α sau khi biến nạp được trải trên môi trường LB-Amp- Agar. Thí nghiệm được tiến hành song song với mẫu đối chứng là tế bào E. coli
DH5α khả nạp không bổ sung sản phẩm nối. Kết quả thực nghiệm được trình bày trong Hình 3.3.
Hình 3.3.Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α. A-Đối chứng, B-Kết quả biến nạp sản phẩm nối.
Kết quả biến nạp cho thấy ở đĩa đối chứng (đĩa A) là các tế bào E. coli DH5α không được bổ sung vector có mang gene kháng ampicillin nên các tế bào này không có khả năng kháng kháng sinh ampicillin, do đó không có khuẩn lạc nào mọc trên đĩa môi trường chứa ampicillin. Ở đĩa biến nạp sản phẩm nối (đĩa B) có xuất hiện các khuẩn lạc E. coli. Điều này chứng tỏ đã có tế bào E. coli DH5α tiếp nhận được vector mang gene kháng kháng sinh sau quá trình biến nạp hoặc các tế bào E. coli DH5α này bị đột biến tạo khả năng kháng ampicillin (điều này rất hiếm). Các tế bào E. coli từ các khuẩn lạc kháng kháng sinh ampicillin được thu nhận và kiểm tra trong các thí nghiệm tiếp theo nhằm thu nhận dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp mong muốn.
b. Kiểm tra sự hiện diện của gene mục tiêu higf-1 trong các thể biến nạp
Các khuẩn lạc E. coli mọc được trên đĩa biến nạp được thu nhận và sử dụng trong hai thí nghiệm được thực hiện song song:
- Cấy chuyền trên môi trường LB-Amp-Agar.
- Huyền phù vào các eppendorf 0,2ml được đánh dấu sẵn có chứa các thành phần của phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho gene higf-1.
Những khuẩn lạc cho kết quả PCR chỉ một vạch có kích thước bằng kích thước gene higf-1 được ghi nhận và truy xuất mẫu khuẩn lạc tương ứng để nuôi cấy trên môi trường LB-Amp sau đó tách chiết plasmid. Các plasmid thu được từ thể biến nạp nói trên được kiểm chứng sự hiện diện của gene mục tiêu bằng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu cho gene, đồng thời tiến hành phản ứng cắt giới hạn bằng cặp enzyme NdeI và BamHI. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gene mục tiêu trong thể biến nạp E. coli và trên plasmid được trình bày trên Hình 3.4.
Hình 3.4.Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1. 1-Thang DNA 1kb plus, 2-Sản phẩm PCR thu nhận gene higf-1 từ plasmid pIGF1, 3-Sản phẩm PCR khuẩn lạc DH5α/pET22b-higf1, 4-Plasmid pET22b-higf1, 5-Plasmid pET22b/NdeI
và BamHI, 6-Plasmid pET22b-higf1/NdeI và BamHI, 7-Sản phẩm PCR plasmid pET22b-higf1, 8-Sản phẩm PCR plasmid pET-22b (chứng âm)
gene higf-1 (Hình 3.4, giếng 2). Kết quả PCR trên khuôn là plasmid thu được, với cặp mồi đặc hiệu cho gene higf-1 cũng cho kết quả một vạch (Hình 3.4, giếng 7)
tương ứng kích thước của gene higf-1 (Hình 3.4, giếng 2). Khi được cắt mở vòng bằng cặp enzyme NdeI và BamHI (Hình 3.4, giếng 6), plasmid tái tổ hợp pET22b-
higf1 cho một vạch có kích thước khoảng 5400 bp tương ứng với plasmid pET-22b được cắt mở vòng bằng NdeI và BamHI (Hình 3.4, giếng 5) và một vạch có kích thước 225 bp tương ứng với gene higf-1.
