Để dòng hóa gene mã hóa cho protein hIGF-1 vào plasmid pET-22b, trước tiên chúng tôi tiến hành thu nhận gene mục tiêu bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene là 5’-NdeI-higf1 và 3’-BamHI-higf1. Phản ứng PCR được thực hiện trên khuôn mẫu là plasmid phIGF-1, đây là plasmid mang gene higf-1 được thiết kế tối ưu cho việc biểu hiện trong E. coli và đặt tổng hợp từ công ty IDT (Integrated DNA Technologies), Hoa Kỳ. Sản phẩm PCR được điện di phân tích trên gel agarose 1%, kết quả thực nghiệm được trình bày trong Hình 3.2.
Hình 3.2. Thu nhận gene higf-1. 1: Sản phẩm PCR thu nhận gene higf-1; 2: Thang chuẩn DNA 1 kb plus.
Kết quả điện di cho thấy giếng 1 chỉ có một vạch duy nhất có kích thước tương ứng với kích thước của gene higf-1, 233bp. Như vậy, cùng với các kết quả phân tích và thiết kế mồi đặc hiệu cho gene higf-1, chúng tôi có thể khẳng định đã thu nhận được gene higf-1. Gene này sẽ được kiểm chứng về trình tự trong các thí nghiệm sau.
Gene higf-1 thu nhận bằng phản ứng PCR được tinh chế qua cột silica-gel rồi xử lý với hai enzyme cắt giới hạn BamHI và NdeI nhằm thu nhận gene higf-1 có hai đầu dính của hai enzyme này. Sản phẩm cắt giới hạn gene higf-1 được tinh sạch qua cột silica-gel để chuẩn bị cho phản ứng nối vào vector mang gene.
Song song với việc thu nhận gene mục tiêu, chúng tôi cũng tiến hành thu nhận và chuẩn bị vector mang gene (pET-22b). Plasmid pET-22b được tách chiết bằng phương pháp SDS-kiềm từ chủng E. coli DH5α/pET-22b. Nồng độ và độ tinh sạch của plasmid sau khi tách chiết được xác định bằng máy đo Nanodrop®. Kết quả được trình bày trên Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pET-22b
Chỉ số Kết quả
OD260/OD280 1,95
Nồng độ (ng/µl) 4337
Plasmid pET-22b thu nhận được có nồng độ khá cao và độ tinh sạch nằm trong khoảng cho phép (1,8 < OD260/OD280 < 2,0). Plasmid này sau đó được cắt mở vòng bằng cặp enzyme BamHI và NdeI. Sản phẩm cắt được tinh sạch qua cột silica- gel và được sử dụng để thực hiện phản ứng nối đầu dính tạo vector tái tổ hợp.