Thu nhận gene higf-1 từ phIGF1 bằng phản ứng PCR

Plasmid phIGF-1 là plasmid có mang gene higf-1 mã hóa cho protein hIGF-1 được đặt tổng hợp theo thiết kế của Bộ môn CNSH Phân tử & Môi trường tại công ty IDT (Hoa Kỳ). Gene higf-1 được thu nhận với lượng lớn nhờ phản ứng PCR dùng cặp mồi 5’-NdeI-higf1 và 3’-BamHI-higf1 đặc hiệu cho gene có hai đầu là vị trí nhận biết của hai enzyme cắt đầu dính (đầu 5’-NdeI và 3’-BamHI) nhằm phục vụ cho công đoạn tạo dòng vào plasmid pET-22b.

PCR là kỹ thuật in vitro dùng để khuếch đại một trình tự DNA dựa trên phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase. Quá trình tổng hợp về cơ bản cũng giống với quá trình sao chép DNA trong tế bào khi được cung cấp đủ DNA khuôn mẫu, mồi, DNA polymerase, dNTP và dung dịch đệm. PCR gồm nhiều chu kì lặp đi lặp lại, mỗi chu kì gồm ba bước:

- Biến tính: tách DNA mạch đôi thành mạch đơn, nhiệt độ khoảng 94-95oC. Tinh chế thu nhận protein hIGF-1 bằng phương pháp sắc ký trao đổi cation trên hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp AKTA FPLC.

Đánh giá sơ bộ hoạt tính sinh học protein hIGF-1 trong mẫu dung ly từ quá trình tinh chế dựa trên khả năng kích thích tăng sinh dòng tế

bào MCF-7.

Thu nhận các phân đoạn tinh chế và phân tích bằng Tricine SDS- PAGE, định lượng protein hIGF-1 trong các phân đoạn tinh chế, đánh

giá hiệu suất thu hồi.

Rửa thể vùi bằng dung dịch wash I, wash II và wash III. Hòa tan thể vùi, pha loãng bằng dung dịch tái gấp cuộn và tái gấp cuộn.

- Bắt cặp: mồi bắt cặp với khuôn mẫu, do đó nhiệt độ này phụ thuộc nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi sử dụng, thường là 40-70oC.

- Kéo dài: DNA polymerase hoạt động gắn các nucleotide lần lượt vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Nhiệt độ kéo dài thường là 72oC.

Chương trình và thành phần phản ứng PCR được xác định dựa trên chương trình PCR chuẩn tuy nhiên có một số điều chỉnh để phù hợp với trình tự cần khuếch đại bao gồm: chiều dài của trình tự cần khuếch đại là 233bp nên thời gian kéo dài được chọn là 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp của mồi được xác định là 51oC dựa trên nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi 5’-NdeI-higf1 53,1oC và 3’-BamHI-higf1 là 54,7oC.

Hình 2.1. Chương trình PCR Thành phần phản ứng PCR như sau: dH2O 31l pfu Buffer 5l MgCl2 4l dNTP 5l

Mồi 5’-NdeI-higf1 0,5l Mồi 3’-BamHI-higf1 0,5l

phIGF1 2l

pfu DNA polymerase 0,5l

Tổng thể tích 50 l

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được tinh chế qua cột silica-gel để loại bỏ các thành phần phản ứng PCR và chỉ thu nhận DNA mục tiêu để đảm bảo độ tinh sạch cho các thao tác sau.