nghiên cứu điều kiện biểu hiện protein interleukin 3 người tái tổ hợp dung hợp với pelb trong escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ MAI DUNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN-3 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP DUNG HỢP VỚI PELB TRONG ESCHERICHIA COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ MAI DUNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN-3 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP DUNG HỢP VỚI PELB TRONG ESCHERICHIA COLI CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS TRƯƠNG NAM HẢI TS NGUYỄN HỮU ĐỨC HÀ NỘI, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng học vị nghiên cứu Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Mai Dung Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp cố gắng thân nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, bạn bè người thân Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn GS.TS Trương Nam Hải, Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Hữu Đức, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học động vật – Khoa Công nghệ Sinh học Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực hoàn thành luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Cô Ban Giám đốc Học viện, Ban Quản lý đào tạo Khoa Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi trình học tập thời gian thực luận văn Để thực luận văn này, nhận hướng dẫn kịp thời giúp đỡ quý báu toàn thể cán phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt TS Đỗ Thị Huyền, TS Lê Thị Hồng, NCS Nguyễn Thị Quý nhiệt tình hướng dẫn, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Đề tài thực nhờ nguồn kinh phí đề tài độc lập cấp nhà nước “ Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng y học(điều trị)” giai đoạn 2012-2015 Bộ Khoa học Công nghệ quản lý Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất người thân, bạn bè đồng nghiệp, người bên cạnh động viên giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn vừa qua Chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 06 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Mai Dung Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Biểu protein tái tổ hợp vi khuẩn 1.1.1 Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp 1.1.2 Hệ biểu E coli 1.1.3 Một số chủng biểu gen thông thường E coli 1.1.4 Các vector biểu E coli 1.1.5 Tín hiệu tiết protein 1.2 Tổng quan Interleukin-3 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Đặc điểm, cấu trúc phân tử 10 1.2.3 Vai trò ứng dụng IL–3 11 1.3 Tình hình nghiên cứu Interleukin-3 giới nước 13 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng 16 2.1.1 Vật liệu 16 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Enzyme 16 2.1.4 Các môi trường nuôi cấy dung dịch 16 2.1.5 Máy móc thiết bị 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Tách dòng gen il3 tế bào E coli 19 2.2.2 Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen il3 19 2.2.3 Biểu protein IL-3 tế bào E coli JM109 kiểm tra tính kháng nguyên IL-3 tái tổ hợp 2.2.4 19 Khảo sát điều kiện biểu thích hợp protein IL-3 từ chủng E coli tái tổ hợp quy mô bình tam giác 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli phương pháp sốc nhiệt 19 2.3.2 Tách chiết ADN plasmid từ E coli 20 2.3.3 Điện di ADN gel agarose 21 2.3.4 Kiểm tra gen ADN plasmid enzyme hạn chế 22 2.3.5 Tinh ADN từ gel agarose Kit gel Qiagen 22 2.3.6 Phản ứng nối gen ngoại lai vào ADN plasmid 23 2.3.7 Cảm ứng biểu protein tái tổ hợp từ tế bào E coli 24 2.3.8 Điện di protein gel SDS-PAGE 24 2.3.9 Phương pháp lai Western blotting 25 2.3.10 Khảo sát điều kiện biểu protein IL-3 từ chủng E coli tái tổ hợp 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Tách dòng gen il3 tế bào E coli 28 3.1.1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào tách dòng 28 3.1.2 Cắt ADN plasmid tái tổ hợp cặp enzyme hạn chế 30 3.2 Thiết kế vector biểu mang gen il3 cho hệ biểu E coli 31 3.2.1 Chuẩn bị gen cho việc thiết kế vector biểu 31 3.2.2 Nối gen pelB-il3 vào vector biểu pET22b(+) 32 3.2.3 Tách chiết ADN plasmid từ thể biến nạp 32 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.2.4 Kiểm tra gen il3 vector biểu pET22b(+) enzyme hạn chế đọc trình tự 33 3.3 Biểu protein IL-3 từ tế bào E coli JM109 (DE3) 35 3.4 Kiểm tra tính kháng nguyên IL-3 tái tổ hợp phản ứng lai Western blot 3.5 37 Khảo sát số điều kiện lên men ảnh hưởng đến tổng hợp protein IL-3 tế bào E coli 39 3.5.