Nghiên cứu tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M của virus PRRS trong lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana

Trong nghiên cứu này, các điều kiện để biểu hiện tạm thời gen mã hóa protein M của virus PRRS trong lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium tumefaciens đã được xác định.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 16(2): 293-300, 2018 NGHIÊN CỨU TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN TẠM THỜI GEN MÃ HOÁ KHÁNG NGUYÊN M CỦA VIRUS PRRS TRONG LÁ CÂY THUỐC LÁ NICOTIANA BENTHAMIANA Nguyễn Thị Minh Hằng1,2, Hồ Thị Thương1, Nguyễn Thu Giang1, Phạm Bích Ngọc1,3, Nguyễn Trung Nam1,3, Chu Hồng Hà1,3,* Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: chuhoangha@ibt.ac.vn Ngày nhận bài: 09.3.2017 Ngày nhận đăng: 25.6.2017 TÓM TẮT Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) bệnh truyền nhiễm, virus PRRS gây ra, có tốc độ lây lan nhanh gây chết hàng loạt lợn bị nhiễm bệnh Protein M protein cấu trúc virus PRRS có trọng lượng phân tử khoảng 19 kDa, mã hóa khung đọc mở số (ORF6), sử dụng để thiết kế vaccine tiểu đơn vị chống lại virus PRRS Trong nghiên cứu này, điều kiện để biểu tạm thời gen mã hóa protein M virus PRRS thuốc Nicotiana benthamiana phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium tumefaciens xác định Kết nghiên cứu cho thấy, điều kiện tối ưu để biểu protein tạm thời thuốc phương pháp sử dụng đồng thời chủng A tumefaciens chứa vector chuyển gen mang gen mã hóa protein M A tumefaciens chứa vector hỗ trợ mang gen mã hóa protein HC-Pro PVY; nồng độ chất dẫn dụ cảm ứng AS 450 µM; mật độ tế bào vi khuẩn sử dụng để xâm nhiễm vào có giá trị OD600 0,5; tuổi sinh lý phù hợp cho vi khuẩn xâm nhiễm phương pháp hút chân không non bánh tẻ thuốc - tuần tuổi thời gian biểu tạm thời gen mã hóa protein M virus PRRS thuốc hiệu ngày sau chuyển gen Phương pháp áp dụng để biểu lượng lớn protein – kháng nguyên M virus PRRS thuốc để sản xuất vaccine phòng chống loại virus Từ khoá: Biểu gen tạm thời, Nicotiana benthamiana, protein M, PRRSV, thẩm lọc nhờ Agrobacterium MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS) gọi “Bệnh lợn tai xanh”, virus PRRS gây ra, có tốc độ lây lan nhanh, gây chết hàng loạt lợn nhiễm bệnh Cách phòng chống bệnh lợn tai xanh hiệu sử dụng vaccine biện pháp thú y Nhưng nay, có số lượng hạn chế vaccine bất hoạt nhược độc cho bệnh lợn tai xanh, sử dụng chủng virus châu Mỹ châu Âu chủ yếu vaccine phục vụ cho việc phòng trị virus thể độc lực thấp Virus gây dịch bệnh lợn tai xanh Việt Nam xác định thể độc lực cao, việc chữa trị khó khăn, dịch nguy hiểm nên cần phải có loại vaccine phù hợp Vaccine tái tổ hợp đánh giá có hiệu Vì vậy, việc nghiên cứu biểu loại protein virus PRRS có khả gây đáp ứng miễn dịch cao sử dụng làm vaccine tiểu đơn vị cần thiết Protein M protein cấu trúc virus PRRS, có trọng lượng phân tử khoảng 19 kDa, mã hóa khung đọc mở số (ORF6) Protein M khơng glycosyl hóa, có tính kháng ngun có mức độ bảo thủ cao số protein virus PRRS (Meulenberg et al., 1995) Trong virion, protein M liên kết với protein GP5 cầu nối disulfide cho tham gia vào 293 Nguyễn Thị Minh Hằng et al trình lắp ráp virus Protein M dùng để thiết kế vaccine tiểu đơn vị tái tổ hợp chống lại xâm nhiễm virus PRRS (Ostrowski et al., 