Như vậy chúng tôi có thể khẳng định các thể biến nạp chọn được có mang gene higf-1 và gene này cũng hiện diện trong plasmid thu được từ thể biến nạp nói trên.
c. Kiểm tra chiều gene mục tiêu trong vector tái tổ hợp
Sau kết quả thí nghiệm kiểm tra sự hiện diện của gene mục tiêu trong vector thu nhận được từ thể biến nạp, chúng tôi tiếp tục sử dụng các vector plasmid này trong các thí nghiệm nhằm kiểm tra chiều của gene mục tiêu trên plasmid. Với mục tiêu tạo dòng và biểu hiện gene higf-1 trong E. coli, do đó việc chèn gene higf-1
đúng chiều phiên mã có ý nghĩa quyết định đến kết quả của đề tài.
Hình 3.5.Sơ đồ vị trí chèn gene higf-1 và vị trí bắt cặp của các mồi trên vector pET22b-higf1. A-Gene higf-1 chèn đúng chiều, B-Gene higf-1 chèn ngược chiều.
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng tương quan vị trí giữa các mồi trên vector tái tổ hợp pET22b-higf1 giả định để kiểm tra chiều của gene higf-1 trên vector tái tổ hợp thu nhận được. Trong đó mồi T7 pro/T7 ter được sử dụng là mồi bắt cặp trên vùng T7 promoter và T7 terminator của vector. Khoảng cách của hai
mồi này trên vector pET-22b là khoảng 309bp. Nếu gene higf-1 được chèn vào vector khoảng cách này sẽ là 443bp.
Bên cạnh đó, mồi 5’-NdeI-higf1 bắt trên vùng khởi đầu của khung đọc mở (ORF) của gene higf-1. Do vậy, vị trí mồi 5’-NdeI-higf1 phải tương quan cùng chiều với promoter T7 nếu gene higf-1 được chèn đúng chiều phiên mã. Và như thế, gene higf-1 sẽ chèn đúng chiều khi phản ứng PCR với cặp mồi 5’-NdeI-higf1/T7 ter cho sản phẩm là một đoạn gene có chiều dài bằng chiều dài khoảng 355bp (Hình 3.5.A). Phản ứng PCR này sẽ không cho sản phẩm khuếch đại khi gene được chèn ngược chiều vì lúc này mồi 5’-NdeI-higf1 cùng chiều với mồi T7 ter (Hình 3.5.B).
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra plasmid pET22b-higf1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7 pro/T7 ter và cặp mồi 5’-NdeI-higf1 /T7 ter. 1-Thang DNA 1kb plus, 2-Gene
higf-1, 3-Sản phẩm PCR pET22b với cặp mồi T7 pro/ T7 ter, 4-Sản phẩm PCR pET22b-higf1 với cặp mồi T7 pro/T7 ter, 5-Sản phẩm PCR pET22b-higf1 với cặp
mồi 5’-NdeI-higf1/ T7 ter
Kết quả kiểm tra được trình bày trên Hình 3.6 cho thấy PCR plasmid pET22b-
higf-1. Vì nếu không mang gene higf-1 thì kết quả PCR sẽ chỉ cho một vạch có kích thước khoảng 309bp (là đoạn DNA từ vùng thượng lưu đến vùng hạ lưu của vùng MCS trên plasmid pET-22b) (Hình 3.6, giếng 3). Kết quả PCR plasmid pET22b-
higf1 với cặp mồi 5’-NdeI-higf1/T7 ter cho kích thước khoảng 355bp (Hình 3.6, giếng 5) tương ứng với kích thước của gene higf-1 cộng với kích thước đoạn DNA ở vùng hạ lưu của vùng MCS. Như vậy chúng tôi đã thu được vector tái tổ hợp mang gene mục tiêu higf-1 được gắn đúng chiều phiên mã. Plasmid tái tổ hợp này được đặt tên là pET22b-higf1.
d. Kiểm tra trình tự gene higf-1 trên plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1
Nhằm khẳng định độ chính xác về trình tự so với thiết kế ban đầu cũng như sự đồng khung dịch mã đối với promoter trên plasmid. Plasmid tái tổ hợp pET22b-
higf1 thu nhận sau quá trình kiểm tra được tiến hành giải trình tự theo phương pháp Sanger cải tiến trên máy Big DyeTM terminator bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được đem so sánh với đoạn gene higf-1 đã được thiết kế dựa