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 39 3.5.2 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG 42 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 44 3.5.4 Ảnh hưởng pH môi trường 47 3.5.5 Ảnh hưởng thời điểm cảm ứng 49 3.5.6 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribo nucleic Amp Ampicillin Bp Base pair CSF Colony-stimulating factor E coli Escherichia coli G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor IL-3 Interleukin-3 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kb Kilo base SDS-PAGE SDS-PolyAcrylamid Gel Electrophoresis Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên Bảng Trang 2.1 Thành phần gel điện di biến tính SDS-PAGE 18 3.1 Bảng giá trị OD600 thu mẫu dòng biến nạp 36 3.2 Mật độ tế bào thời điểm thu mẫu chủng E coli biểu IL-3 môi trường khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 41 Page vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Sơ đồ minh họa bước tạo sản phẩm protein tái tổ hợp 1.2 Mô cấu trúc không gian IL-3 10 3.1 Điện di đồ ADN plasmid tách chiết từ thể biến nạp E coli DH10B 29 3.2 Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra ADN plasmid pUC57-pelB-il3 enzyme hạn chế 3.3 30 Điện di đồ sản phẩm tinh plasmid pET22b (+) gen pelB-il3 sau xử lý enzyme hạn chế 3.4 31 Phân tách sản phẩm tách chiết ADN plasmid pET22b-il3 gel agarose 0,8% 3.5 33 Điện di đồ sản phẩm cắt ADN plasmid enzyme hạn chế NotI NdeI 34 3.6 Kết biểu thử protein IL-3 từ dòng E coli JM109 tái tổ hợp 36 3.7 Kết Western blot xác định protein tái tổ hợp IL-3 biểu từ dòng E coli JM109 tái tổ hợp 37 3.8 Ảnh điện di protein tổng số biểu IL-3 từ môi trường khác 40 3.9 Ảnh điện di protein tổng số biểu từ môi trường LB M9 42 3.10 Coomassie kiểm tra mức độ biểu protein IL-3 nồng độ chất cảm ứng IPTG khác 3.11 43 Ảnh hưởng nồng độ IPTG lên khả sinh trưởng chủng biểu IL-3 44 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ cảm ứng lên mật độ tế bào thời điểm thu mẫu… 45 3.13 Ảnh điện di protein tổng số biểu IL-3 nhiệt độ khác nhau… 46 3.14 Ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh trưởng chủng sinh IL-3 48 3.15 Protein tổng số biểu từ môi trường có pH khác 48 3.16 Protein tổng số biểu mẫu cảm ứng mật độ tế bào khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 50 Page viii đóng gói xác (Vera cs, 2007) Vì không chọn hai nhiệt độ 37 - 40oC cho thí nghiệm Ở nhiệt độ 30oC, protein IL-3 biểu mạnh lượng tương đương IL-3 gắn với pelB Ngoài ra, mật độ tế bào mức độ trung bình so với nhiệt độ biểu khác Để thuận lợi cho bước tinh chế IL-3 sau này, không lựa chọn nhiệt độ 30oC để biểu protein Ở nhiệt độ 25oC, protein IL-3 biểu tốt, băng IL-3 kích thước 15 kDa đậm rõ nét Mặc dù tổng lượng protein (dạng gắn không gắn pelB) không nhiều 30oC toàn protein IL-3 cắt khỏi tín hiệu tiết pelB Có thể 25oC, mức độ tổng hợp IL-3 diễn chậm thuận lợi cho việc cuộn xoắn cấu trúc, vị trí cắt khỏi tín hiệu tiết pelB bộc lộ nên peptidase cắt hiệu Theo Chou cộng sự, nhiệt độ 25oC thấp so với nhiệt độ sinh trưởng bình thường E coli (37oC), trình diễn tế bào chậm hơn, dẫn đến giảm tỷ lệ phiên mã, dịch mã, phân chia tế bào (Chou cs 2007), đồng thời giảm kết tụ protein tổng hợp (Sahdev et al, 2008) Từ kết này, lựa chọn nhiệt độ biểu 25oC để nghiên cứu tiếp ảnh hưởng pH môi trường, thời gian thu mẫu, mật độ tế bào lúc cảm ứng lên tổng hợp protein IL-3 tế bào E coli tái tổ hợp 3.5.4 Ảnh hưởng pH môi trường Nồng độ ion H+ môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến hoạt động vi khuẩn chúng có khả làm thay