2002; Plagemann, 2004; Ansari et al., 2006) protein M gây đáp ứng miễn dịch tế bào mạnh (Bautista et al.,2002) Vaccine tiểu đơn vị sản xuất thực vật hướng nghiên cứu có triển vọng nhiều ưu điểm ổn định bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học; dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, giá thành thấp Tuy nhiên, hệ thống biểu thực vật, mức độ tổng hợp protein cao thường bị cản trở chế câm gen phiên mã sau phiên mã thực vật (Fagard et al., 2000) Protein 2b virus khảm dưa chuột Cucumber mosaic virus (CMV) Hc-Pro virus gây bệnh khoai tây Potato virus Y (PVY) protein gây ức chế chế làm câm gen tế bào thực vật Các protein nghiên cứu sử dụng để tăng cường biểu tạm thời protein tái tổ hợp thực vật (Du et al., 2008) Tế bào thực vật cho phép thực việc định vị xác protein tái tổ hợp tế bào, cho phép protein có biến đổi sau dịch mã (Wagner et al., 2004) Protein tái tổ hợp tích lũy tế bào thực vật đạt mức cao (Verwoerd et al., 1995), đặc biệt gắn với elastin-like polypeptids (ELP) (Scheller et al., 2006) Thêm vào đó, protein tái tổ hợp sản xuất từ thực vật tránh tạp nhiễm virus vi khuẩn (Daniell et al., 2001) Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu tối ưu điều kiện biểu tạm thời gen mã hóa cho protein M virus PRRS thuốc (Nicotiana benthamiana) Hệ thống biểu tạm thời thực vật phương pháp hữu ích để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phương pháp nhanh, có mức độ biểu cao, không bị ảnh hưởng vị trí gắn gen đích hệ gen tế bào biểu mơ biệt hóa hồn tồn nên sản xuất vaccine với số lượng lớn, nhanh chóng đáp ứng kịp thời dịch bệnh xảy VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chủng Agrobacterium tumefaciens C58C1 chứa vector pCB301-35S-M-Histag-Cmyc-100xELP mang gen mã hóa protein M-ELP tái tổ hợp điều khiển promoter 35S (Nguyễn Thị Minh Hằng et al., 2017); chủng A tumefaciens C58C1 chứa vector pIBT-35S-2b CMV pIBT-35S-HC-Pro PVY có gen mã hóa protein 2b CMV HcPro PVY; thuốc N benthamiana Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp Hình Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pIBT-35S-2b CMV (A); pIBT-35S-HC-Pro PVY (B) Phương pháp Chuẩn bị dịch khuẩn Các chủng A tumefaciens C58C1 mang vector chuyển gen nuôi tăng sinh 500 mL mơi trường YEB có bổ sung 50 µg/mL kanamicin 50 µg/mL rifamicin, 28 o C 12h Khuẩn thu nhận cách ly tâm 5.000 v/p o C 10 Khuẩn hòa tan dịch đệm 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) 294 Phương pháp biến nạp gen đích vào thuốc Quá trình biến nạp tiến hành với thuốc trồng từ - tuần Cây úp ngược nhấn chìm tồn phần vào bình chứa dịch khuẩn A tumefaciens chuẩn bị trên, hệ thống chuyển vào bình hút chân khơng Áp suất bình hút chân khơng chỉnh tới 27 inches Hg, hút 1,5 min, sau giảm áp suất bình áp suất khơng khí mở nắp Các thuốc sau biến nạp tiếp tục ni chăm sóc buồng sinh trưởng có điều kiện ánh sáng 5.000 – 7.000 Lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 -70% Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 16(2): 293-300, 2018 nghiệm Lá mẫu thí nghiệm thu ngày sau biến nạp, tách chiết protein tổng số để đánh giá mức độ biểu gen chuyển Mức độ biểu gen đánh giá thông qua phản ứng lai Western blot Đánh giá ảnh hưởng tuổi sinh lý đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M Hình Chuyển gen tạm thời vào thuốc nhờ A tumefaciens phương pháp hút chân không.