Trong việc nghiên cứu các phân tử có hoạt tính sinh học người ta sử dụng phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro để đánh giá hoạt tính của chúng. Đây là phương pháp hiệu quả để đo đạc mức độ đáp ứng của dòng tế bào chuyên biệt đối với phân tử cần thử nghiệm. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên việc sử dụng dòng tế bào có các receptor đáp ứng hiệu quả với phân tử cần thử nghiệm, từ đó gây ra chuỗi truyền tín hiệu nội bào, kết quả là một số gene quan trọng được hoạt hóa dẫn đến các đáp ứng có thể đo đạc được [27].
Hình 1.5. Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro [27]
Dựa trên cách thức tác động của phân tử cần thử nghiệm đối với tế bào đích, thử nghiệm sinh học in vitro được chia thành 4 nhóm bao gồm: thử nghiệm sinh học đo mức độ tăng sinh hoặc ức chế tăng trưởng của tế bào, thử nghiệm sinh học đánh giá mức gây độc đối với tế bào, thử nghiệm sinh học đánh giá một chức năng đặc biệt nào đó của tế bào chẳng hạn kiểm tra tính xâm lấn của tế bào (invasive), và thử nghiệm sinh học định lượng các sản phẩm được tạo ra bởi tế bào đích dưới tác động của phân tử được thử nghiệm [27].
Trong phương pháp thử nghiệm sinh học tăng sinh tế bào, lượng phân tử thử nghiệm hoạt tính được xác định dựa trên khả năng kích thích tăng sinh dòng tế bào
Tế bào Hoạt hóa
receptor
Tín hiệu nội bào
Gen
biểu hiện Đáp ứng
Tế bào Hoạt hóa
receptor
Tín hiệu nội bào
Gen
đáp ứng chuyên biệt cho phân tử đó. Nồng độ phân tử thử nghiệm tăng sẽ làm tăng mức độ tăng trưởng của tế bào. Cuối quá trình thử nghiệm, số lượng tế bào tăng được ghi nhận bằng các phương pháp đếm tế bào, phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ, phương pháp tạo phức hợp màu bằng các phản ứng với các muối tetrazolium MTT, XTT,…[27]
hIGF-1 có vai trò tăng sinh hầu hết các loại tế bào trong cơ thể nên để kiểm tra hoạt tính sinh học, người ta sử dụng phương pháp thử nghiệm tăng sinh dòng tế bào chuyên biệt đối với hIGF-1. Các dòng tế bào được sử dụng phổ biến là dòng tế bào MCF-7, BALB/3T3, HUVEC
- MCF-7 là dòng tế bào ung thư vú được phân lập vào năm 1970 từ một phụ nữ 69 tuổi bị bệnh ung thư vú ở Hoa Kỳ. Dòng tế bào này có khả năng phân chia vô hạn và được sử dụng để nghiên cứu về các vấn đề liên quan đến bệnh ung thư. MCF-7 được kích thích tăng sinh bởi estrogen và nhiều nhân tố tăng trưởng khác như hIGF-1, bFGF, nhân tố tăng trưởng biểu mô. MCF-7 bị ức chế tăng trưởng khi xử lý với nhân tố TNFα và tiết ra các IGFBPs khi xử lý với các tác nhân ức chế estrogen [14].
- BALB/3T3 là dòng tế bào nguyên bào sợi được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu. Được phân lập lần đầu tiên từ phôi chuột Swiss 14-17 ngày vào năm 1968 tại đại học New York. Tế bào thuộc dòng này có đặc tính kiềm hãm tiếp xúc, tăng trưởng ở mật độ thấp, mật độ bão hòa thấp. Thuật ngữ 3T3 được đặt theo quy trình nuôi cấy dòng tế bào này. Tế bào được cấy chuyền sau mỗi 3 ngày ở mật độ là 3x105tế bào/ml. Dòng tế bào 3T3 thường được sử dụng để nuôi cấy cùng với tế bào keratinocyte vì 3T3 có khả năng tiết ra các nhân tố tăng trưởng giúp kích thích tăng sinh tế bào keratinocyte. Các hợp chất như benzodiazepines làm ức chế khả năng tăng sinh của tế bào 3T3. Dòng tế bào 3T3 được sử dụng để kiểm tra hoạt tính của nhiều nhân tố tăng trưởng và cytokine [24].
- HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) là dòng tế bào nội mô tĩnh mạch được phân lập từ tĩnh mạch rốn ở người bình thường. HUVEC đáp ứng với các kích thích của các cytokine để biểu hiện các phân tử bám dính tế bào. Dòng tế bào này được sử dụng phổ biển cho các nghiên cứu sinh lý và y học, các phân tử vận chuyển, đông tụ huyết và phân giải fibril. Trên bề mặt tế bào HUVEC có biểu
hiện nhiều thụ thể IGF1R do đó, hIGF-1 có khả năng kích thích tăng sinh dòng tế bào này [30].
PHẦN II