đổi điện tích chất vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt pH định, cần tìm pH thích hợp cho sinh vật sinh trưởng sản xuất protein tái tổ hợp Sau tìm điều kiện biểu protein IL-3 thích hợp môi trường LB, nhiệt độ cảm ứng 25oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,05 mM, ảnh hưởng yếu tố pH môi trường tiếp tục đánh giá dựa vào mật độ tế bào băng protein IL-3 Tế bào E coli tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LB có pH từ 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; Sau cảm ứng, mật độ tế bào từ mẫu pH khác đo lại (Hình 3.14) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 Hình 3.14 Ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh trưởng chủng biểu IL-3 Hình 3.14 cho thấy mật độ tế bào mẫu có pH từ – cao không chênh lệch nhiều, dao động khoảng từ 0,8 đến Trong mật độ tế bào môi trường có pH acid (pH 5-5,5) thấp Như vậy, môi trường có pH trung tính thuận lợi cho tế bào E coli sinh trưởng Tuy nhiên khoảng pH này, mức độ biểu protein mẫu không giống Hình 3.15 protein tổng số biểu môi trường có điểm pH khác Mỗi đường chạy gel chứa lượng tế bào mẫu đưa giá trị OD tra lượng vào giếng Như vậy, dựa vào khác biệt độ đậm nhạt băng protein IL-3 tương ứng với kích thước 15 kDa, ta đánh giá sơ mức độ tổng hợp protein mẫu ĐC K 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 M LB kDa 116, 66,2 45,0 35,0 25,0 PelB-IL3 IL3 18,4 14,4 Hình 3.15 Protein tổng số biểu từ môi trường có pH khác ĐC: Mẫu đối chứng không mang gen; K: Mẫu không cảm ứng IPTG; 5.0 – 8.0: protein tổng số pH 5.0 - 8.0; M: Thang protein chuẩn (Fermentas);LB: Mẫu biểu môi trường LB (pH =6.8) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 Hình 3.15 cho thấy môi trường có pH acid (pH 5,5 - 6,5), lượng protein biểu thấp, băng IL-3 mảnh, mờ nhạt không khác nhiều so với mẫu đối chứng âm (ĐC) mẫu không cảm ứng IPTG (K) Đặc biệt, pH protein IL-3 không tổng hợp Đồng thời, mật độ tế bào pH thấp hẳn so với mẫu lại Nguyên nhân pH môi trường thấp ảnh hưởng đến hoạt động sống tế bào hoạt động sinh tổng hợp protein, làm cho tế bào sinh trưởng chậm lại Theo Chen cộng sự, việc trì pH môi trường điều kiện quan trọng tế bào chứa gen kháng ampicillin biểu mật độ cao Lý phân hủy ampicillin làm cho pH môi trường giảm xuống trở nên axít trình nuôi cấy, bất lợi cho sinh trưởng vi khuẩn Ngoài ra, môi trường có pH thấp gây căng thẳng (stress) cho tế bào vi khuẩn, kết xuất đào thải plasmid mật độ tế bào cao (Chen cs, 1992) Các mẫu nuôi môi trường có pH cao (6,5-8), lượng protein IL-3 biểu nhiều so với mẫu pH thấp Tuy nhiên từ điện di đồ ta quan sát thấy môi trường kiềm (pH 7,5 pH 8), băng protein IL-3 cắt khỏi tín hiệu tiết pelB băng protein IL-3 liên kết với pelB Trong đó, mẫu nuôi pH môi trường 7,0 môi trường LB (pH 6,8) tổng hợp IL-3 nhiều tương đương dạng không pelB Như vậy, khoảng pH thích hợp cho tế bào E coli tái tổ hợp biểu gen il3 3.5.5 Ảnh hưởng thời điểm cảm ứng Mật độ tế bào lúc cảm ứng sinh tổng hợp protein ngoại lai đóng vai trò quan trọng để thu lượng protein tái tổ hợp cao Vi khuẩn E coli điển hình thường cảm ứng mật độ tế bào (OD600) từ 0,4-0,6 Đây giai đoạn tế bào bắt đầu phát triển theo cấp số nhân Tuy nhiên tùy gen biểu chủng chủ mà cảm ứng mật độ tế bào khác Tế bào E coli tái tổ hợp nuôi qua đêm chuyển sang 100 ml môi trường LB có pH 6,8-7,0 cho OD600 = 0,1 Tế bào tiếp tục nuôi lắc 37oC, 200 vòng/phút tới OD600 đạt giá trị 0,4; 0,8; 1,0; 1,5 2,0 hút 10 ml mẫu chuyển sang bình nuôi cấy cảm ứng với nồng độ 0,05 mM IPTG nhiệt độ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 25oC, 200 vòng/phút Tế bào thu lại sau cảm ứng protein tổng số phân tách gel SDS-PAGE (Hình 3.16) ĐC K 0,4 0,8 1,0 1,5 2,0 M kDa 116,0 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4 IL-3 14,4 Hình 3.16 Protein tổng số biểu mẫu cảm ứng mật độ tế bào khác ĐC: Mẫu đối chứng không mang gen; K: Mẫu không cảm ứng IPTG; 0,4 - 2,0: Mẫu cảm ứng thời điểm mật độ tế bào từ 0,4 – 2,0; M: Thang protein chuẩn (Fermentas) Kết