(A): Cây nhấn chìm bình chứa A tumefaciens bên bình hút chân khơng; (B): Cây sau biến nạp Đánh giá ảnh hưởng vector hỗ trợ đến mức độ biểu tạm thời gen mã hóa protein M Để đánh giá ảnh hưởng vector hỗ trợ đến mức độ biểu gen m thuốc lá, vector biểu pCB301-35S-M-Histag-Cmyc-100xELP lây nhiễm vào thuốc với dịch khuẩn đơn mang vector biểu dịch vi khuẩn kép mang vector biểu vector hỗ trợ có gen mã hóa cho protein 2b CMV, HcPro PVY Thí nghiệm lặp lại lần, lần cho công thức Mẫu thu sau 3, 4, 5, ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số để đánh giá mức độ biểu gen chuyển Mức độ biểu gen m đánh giá so sánh thí nghiệm có khơng có vector hỗ trợ phương pháp lai Western blot Đánh giá ảnh hưởng nồng độ Acetosyringone đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M Để xác định nồng độ AS thích hợp cho biểu gen tạm thời thuốc lá, thí nghiệm bố trí với dịch khuẩn Agrobacterium không bổ sung AS bổ sung AS với nồng độ 450 µM 600 µM Lá thí nghiệm thu sau ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số để đánh giá mức độ biểu gen chuyển Mức độ biểu gen m đánh giá thông qua phản ứng lai Western blot Nồng độ AS cho mức độ biểu gen mạnh chọn cho thí nghiệm Để xác định vị trí thích hợp cho biểu tạm thời gen m mã hóa protein M tái tổ hợp; thuốc thí nghiệm phân vùng sau: Lá non gồm thứ 1, 2, từ xuống; bánh tẻ gồm vị trí thân cây; già gồm 1, 2, từ gốc lên Sau lây nhiễm với dịch khuẩn nồng độ AS thích hợp xác định thí nghiệm trên, mẫu vùng thu riêng rẽ sau ngày biến nạp để tách chiết protein tổng số đánh giá biểu gen mã hóa protein M phương pháp lai Western blot Đánh giá ảnh hưởng tuổi đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M Để xác định tuổi thích hợp cho xâm nhiễm Agrobacterium biểu gen m, thuốc 3, 4, 5, 6, tuần tuổi xâm nhiễm với dịch khuẩn có bổ sung AS nồng độ tối ưu Mẫu riêng rẽ thu ngày sau biến nap, tách chiết protein tổng số để đánh giá mức độ biểu gen mã hóa protein M phương pháp lai Western blot Tách chiết xác định hàm lượng protein tổng số Protein tổng số từ mẫu tách dịch chiết PBS (Phosphate-buffered saline; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 1,8 mM KH2PO4; pH 7,4), 0,05% Tween theo tỉ lệ : [trọng lượng mẫu (g) : thể tích dịch chiết (mL)] bảo quản -20oC Hàm lượng protein tổng số đo bước sóng 595 nm theo phương pháp Bradford (1976) với đường chuẩn xây dựng dựa vào protein BSA chuẩn biết trước nồng độ Điện di SDS-PAGE lai Western blot Đánh giá ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn OD600 đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M Điện di protein tổng số phương pháp điện di SDS-PAGE đánh giá mức độ biểu gen mã hóa protein M tái tổ hợp thuốc lai Western blot theo phương pháp Burnette đồng tác giả (1981), sau: Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng mật độ vi khuẩn Agrobacterium tiến hành với dịch khuẩn có giá trị OD600 = 0,2; 0,5 1,0 bổ sung AS nồng độ thích hợp xác định thí Điện di SDS-PAGE: Bản gel SDS-PAGE 10% polyacrylamide chuẩn bị theo công thức Laemmli (1970) Protein tổng số biến tính 95oC 10 trước tra mẫu lên gel Tất 295 Nguyễn Thị Minh Hằng et al giếng thí nghiệm đưa vào lượng protein tổng số (30 µg) Điện di tiến hành điện di 100V, 20mA 3h Western blot: Sau điện di protein tổng số gel