Chúng tôi tiến hành nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 ở thể tích lớn hơn. Lượng sinh khối tươi chủng E. coli Origami (DE3)/pET22b-higf1 thu nhận
được từ 1l môi trường LB là 4,52 g. Hòa sinh khối bằng dung dịch ly giải sau đó tiến hành phá tế bào bằng máy phá tế bào áp suất. Thể vùi thu nhận được sau quá trình ly tâm được rửa lần lượt bằng dung dịch wash I, wash II và wash III để loại bỏ các thành phần tạp của tế bào E. coli. Thể vùi được hòa tan bằng dung dịch hòa tan và pha loãng bằng dung dịch tái gấp cuộn, tái gấp cuộn trong điều kiện khuấy nhẹ trong vòng 24 giờ ở 25oC. Sau đó, dung dịch tái gấp cuộn được chỉnh pH về 4,0 bằng acetic acid và để ổn định ở 4oC trong vòng 4-6 giờ rồi tiến hành tinh chế thu nhận hIGF-1 bằng sắc ký trao đổi cation.
Tiến hành tinh chế protein hIGF-1 trên hệ thống FPLC (AKTA explorer) sử dụng cột sắc ký trao đổi cation SPFF 5ml (Amersham Bioscience). Cân bằng cột bằng dung dịch NaOAc 25mM pH 4,0, thể tích nạp mẫu là 100ml với tốc độ nạp mẫu là 4ml/phút. Protein hIGF-1 được dung ly bằng NaCl lần lượt ở các nồng độ 500mM, 1M ở pH 4,0 và bằng dung dịch NH4OAc 100mM pH 7,0. Sắc ký đồ được thể hiện trên Hình 3.11.
Hình 3.11. Sắc ký đồ tinh chế thu nhận hIGF-1 bằng sắc ký trao đổi cation
Dựa vào sắc ký đồ cho thấy dung ly bằng NaCl pH 4,0 lần lượt ở các nồng độ 500mM và 1M đều không dung ly được protein mục tiêu ra khỏi cột. Điều đó chứng tỏ hIGF-1 bám rất chặt trên cột SP ở pH 4,0 và sử dụng lực ion để dung ly là không hiệu quả trong trường hợp này. Mặc khác khi dung ly bằng NH4OAc 100mM pH 7,0 lại cho một peak với cường độ tín hiệu thu nhận được là 120mAU và thể tích mẫu thu được là 14,5ml với nồng độ protein đo được bằng phương pháp
Bradford là 0,065mg/ml. Để kiểm tra độ tinh sạch của protein thu nhận được ở bước dung ly, chúng tôi tiến hành điện di Tricine SDS-PAGE các phân đoạn protein thu nhận được từ quá trình tinh chế. Kết quả các phân đoạn phân tích bằng Tricine SDS-PAGE được trình bày trên Hình 3.12.
Hình 3.12. Kết quả phân tích Tricine SDS-PAGE các phân đoạn protein thu nhận từ quá trình tinh chế sắc ký trao đổi cation. 1-Thang LMW, 2-Dịch tái gấp cuộn, 3-Dịch tái gấp cuộn sau khi qua cột SPFF, 4-Dung ly bằng NH4OAc 100mM
pH 7,0.
Kết quả Tricine SDS-PAGE cho thấy ở giếng 3 là phân đoạn dịch tái gấp cuộn sau khi qua cột xuất hiện vạch protein mục tiêu rất nhạt điều đó chứng tỏ hIGF-1 đã gắn được lên cột SP và lượng thất thoát sau khi qua cột thấp. Kết quả Tricine SDS-PAGE phân đoạn dung ly bằng NH4OAc 100mM pH 7,0 giếng 4 cho thấy có vạch protein mục tiêu với độ tinh sạch khá cao. Điều này chứng tỏ, hIGF-1 được dung ly tốt với điều kiện tăng lực ion và kết hợp với tăng pH. Tuy nhiên phân đoạn dung ly này vẫn còn lẫn vết của một vài protein tạp khác. Do đó để thu được hIGF-1 độ tinh sạch cao cần phải tiến hành tinh chế thêm những bước tinh chế khác để đạt được độ tinh sạch cao hơn.
Bảng 3.2. Lượng hIGF-1 trong các phân đoạn tinh chế Mẫu Thể tích (ml) Nồng độ protein (mg/ml) Tổng protein (mg) Độ tinh sạch (%) Lƣợng hIGF-1 (mg) Trƣớc tinh chế 100 0,061 6,1 33,0 2,013 Mẫu dung ly 14,5 0,065 2,61 81,7 0,77
Độ tinh sạch của mẫu protein sau tinh chế được đánh giá sơ bộ bằng cách tính phần trăm protein hIGF-1 có trong mẫu sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ) dựa trên kết quả điện di Tricine SDS-PAGE. Kết quả phân tích được trình bày trên Hình 3.13. Kết quả định lượng cho thấy, lượng protein hIGF-1 trước khi qua cột là 2,013 mg và lượng protein hIGF-1 sau tinh chế là 0,77 mg. Do đó hiệu suất thu hồi của quá trình tinh chế là 38,25%.
Hình 3.13.Kết quả phân tích độ tinh sạch của mẫu trước và sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ)
Mẫu protein sau tinh chế được tiến hành kiểm tra hoạt tính sinh học bằng phương pháp thử hoạt tính in vitro trên dòng tế bào MCF-7. Tế bào MCF-7 với hình thái tốt, phát triển đều và độ bao phủ khoảng 80% bề mặt đĩa và ít tế bào nổi được sử dụng để kiểm tra hoạt tính hIGF-1. Tế bào được nuôi cấy trên môi trường
1 tinh chế được pha loãng trong PBS và mẫu tế bào chỉ bổ sung PBS để làm đối chứng âm. Ủ tế bào ở điều kiện 37oC 5% CO2 trong vòng 3 ngày sau đó bổ sung dịch Cell counting kit tỉ lệ 1:10 (v/v) vào các giếng trên đĩa thí nghiệm và ủ tiếp ở 37oC 5% CO2 trong vòng 5 giờ. Quan sát sự đổi màu dịch tế bào trong các giếng và đo mật độ quang ở bước sóng 450nm bằng máy Multiskan Ascent.
Kết quả sau 3 ngày nuôi cấy, các tế bào ở mẫu có bổ sung hIGF-1 sau tinh chế có khả năng kích thích các tế bào MCF-7 tăng sinh, trong khi đó mẫu tế bào MCF-7 chỉ bổ sung PBS không có khả năng tăng sinh. Sau khi ủ với cell counting kit, kết quả so màu ở bước sóng 450nm cũng cho kết quả lần lượt đối với mẫu bổ sung hIGF-1 là 0,423 và mẫu đối chứng không bổ sung hIGF-1 là 0,221 (Hình 3.14). Do đó có thể khẳng định mẫu hIGF-1 thu nhận được từ quá tinh chế có khả năng kích thích tăng sinh dòng tế bào MCF-7. Tuy nhiên hoạt tính kích thích tăng sinh lại chưa cao. Nguyên nhân có thể là do quá trình tái gấp cuộn chưa hiệu quả và quá trình thử nghiệm hoạt tính trên dòng tế bào MCF-7 chưa tối ưu.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của hIGF-1 sau tinh chế lên khả năng tăng sinh của dòng tế bào MCF-7
PHẦN IV