qủa điện di từ Hình 3.16 cho thấy băng protein IL-3 tăng dần theo giá trị OD cảm ứng từ 0,4 tới 1,0 giảm dần cảm ứng mật độ tế bào OD600 cao 1,0 Đối chiếu với mật độ tế bào lúc thu mẫu ta thấy mật độ tế bào tăng dần theo OD cảm ứng, trừ mẫu cảm ứng OD600 = 2,0 So với thí nghiệm trước, cảm ứng IPTG mật độ tế bào lớn 0,4 làm tăng mật độ tế bào thời điểm thu mẫu lên gấp lần (từ khoảng 0,9 lên gần 2) Như vậy, điều kiện cảm ứng IPTG thời điểm OD600 = 1,0 vừa cho mật độ tế bào cuối cao mà lượng protein IL-3 biểu tốt nên thời điểm cảm ứng thích hợp cho tế bào sinh tổng hợp protein IL-3 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 Hình 3.17 Ảnh hưởng thời điểm cảm ứng đến mật độ tế bào lúc thu mẫu Cảm ứng mật độ tế bào nhỏ tức OD cảm ứng 0,4 0,8 thời điểm có mật độ tế bào thưa bắt đầu bước vào pha tổng hợp protein ngoại lai nên mật độ tế bào cuối không nâng cao Cảm ứng mật độ tế bào cao (OD = 1,5 2) lúc tế bào bắt đầu bước vào pha cân bằng, sức sống giảm, số tế bào sinh số tế bào chết đi, pha tổng hợp protein bị ảnh hưởng mật độ tế bào cuối không tăng lên Thông thường, dù mật độ tế bào lúc thu mẫu cao đến việc cảm ứng biểu T7 RNA polymerase khuyến cáo giữa-cuối pha sinh trưởng theo hàm mũ (mid-to-late log phase of growth curve) để đảm bảo thu hiệu suất tối đa đồng thời hạn chế vấn đề liên quan đến tế bào bước vào pha tĩnh (ví dụ cảm ứng biểu protease) Do cảm ứng thời điểm OD600 = thích hợp trình tổng hợp protein IL-3 3.5.6 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu Sau cảm ứng, tế bào sử dụng hầu hết nguồn lực để sản xuất protein mục tiêu không tăng trưởng Lượng protein tế bào biểu phụ thuộc vào thời điểm thu mẫu Nếu thu mẫu sớm, protein biểu chưa nhiều, suất sản phẩm thấp Nếu thu mẫu muộn, nguồn dinh dưỡng cạn dần, tế bào chết sản sinh chất phân giải protein vừa tổng hợp sản phẩm phụ không mong muốn Do việc tìm thời điểm thích hợp để thu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 protein cần thiết nhằm tránh việc giảm sản lượng protein protease gây Ở thí nghiệm này, chủng tái tổ hợp nuôi môi trường cảm ứng thời điểm OD600 =1,0 tiếp tục nuôi lắc 25oC Mẫu thu sau cảm ứng IPTG thời điểm 1h, 2h, 3h,…8h 20h (tức nuôi qua đêm) điện di kiểm tra gel polyacrylamide 14 % (Hình 3.18) ĐC K 20 M 116 66, 45, 35,0 25,0 18,4 IL-3 14,4 Hình 3.18 Protein tổng số biểu từ mẫu thu thời điểm khác ĐC: Mẫu đối chứng không mang gen; K: Mẫu không cảm ứng IPTG; – 20: Mẫu thu thời điểm từ – 20 sau cảm ứng IPTG; M: Thang protein chuẩn (Fermentas) Kết nhuộm Coomassie từ Hình 3.18 cho thấy thời gian cảm ứng dài lượng protein tái tổ hợp nhiều Băng protein IL-3 bắt đầu xuất sau cảm ứng mức độ tích lũy protein tăng dần theo thời gian, nhiều sau 67 cảm ứng Băng protein IL-3 20 có độ đậm tương đương với mẫu thu lúc mật độ tế bào bị giảm đáng kể (Hình 3.19) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 Hình 3.19 Ảnh hưởng thời gian thu mẫu đến mật độ tế bào lúc thu mẫu Thời gian thu mẫu thích hợp thời điểm mà mức độ protein tái tổ hợp tích lũy nhiều, song song mật độ tế bào cao suất protein đích đạt tối đa Ở thí nghiệm này, mức độ biểu protein mẫu thu lúc đậm gần tương đương mật độ tế bào mẫu thu thấp mẫu thu Ngoài ra, mật độ tế bào giảm dần theo thời gian lên men thấp sau 20 (OD600 = 0,70) Mật độ tế bào giảm dần theo thời gian nhiều nguyên nhân Lý thứ nhất, tùy vào protein ngoại lai biểu độc hay không độc tế bào Nếu protein độc sau biểu hiện, tế bào dừng sinh trưởng chết dần Lý thứ hai, sau thời gian sinh trưởng, nguồn thức ăn oxi môi trường giảm dần, tế bào cạnh tranh dinh dưỡng oxi, kết mật độ tế bào giảm xuống Do thí nghiệm thời gian thu mẫu thích hợp tính từ thời điểm cảm ứng IPTG Như vậy, gen mã hóa cho protein IL-3 người nhân dòng biểu thành công vi khuẩn E coli dạng tái tổ hợp Ở 37oC nồng độ 0,5 mM IPTG, mật độ tế bào không cao protein IL-3 biểu mạnh, phần cắt khỏi tín hiệu tiết PelB trở kích thước khoảng 15 kDa, phần lại gắn với pelB nên có tổng kích thước khoảng 18 kDa Cả hai băng protein liên kết với kháng