SDS-PAGE, protein chuyển lên màng nitrocellulose máy chuyển màng Fast blotter (Thermoscientific) 25V, 1.3A 20 Màng chứa kháng nguyên phủ sữa tách béo 5% pha dung dịch PBS 0,05% Tween, 5h màng ủ với kháng thể kháng cmyc qua đêm, sau màng ủ với kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP 2h Phát có mặt protein M gắn cmyc cách ngâm màng lai dung dịch màu có chứa chất DAB (Diaminobenzidine) 15 phút (Phan, 2012) Phân tích hình ảnh phần mềm Image J Độ đậm nhạt băng protein thí nghiệm lai Western blot so sánh phần mềm Image J KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng vector hỗ trợ đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M Biểu gen tạm thời thực vật có mức độ tổng hợp protein cao (Verwoerd et al., 1995; Scheller et al., 2006) Tuy nhiên, có số nghiên cứu việc biểu thực vật thường bị cản trở chế câm gen phiên mã sau phiên mã (Fagard et al., 2000) Có ba phương thức làm câm gen thực vật, vai trò phương thức xác định bao gồm chế phòng thủ chống lại virus, điều hòa biểu gen ngưng tụ chất nhiễm sắc thành heterochromatin (Baulcombe, 2004) Để khắc phục tượng này, có 30 loại protein ức chế câm gen virus thực vật tìm thấy Vì vậy, việc biểu đồng thời gen mã hóa protein ức chế câm gen gen mục tiêu tế bào thực vật làm tăng mức độ biểu protein đích Protein 2b ức chế RNA silencing methyl hóa DNA cách liên kết cô lập siRNA kéo dài tiền dsRNA (Duan et al., 2012) Trong nghiên cứu biểu gen GFP sử dụng protein hỗ trợ HC-Pro PPV mức độ biểu GFP tăng 3-4 lần thuốc (N benthamiana) sau ngày xâm nhiễm dịch khuẩn (Stephan et al., 2011) Để đánh giá mức độ hoạt động vector mang gen mã hóa cho protein tái tổ hợp M-ELP vector hỗ trợ mang gen mã hóa cho protein 2b CMV, HcPro PVY ức chế câm gen hoạt động điều khiển promoter CaMV 35S; thí nghiệm khơng sử dụng vector hỗ trợ sử dụng vector hỗ trợ thực đồng thời Thu thuốc sau 3, 4, ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số lai Western blot Hình Biểu protein tái tổ hợp khơng sử dụng có sử dụng vector hỗ trợ A : Biểu protein M không sử dụng vector hỗ trợ; B: Biểu protein M sử dụng vector hỗ trợ pIBT/2bCMV; C: Biểu protein M sử dụng vector hỗ trợ pIBT/Hc-Pro PVY M: Marker; 1: Protein sau ngày xâm nhiễm; 2: Protein sau ngày xâm nhiễm; 3: Protein sau ngày xâm nhiễm; 4: Protein sau ngày xâm nhiễm Kết lai Western blot (Hình 3) cho thấy thu băng màu nâu có kích thước khoảng 66 kDa với kích thước protein M dung hợp với ELP cassette gen 35S-M-Histag-Cmyc-100xELP mã hóa, theo tính tốn lý thuyết Như vậy, gen mã hóa cho protein M-ELP hoạt động điều khiển promoter CaMV 35S protein M biểu thành công thuốc phương pháp thẩm 296 lọc nhờ Agrobacterium So sánh băng protein thí nghiệm khơng sử dụng sử dụng vector hỗ trợ phần mềm Image J cho thấy, độ đậm băng protein không sử dụng vector hỗ trợ thấp Điều giải thích chế câm gen thực vật hoạt động ức chế biểu protein ngoại lai (Fagard et al., 2000) Protein Hc-Pro ức chế chế câm lặng RNA thực vật cách ngăn cản Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 16(2): 293-300, 2018 phân giải mRNA RNA sợi đơi từ giảm lượng siRNA làm hỏng chức cắt enzyme cắt sợi đôi Dicer RISC (Zhang et al., 2008) Dựa vào sở khoa học nghiên cứu trên, gen mã hóa protein 2b CMV Hc-pro PVY từ chủng virus Việt Nam phân lập sử dụng để tiến hành đánh giá khả tăng cường biểu protein tái tổ hợp thí nghiệm biểu tạm thời Biểu protein tái tổ hợp M sử dụng chủng vi khuẩn mang vector hỗ trợ chứa gen mã hóa protein 2b CMV Hc-Pro PVY thể Hình 3B, 3C; phân tích phần mềm Image J, kết cho thấy băng protein rõ nét tất mẫu, đặc biệt mẫu thu ngày thứ sau biến nạp có băng rõ nét, đậm Điều chứng tỏ vector hỗ trợ mang gen mã hóa protein 2b CMV Hc-Pro PVY hoạt động tốt tăng cường biểu tạm thời gen mã hóa protein M thuốc Trong đó, Hc-Pro PVY cho thấy khả hỗ trợ tăng cường biểu protein M tốt so với 2b CMV thể băng protein đậm (Hình 3C) Vì vậy, HcPro PVY lựa chọn cho thí nghiệm Ảnh hưởng nồng độ AS đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M AS hợp chất phenol tế bào thực vật bị thương tiết ra, có vai trò quan trọng việc nhận biết gắn kết vi khuẩn Vì vậy, thí nghiệm chuyển gen hay biểu gen tạm thời sử dụng vi khuẩn A tumefaciens, AS thường thêm vào chất dẫn dụ cảm ứng hoạt động nhóm gen gây độc A tumefaciens giúp cho vi khuẩn dễ dàng xâm nhiễm chuyển gen vào tế bào thực vật Để đánh giá ảnh hưởng AS đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M; thí nghiệm thiết kế với cơng thức gồm không bổ sung AS bổ sung AS với nồng độ 450 µM 600 µM, sử dụng chủng khuẩn A tumefaciens chứa vector pCB301-35S-MHistag-Cmyc-100xELP chủng khuẩn A tumefaciens chứa vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY Thu thuốc sau ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số lai Western blot Kết lai Western blot (Hình 4) xuất băng màu nâu có kích thước với kích thước tính tốn lý thuyết protein M dung hợp ELP (66 kDa) Ở giếng thu băng protein tương ứng với nồng độ AS 450 µM đậm nhất, điều chứng tỏ nồng độ AS 450 µM có hiệu tốt cho biểu tạm thời gen mã hóa protein M Sự tăng lượng protein M lượng khuẩn xâm nhiễm chuyển gen vào tế bào tăng lên có mặt AS Tuy nhiên, nồng độ AS tăng lên 600 µM biểu protein M lại giảm đi, lượng khuẩn vào nhiều kích hoạt chế hoại tử sản sinh protease phân hủy protein tích lũy Trong thí nghiệm trước Wydro đồng tác giả (2006) mức độ biểu cao protein GFP đạt xâm nhiễm dịch khuẩn bổ sung AS nồng độ từ 450 - 600 µM Vì vậy, nồng độ chất dẫn dụ tốt cho biểu tạm thời gen mã hóa protein M xác định AS = 450 µM Hình Ảnh hưởng nồng độ AS lên biểu protein M M: marker; 1: AS = 0; 2: AS = 450 µM; 3: AS = 600 µM Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M Mật độ tế bào vi khuẩn xác định giá trị quang phổ OD bước sóng 600 nm dịch lỏng vi khuẩn, có liên quan tới sinh khối tế bào chúng hay số lượng tế bào thể tích định Trong nghiên cứu biểu tạm thời, việc xác định mật độ vi khuẩn phù hợp, giai đoạn vi khuẩn sinh trưởng mạnh mẽ có ý nghĩa quan trọng để hiệu chuyển gen cao Để xác định nồng độ khuẩn phù hợp cho biểu tạm thời gen mã hóa protein M, thí nghiệm biến nạp tiến hành với dịch khuẩn có giá trị OD600 khác nhau, kết hợp với điều kiện tối ưu trước đó: sử dụng vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY, nồng độ AS = 450 µM Thu thuốc sau ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số lai Western blot để đánh giá mức độ biểu tạm thời gen mã hóa protein M Hình Ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M M: Marker; 1,2,3: Mẫu xâm nhiễm với nồng độ khuẩn OD600 0,2; 0,5 1, tương ứng Từ kết lai miễn dịch (Hình 5) phân tích phần mềm Image J để so sánh độ đậm