thể đặc hiệu kháng IL-3 người Nhằm hướng protein IL-3 sau biểu cắt hết pelB cải thiện sinh khối tế bào, điều kiện lên men kiểm tra bình tam giác Sau khảo sát điều kiện biểu hiện, mật Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 độ tế bào chưa cải thiện mong đợi (chỉ tăng lên lần) số nguyên nhân đặc điểm chủng chủ, tính chất gen đặc điểm protein IL-3 Tuy nhiên kết đáng khích lệ protein IL-3 sau biểu không gắn với pelB Nguyên nhân nhiệt độ nồng độ chất cảm ứng thấp làm cho trình tổng hợp protein IL-3 diễn chậm hơn, bộc lộ vùng nối tín hiệu tiết protein IL-3, tạo điều kiện cho enzyme nhận biết cắt hiệu quả, giải phóng phân tử IL-3 nguyên vẹn Đây ưu điểm cho bước tinh protein IL-3 sau việc tách hai phân tử pelB-IL3 IL-3 có trọng lượng phân tử gần không dễ dàng, protein tái tổ hợp dùng làm dược phẩm phải có độ từ 98% trở lên Kết nghiên cứu giúp cho việc lên men fermentor lớn hơn, nơi kiểm soát tốt điều kiện lên men pH môi trường, nguồn dinh dưỡng, oxi hòa tan,… để thu nhiều sinh khối tế bào, thuận lợi cho việc tách chiết tinh protein IL-3 tái tổ hợp bước nghiên cứu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau hoàn thành đề tài “Nghiên cứu điều kiện biểu protein Interleukin-3 (IL-3) người tái tổ hợp dung hợp với PelB Escherichia coli ” có số kết luận sau: - Đã tạo thành công vector biểu pET22b(+)pelB-il3 cho hệ biểu E coli - Khảo sát số điều kiện biểu protein IL-3 chủng E coli tái tổ hợp quy mô bình tam giác, là: môi trường LB (pH 6,8 - 7,0); nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,05 mM; thời điểm cảm ứng OD600 = 1,0; nhiệt độ biểu 25oC; thu mẫu sau 6h cảm ứng Protein IL-3 người tái tổ hợp biểu từ tế bào E coli dạng không gắn với pelB; sinh khối tế bào tăng gấp đôi so với trước khảo sát điều kiện lên men KIẾN NGHỊ Để tiếp tục hướng nghiên cứu trên, có số kiến nghị sau: - Nghiên cứu nâng cao hiệu suất biểu protein tái tổ hợp IL-3 sinh khối tế bào bình lên men lít - Nghiên cứu phương pháp tách chiết thu hồi protein tái tổ hợp IL-3 từ tế bào E coli Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thanh Đạm (2004) Miễn dịch điều trị bệnh ung thư Nhà xuất y học Nguyễn Thị Quý, Dương Thu Hương, Lê Ngọc Giang, Lê Thị Thu Hồng, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải (2013) Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp biểu Interleukin-3 Interleukin-11 người dạng lai với PelB Tạp chí Sinh học, 35(3e): 94-99 Tài liệu tiếng Anh 10 11 12 13 14 Baneyx F (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli Current Opin Biotechnology 10(5):411-21 Bauer, C S, Abrams, M A, Braford-goldberg, S R, Caparon, M H, Easton, A M, Klein, B K, Mckearn, J P, Olins, P O, Paik, K, and Thomas, J W (2000) Human interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, J Allergy Clin Immunol; 85: 422-436 Betts, S and King, J (1999) There's a right way and a wrong way: In vivo and in vitro folding, misfolding and subunit assembly of the P22 tailspike Structure Fold Des R131–R139 Blattner, F R, Plunkett, G, Bloch, C A (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science; 277: 1453–147 Bob Kingston and Roger Brent (2007) Current Protocols in Molecular Biology, 1601-1605 Chen, H.C., Hwang, C.F., and Mou, D.G (1992) High – density Escherichia coli cultivation process for hyperexpression of recombinant porcine growth hormone Enzyme Microb Technol 14, 321-326 Chen, C., Snedecor, B., Nishihara, J.C., Joly, J.C., McFarland, N., Andersen, D.C., Battersby, J.E., Champion, K.M (2004) Highlevel accumulation of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (degP prc spr) host strain Biotechnol Bioeng 85, 463–474 Choi, J.H., Jeong, K.J., Kim, S.C., Lee, S.Y (2000) Efficient secretory production of alkaline phosphatase by high cell density culture of recombinant Escherichia coli using theBacillussp endoxylanase signal sequence Appl Microbiol Biotechnol 53, 640–645 Chou, C.P (2007) Engineering cell physiology to enhance recombinant protein production in Escherichia coli.Appl Microbiol.76,521 – 532 Dalloul AH, Arock M, Fourcade C, Hatzfeld A, Bertho JM, Debre P, Mossalayi MD (1991) Human thymic epithelial cells produce interleukin-3, Blood 1991, 77:6974 de Wilt JH, Bout A, Eggermont AM, van Tiel ST, de Vries MW, ten Hagen TL, de Roos WK, Valerio D, van der Kaaden ME ( 2001) Adenovirus-mediated interleukin beta gene transfer by isolated limb perfusion inhibits growth of limb sarcoma in rats Hum Gene Ther;12:489–502 Dorssers, L C J., Wagemaker, G, Vos, Y J, Leen, R W V, and Persoon, M L N (2002) Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof, Protein Expression and Purification, 80: 185-193 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 15 Gleich GJ (1990) The eosinophil and bronchial asthma: current understanding J Allergy Clin Immunol;85: 422-436 16 Glick BR, Pasternak JJ (2003) Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA American Society of Microbiology 17 Glick , B.R., and Pasternak, J.J (2010) Molecular Biotechnology: Principles, and Aplications of Recombinant DNA (ÁM Press) 18 Gottesman, S.(1996) “ Proteases and their targets in Escherichia coli” Annu.Rev Genet.30:465-506 19 Hongbo Li,NaLi, Xuefei Gao, Xiangping Kong, Shiwu Li, Aimin Xu, Shouguang Jin, Donghai Wu (2011) High level expression of active recombinant human interleukin-3 in Pichia pastoris Protein Expression and Purification, 80: 185193 20 Klein, B K, Feng, Y, McWherter, C A, Hood, W F, Paik, K, and McKearn, J P (1997) The Receptor Binding Site of Human Interleukin-3 Defined by Mutagenesis and Molecular Modeling, Journal of Biological Chemistry272: 22630 -22641 21 Korenaga, M., Wantanabe, N., Abe, T., and Hashiguchi, Y (1996) Acceleration of IgE responses by treatement with recombinant interleukin-3 prior to infection with Trichinella spiralis in mice Immunology 87, 642-646 22 Kurimoto Y, de Weck, A L, and Dahinden, C A (1989) Interleukin 3-dependent mediator release in basophils triggered by C5a J Exp Med; 170:467-479 23 Lee S.J., Lee S.Y (2002) Efficient high-level production of spider protein by fedbatch cultivation of recombinant Escherichia coli and its purification Theories and Application of Chem Eng.8,246-359 24 Lindemann, A, and Mertelsmann, R (1993) Interleukin-3: Structure and Function, Cancer Investigation11: 609-623 25 Lin, J.X., and Leonard, W.J.(2003) Chapter 8-Interleukin-2 In The cytokine handbook (Fourth Edition), Angus W Thomson, and Michael T Lotze, eds (London: Academic Press), pp.167-I 26 MacDonald and A.E Hershey (1989) Size structure of a lake trout (Salvelinus namaycush) population in an arctic lake: Influence of angling and implications for fish community structure Can J Fish Aquat Sci 46: 2153-2156 27 Makrides SC (1996) Strategies for achieving high level expression of genes in Escherichia coli Microbiol Rev 60:512 – 538 28 Morris, C F, Young, I G, and Hapel, A J (1990) In Colony Stimulating Factors, Molecular and Cellular Biology, ImmunologySeries, Vol 49: 177-214 29 Niemeyer, C M, Sieff, C A, Mathey-Prevot, B, Wimperis, J Z., Bierer, B E, Clark, S C, and Nathan, D G (1989) Expression of human interleukin-3 (multi-CSF) is restricted to human lymphocytes and T-cell tumor lines, Blood73, 945-951 30 Novagen (2002-2003) Protein Expression: Prokaryotic Expression: pETBlue and pET System Overview Novagen 2002-2003 Catalog 84-91 31 Jamur, M C, and Oliver, C (2011) Origin, maturation and recruitment of mast cell precursors, Front Biosci (Schol Ed)3: 1390-1406 32 Peter E Vaillancourt (2003) Methods in Molecular Biology: E coli Gene Expression Protocols Applied Molecular Evolution San Diego, CA Humana Press Totowa, New Jersey Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Plaut M and Lichtenstein LM (1983) Cellular and chemical basis of the allergic inflammatory reaction In: Middleton E,Jr, Reed CE, Ellis EF, eds Allergy: principles and practice 2nd Ed St Louis: The C.V Mosby Company: 119-146 Pugsley AP (1993) The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria Microbiol Rev