băng protein, cho thấy protein biểu tốt nhất, băng đậm nét giếng số tương ứng với dịch khuẩn có giá trị OD600 = 0,5 Dịch khuẩn có giá trị OD600 0,5 297 Nguyễn Thị Minh Hằng et al đến giai đoạn mà sinh trưởng phát triển vi khuẩn pha logarit, vi khuẩn tăng nhanh số lượng lực sinh tổng hợp mạnh mẽ Từ kết thấy rằng, với mật độ vi khuẩn OD600 = 0,5 hoàn toàn phù hợp cho biểu tạm thời gen mã hóa protein M tốt Trong thí nghiệm tối ưu hệ thống biểu tạm thời thuốc N benthamiana Wydro đồng tác giả (2006) đánh giá ảnh hưởng nồng độ khuẩn xâm nhiễm lên biểu tạm thời protein GFP với nồng độ khuẩn thử nghiệm 0,1; 0,5; 1,0 1,5; kết luận không thấy khác biệt đáng kể mức độ biểu protein GFP xâm nhiễm nồng độ khuẩn khác Tuy nhiên, kết nghiên cứu cho thấy nồng độ vi khuẩn ảnh hưởng rõ rệt đến mức độ biểu tạm thời gen mã hóa protein M Ảnh hưởng tuổi sinh lý đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M Tuổi sinh lý ảnh hưởng khơng nhỏ đến q trình biến nạp vector đích vào Với đặc tính lúc non khả sinh trưởng khỏe khả tổng hợp chất cao, già khả sinh trưởng kém, đặc biệt tổng hợp chất diễn chậm Bên cạnh đó, khả xâm nhập vi khuẩn vào non dễ già Vì vậy, thí nghiệm này, vai trò vị trí ảnh hưởng đến q trình biểu protein đích kiểm tra Dịch khuẩn xâm nhiễm vị trí khác mô tả phần phương pháp Thu sau ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số lai Western blot; kết lai Western blot (Hình 6), cho thấy mẫu cho băng có kích thước tương tự kích thước lí thuyết protein M-ELP Phân tích phần mềm Image J để so sánh độ đậm nhạt băng protein, cho thấy băng protein tách chiết từ mẫu bánh tẻ đậm nét nhất, sau đến băng protein tách chiết từ mẫu non cuối băng protein tách chiết từ mẫu già; điều thấy tuổi sinh lý ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu biểu protein tam thời phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium Hình Ảnh hưởng vị trí đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M M: Marker; Mẫu vị trí non (1), bánh tẻ (2), già làm (3) 298 Ảnh hưởng tuổi đến biểu tạm thời gen mã hóa protein M Tuổi liên quan chặt chẽ đến khả xâm nhiễm vi khuẩn mang gen đích, ảnh hưởng đến tổng hợp protein tái tổ hợp sinh khối thu sau xâm nhiễm Vì vậy, dùng cho biểu tạm thời phải đạt tiêu chuẩn số lượng lá, giai đoạn phát triển lá, độ cứng cáp Để xác định tuổi phù hợp, thí nghiệm thiết kế với thuốc có độ tuổi khác nhau; sau biến nạp nuôi ngày, thu lá, tách protein tổng số lai Western blot để kiểm tra mức độ biểu protein Kết lai Western blot (Hình 7), cho thấy tất độ tuổi (3-8 tuần tuổi) sau biến nạp biểu protein; 4, 5, tuần tuổi biểu protein cao nhất, thể băng protein đậm nét màng lai tuần tuổi có mức độ biểu protein thấp Hình 7, Ảnh hưởng tuổi đến biểu gen mã hóa protein M M: Marker; 1,2,3,4,5,6: Mẫu thu từ 3,4,5,6,7,8 tuần tuổi sau tuần chuyển gen KẾT LUẬN Điều kiện tối ưu cho biểu tạm thời gen mã hoá protein M virus PRRS thuốc N benthamiana phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium sử dụng vector hỗ trợ mang gen mã hóa protein Hc-Pro PVY, nồng độ chất dẫn dụ cảm ứng AS 450 µM, mật độ tế bào vi khuẩn sử dụng để xâm nhiễm vào có giá trị OD600 0,5, vị trí cho xâm nhiễm non bánh tẻ, tuổi phù hợp để tiến hành cho xâm nhiễm từ 4-6 tuần tuổi ngày thu mẫu tách chiết protein sau ngày biến nạp Các điều kiện tối ưu áp dụng để biểu hiện, tinh protein M virus PRRS phương pháp biểu gen tạm thời nhờ Agrobacterium nhằm thu lượng lớn protein cho mục đích sản xuất vaccine thực vật phòng chống virus PRRS Lời cảm ơn: Nghiên cứu thực với kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên cứu thường Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 16(2): 293-300, 2018 xun phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học: “Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc N benthamiana phương pháp agroinfiltration” Các thí nghiệm tiến hành có sử dụng trang thiết bị Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Ansari IH, Kwon B, Osori FA, Pattnai AK (2006) Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies J Virol 80: 3994–4004 Baulcombe (2004) RNA silencing in plants Nature (431): 356-363 Bautista EM, Faaberg KS, Mickelson D and McGruder ED (2002) Functional properties of the predicted helicase of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virology 298 (2): 258-270 Bradford MM (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding Anal Biochem 72: 248-254 Daniell H, Streatfield SJ, Wycoff K (2001) Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants Trends Plant Sci 6: 219-226 Du Z, Chen F, Zhao Z, Liao Q, Palukaitis P, Chen J (2008) The 2b protein and the C-terminus of the 2a protein of cucumber mosaic virus subgroup I strains both play a role in viral RNA accumulation and induction of symptoms Virology 380: 363-370 Duan CG, Fang YY, Zhou BJ, Zhao JH, Hou WN, Zhu H, Ding SW, Guo HS (2012) Suppression of Arabidopsis ARGONAUTE1-mediated slicing, transgene-induced RNA silencing, and DNA methylation by distinct domains of the Cucumber mosaic virus 2b protein Plant Cell 24: 259–274 Fagard M, Vaucheret H (2000) (Trans)gene silencing in plants: how many mechanisms? Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51: 167-194 Meulenberg JM, Peter Sen-Den Besten A, Kluyver EP, Moormann RJM, Schaaper WMM, Wensvoort G (1995) Characterization of proteins encoded by ORFs to of Lelystad virus Virology 206:155-163 Nguyễn Thị Minh Hằng, Hồ Thị Thương, Nguyễn Thu Giang, Phạm Thị Vân, Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Trung Nam, Chu Hồng Hà (2017) Biểu tinh protein m virus prrs gây bệnh lợn tai xanh công nghệ biểu tạm thời thuốc Nicotiana benthamiana Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3): 547-554 Ostrowski M, Galeota JA, Jar AM, Platt KB, Osorio FA, Lopez OJ (2002) Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain J Virol 76: 4241-4250 Phan HT (2012) ELPylated avian flu vaccines from plants: Improvement of expression and development of a new purification strategy PhD Dissertation, IPK, Gatersleben, Germany Plagemann PG (2004) GP5 ectodomain epitope of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, strain Lelystad virus Virus Res 102: 225-230 Scheller J, Leps M, Conrad U (2006) Forcing single-chain variable fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like polypeptids Plant Biotechnol J 4: 243-249 Stephan D, Slabber C, George G, Ninov V, Francis KV and Burger JT (2011) Visualization of plant viral suppressor silencing activity in intact leaf lamina by quantitative fluorescent imaging Plant Methods 186: 1746-4811 Verwoerd TC, van Paridon PA, van Ooyen AJ, van