Mar;57(1):50-108 Rissoan, M C, Soumelis, V, Kadowaki, N, Grouard, G, Briere, F, de Waal Malefyt, R, and Liu, Y J (1999) Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation, Science283, 1183-1186 Sambrook J, Russell DW(2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Schumann, W, and L.C.Ferreira(2004).” Production of recombinant proteins in Escherichia coli.” Gen.Mol.Biol.27(3):442-453 Schrader JW, Ziltener HJ, Leslie KB (1986) Structual homologies among the hemopoietins Proc NatI Acad Sci USA; 83:2458-2462 Schrader, J W (2003) Chapter 9- Interleukin-3 In The Cytokine Handbook (Fourth Edition), Angus W Thomson, and Micheal T Lotze, eds (London: Academic Press), pp.201 -225 Schroeder JT1, Chichester KL, Bieneman APHuman basophils secrete IL-3: evidence of autocrine priming for phenotypic and functional responses in allergic disease J Immunol;182(4):2432-8 Shaw G, Kamen R (1986) A conserved AU sequence from the 3’ untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation Cell; 46:659-667 Shin CS,Hong MS, Bae CS, Lee J (1997) Enhanced production of human miniproinsulin in fed-batch cultures at high cell density of Escherichia coli BL21(DE3)[pET-3aT2M2] Biotechnol Prog.13(3) :249-57 Smit V, van Veelen PA, Tjaden UR, van der Greef J, Haaijman JJ (1992) Human interleukin-3 contains a discontinuous zinc binding domain Biochem Biophys Res Commun; 187(2):859-66 Stomski FC, Sun Q, Bagley CJ et al (1996) Human interleukin-3(IL-3) induces disulfide-linked IL-3 receptor alpha-and beta-chain heterodimerization, which is required for receptor activation but not high-affinity binding Mol Cell Biol; 16:3035-3046 Studier FW, Mofatt BA (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high – level expression of cloned genes J Mol Biol 189:113-130 Sugiyama H, et al (1993) Importance of interleukin-3 on histamine release from human basophils Ann Allergy; 71:391-395 Sudhir Sahdev Æ Sunil K Khattar Æ Kulvinder Singh Saini (2008).Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies Terpe K1.(2006) Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems Appl Microbiol Biotechnol.;72(2):211-22 Urdal, D L, and Sassenfeld, H M (1992, July 7) Nonglycosylated human interleukin-3 analog proteins Vera A, Gonzalez-Montalban N, Aris A et al (2007) The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures Biotechnol Bioeng 96:1101–1106 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Villaverde,A.and M.M.Carrio.(2003).” Protein aggregation in recombinant bacteries biological role of inclusion bodies” Biotechnol.Lett.25(17):1385-1395 Yang YC, Ciarletta AB, Temple PA et al (1986) Human IL-3 (multi-CSF): identification by expression cloning of a novel hematopoietic growth factor related to murine IL-3 Cell;47:3-10 Yin et al (2007).Select what you need: A comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes Journal of Biotechnology 127 ,335–347.Review Georg F Weber1, Benjamin G Chousterman1,*, Shun He1,* et al Interleukin-3 amplifies acute inflammation and is a potential therapeutic target in sepsis Science 13 March 2015: Vol 347 no 6227 pp 1260-1265 Williams GT, et al (1990) Haemopoietic colony-stimulating factors promote cell survival by suppressing apoptosis Nature; 343: 76-79 Ziltener, H J, Clark-Lewis, I, Jones, A T, and Dy, M (1994) Carbohydrate does not modulate the in vivo effects of injected interleukin-3, Exp Hematol.22: 10701075 http://www.microvet.arizona.edu/Courses/MIC419/Tutorials/cytokines.html http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/IL3ID60.html http://www.gch.ulaval.ca/agarnier/bcm20329/hur_c10.htm http://gfme.free.fr/therap/interl.html Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 PHỤ LỤC vector tách dòng pUC 57 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 PHỤ LỤC Vector biểu pET22b(+) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 [...]... Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Tách dòng gen il3 trong tế bào E coli 2.2.2 Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen il3 2.2 .3 Biểu hiện protein IL -3 trong tế bào E coli JM109 và kiểm tra tính kháng nguyên của IL -3 tái tổ hợp 2.2.4 Khảo sát điều kiện biểu hiện thích hợp của protein IL -3 từ chủng E coli tái tổ hợp quy mô bình tam giác 2 .3 Phương pháp nghiên cứu 2 .3. 1 Biến nạp ADN plasmid vào tế bào E coli. .. Interleukin- 3 (IL -3) người tái tổ hợp từ tế bào E coli 2.2 Mục tiêu cụ thể - Tạo được chủng E coli tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein IL -3 - Xác định được một số điều kiện biểu hiện IL -3 thích hợp ở chủng chủ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn 1.1.1 Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp Công... cứu sản xuất protein IL -3 tái tổ hợp là tạo được chủng E coli tái tổ hợp có khả năng biểu hiện tốt protein ngoại lai này, tiếp theo là nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp để protein IL -3 biểu hiện ổn định, sinh khối tế bào cao nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho bước tách chiết thu protein IL -3 từ tế bào chủ cho các bước nghiên cứu tiếp theo Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu. .. biểu hiện này phù hợp cho từng loại gen tái tổ hợp khác nhau Việc lựa chọn hệ biểu hiện phụ thuộc vào đặc điểm của gen cần biểu hiện và mục đích sử dụng protein tái Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 tổ hợp Ví dụ, những protein có kích thước nhỏ (dưới 200 axit amin) thường được biểu hiện dễ dàng trong vi khuẩn E coli dưới dạng protein dung hợp (fusion protein) ... cứu điều kiện biểu hiện protein Interleukin- 3 (IL -3) người tái tổ hợp dung hợp với PelB trong Escherichia coli ” Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học Đề tài có sử dụng trang thiết bị của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2 Mục tiêu của đề tài 2.1 Mục tiêu chung - Biểu hiện được Interleukin- 3. .. giới, nhiều loại Interleukin đã được nghiên cứu tạo ra theo con đường tái tổ hợp và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y sinh IL -3 vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu lâm sàng để đánh giá tác dụng của nó Nhiều công ty cung cấp IL -3 người tái tổ hợp sử dụng cho mục đích nghiên cứu với giá thành tương đối cao Hầu hết các sản phẩm này đều được biểu hiện từ tế bào vi khuẩn E coli Ở trong nước, bằng... Nông nghiệp Page 23 Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 1 h ở 22oC Sản phẩm lai sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E coli bằng phương pháp sốc nhiệt để kiểm tra sự có mặt của gen chèn vào vector tái tổ hợp 2 .3. 7 Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp từ tế bào E coli Sau khi tạo được plasmid biểu hiện pET22 mang đoạn gen il3, plasmid được biến nạp vào tế bào biểu hiện E coli JM109 (DE3) bằng phương pháp... tái tổ hợp bao gồm các bước chính sau: Tách chiết và tinh sạch ADN thuộc các nguồn khác nhau (gồm vector và ADN mong muốn); tạo ra các phân tử ADN tái tổ hợp in vitro và đưa phân tử ADN tái tổ hợp này vào trong các tế bào vật chủ, sau đó tiến hành biểu hiện protein tái tổ hợp (Hình 1.1) Hình 1.1: Sơ đồ minh họa các bước tạo sản phẩm protein tái tổ hợp (Nguồn:http://www.gch.ulaval.ca/agarnier/bcm2 032 9/hur_c10.htm)... gen tái tổ hợp, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã tạo ra được sinh phẩm Interleukin- 2 (IL-2) tái tổ hợp có khả năng ứng dụng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, tạo động lực cho việc nghiên cứu về các loại interleukin khác, trong đó có interleukin- 3 Vi khuẩn E coli với những ưu điểm như dễ nuôi cấy, thời gian sinh trưởng nhanh, lượng protein. .. số protein là các phân tử tiết hoặc đóng vai trò là thụ thể bề mặt tế bào (thường có kích thước lớn hơn 500 axit amin) thì được biểu hiện thành công nhất trong tế bào động vật Trong số các hệ biểu hiện nêu trên thì vi khuẩn E coli là hệ được sử dụng phổ biến nhất để tạo ra các protein tái tổ hợp Sự tổng hợp protein tái tổ hợp từ tế bào E coli phụ thuộc vào các plasmid đặc thù Ngoài ra, đặc điểm của protein