Lent JW, Hoekema A, Pen J (1995) Stable accumulation of Aspergillus niger phytase in transgenic tobacco leaves Plant Physiol 109: 1199-1205 Wagner B, Fuchs H, Adhami F, Ma Y, Sc Verwoerd heiner O, Breiteneder H (2004) Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana Methods 32: 227-234 Wydro M, Kozubek E, Lehmann P (2006) Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana Regular Paper 53: 289-298 Zhang X, Du P, Lu L, Xiao Q, Wang Q, Cao X, Ren B, Wei C, Li Y (2008) Contrasting effects of HC-Pro and 2b viral suppressors from Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovir us on the accumulation of siRNAs Virology 374: 351-360 299 Nguyễn Thị Minh Hằng et al OPTIMIZATION OF EXPRESSION CONDITIONS OF GENE ENCODING ANTIGEN M OF PRRSV IN LEAVES OF NICOTIANA BENTHAMIANA BY AGROINFILTRATION METHOD Nguyen Thị Minh Hang1,2, Ho Thi Thuong1, Nguyen Thu Giang1, Pham Bich Ngoc1,3, Nguyen Trung Nam1,3, Chu Hoang Ha1,3 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology College of Forestry Biotechnology, Vietnam National University of Forestry Graduate University of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology SUMMARY Reproductive disorders and respiratory swine (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) is an infectious disease caused by the PRRS virus (PRRSV), spread fast speeds, causing mass death when infected pigs M protein is one of the major structural protein of the PRRSV, has a molecular weight of about 19 kDa, encoded by the open reading frame (ORF6), which is used to design a subunit vaccine against back PRRSV In this study, conditions for transient expression of the gene encoded the M protein of PRRSV in leaves of the Nicotiana benthamiana by agroinfiltration method were determined The results show that optimal conditions for transient expression of protein M in the leaf are used the simultaneous of the A tumefaciens strain containing vector carrying the gene encoding the protein M and A tumefaciens containing vector carrying gene encoding supported protein HC-Pro PVY, concentration of acetosyringone with 450 µM, the bacterial cell density used to infect into leaf with OD600 is 0.5, The physiological age of the leaf suitable for infecting bacteria was young leaf and mature leaf of tobacco plants to weeks of age, and the transient expression time of gene encoding protein M of PRRSV in tobacco leaves is most effective days after infecting This agroinfiltration method can be used to express large amounts of protein - antigen M of PRRSV in tobacco plants to produce vaccines against this virus Keywords: Agroinfiltration, Nicotiana benthamiana, protein M, PRRSV, transient expression 300 ... cho biểu t m thời gen m hóa protein M tốt Trong thí nghi m tối ưu hệ thống biểu t m thời thuốc N benthamiana Wydro đồng tác giả (2006) đánh giá ảnh hưởng nồng độ khuẩn x m nhi m lên biểu t m thời. .. nhi m virus vi khuẩn (Daniell et al., 2001) Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu tối ưu điều kiện biểu t m thời gen m hóa cho protein M virus PRRS thuốc (Nicotiana benthamiana) Hệ thống biểu. .. chuyển gen KẾT LUẬN Điều kiện tối ưu cho biểu t m thời gen m hoá protein M virus PRRS thuốc N benthamiana phương pháp th m lọc nhờ Agrobacterium sử dụng vector hỗ trợ mang gen m hóa protein Hc-Pro