Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên gp120 của vi rút HIV type b

1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện để biểu hiện gen gp120 phân type B của HIV lưu hành ở Việt Nam.2. Đã biểu hiện thành công gen mã hóa protein gp120 ở vi khuẩn và đã tìm được điều kiện tối ưu để biểu hiện.3. Đã tinh sạch được kháng nguyên GP120 phân type B có độ tinh sạch. Sau khi tinh sạch kháng nguyên vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên, phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng HIV tự nhiên trong huyết thanh bệnh nhân HIV dương tính.

Dntp 2’-deoxyribonucleoside 5’-triphosphate

LBA Lauria broth containing ampicillin

PVDF Polyvinylidene difluoride

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphat-Polyacrylamide gel

electrophoresis

MỞ ĐẦU Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đương đầu với đại dịch HIV/AIDS

Virus HIV sau khi xâm nhiễm sẽ làm suy giảm miễn dịch khiến cơ thể không

còn sức đề kháng với mọi bệnh tật, cơ thể suy kiệt dần và dẫn tới tử vong

HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cướp đi hàng triệu sinh mạng trên thế giới

mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng đến mọi khía cạnh của đời sống xã

hội làm ảnh hưởng tới kinh tế, văn hoá, xã hội, nòi giống của mỗi quốc gia Kể

từ khi phát hiện bệnh (6/1981) cho tới nay, AIDS đã cướp đi mạng sống của 40,3

triệu người trên thế giới và trở thành một trong những căn bệnh gây chết người

nhiều nhất trong lịch sử nhân loại Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới

(WHO), HIV/AIDS đang được xếp hàng thứ 3 trong các nguyên nhân gây tử

vong (chiếm 7,5%) ở các nước đang phát triển Việt Nam hiện đang được xếp

vào danh sách các nước có tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS cao trên thế giới, và là nước

có số người nhiễm HIV cao thứ 6 Châu Á Số lượng người nhiễm HIV/AIDS gia

tăng kéo theo nhu cầu chăm sóc và hỗ trợ ngày càng tăng

Cho đến nay vẫn chưa có vaccine phòng bệnh, mặt khác thuốc điều trị

HIV/AIDS được sử dụng rất hạn chế vì giá thành quá cao, và sự gia tăng tính

kháng thuốc Việc chẩn đoán, sàng lọc chính xác các trường hợp dương tính để

có hướng dự phòng và điều trị là một khâu mang tính then chốt trong phòng

chống HIV Các kit chẩn đoán HIV hiện nay phải nhập ngoại 100% với giá

thành cao, rất khó kiểm soát độ nhạy, độ đặc hiệu, mất công vận chuyển tốn kém

và không chủ động sản xuất để sử dụng trên diện rộng với hàng triệu mẫu máu

cần kiểm tra Để phù hợp với các phân type HIV lưu hành tại Việt Nam, cần

nghiên cứu sản xuất các kit chẩn đoán dựa trên type virus tại nước ta

Với đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên gp120 của

virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam”; chúng tôi hi vọng có thể phục

vụ cho việc sản xuất các kit chẩn đoán HIV cho bệnh nhân tại Việt Nam có độ

chính xác tuyệt đối và độ nhạy cao

Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện

Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải HIV/AIDS

1.1.1 Định nghĩa

AIDS (Acquired Immuno Deficiency Syndrom) là một hội chứng của nhiều

bệnh nhiễm trùng cơ hội (lao, viêm phổi, nấm, ung thư, viêm da, lở loét toàn

thân hoặc suy kiệt - những bệnh này nặng dần lên có thể dẫn đến cái chết), mà

người nhiễm HIV gặp phải do hệ miễn dịch của cơ thể bị tổn thương hoặc bị phá

hủy nặng nề AIDS được coi là giai đoạn cuối của quá trình nhiễm HIV Tuy

nhiên, mỗi người khi mắc AIDS sẽ có những triệu chứng khác nhau, tùy theo

loại bệnh nhiễm trùng cơ hội mà người đó mắc phải, và khả năng chống đỡ của

hệ miễn dịch mỗi người [24] [35]

Khi virus HIV xâm nhập vào trong cơ thể người, sẽ gây đáp ứng miễn dịch

thứ phát do mất tế bào lympho T CD4

(hỗ trợ) Các tế bào CD4 + T-lymphocyte đóng một vai trò thiết yếu đối với sự hoạt động của hệ thống miễn dịch Suy

giảm miễn dịch do mất tế bào T CD4

dẫn đến nhiễm trùng cơ hội và ung thư Ở người bình thường, lượng tế bào TCD4

tương đối cao Khi virus HIV xâm nhập thì lượng tế bào này bắt đầu giảm xuống tuy nhiên vẫn giữ ở mức cao, trên 500

bị AIDS, nạn nhân thường chết sau 18-24 tháng [4]

1.1.2 Sự xuất hiện của HIV/AIDS

Năm 1959, tại Zaize - châu Phi, lần đầu tiên phát hiện HIV dương tính trong

mẫu máu của bệnh nhân Tháng 3/1981 nhiều trường hợp ung thư da Kaposi

được báo cáo ở New York; nguyên nhân của tình trạng này lúc đó chưa được

biết Tháng 6/1983, Luc Montagnien và Barré Sinousi đã phân lập được virus

gây bệnh và đặt tên là LAV (Lymphadenopathy asoociated virus – virus liên

quan đến bệnh hạch) Năm 1984, Robert Gallot đã phân lập được 1 virus có ái

tính với Lympho T của người nên đặt tên là HTLV type III (Human

lymphotrophic virus type III) Cùng năm đó Levy đã phân lập được 1 virus có

liên quan đến hội chứng suy giảm miễn dịch và đặt tên là ARV (AIDS related

virus) Đến năm 1986, cả 3 được thống nhất gọi là virus gây bệnh suy giảm miễn

dịch trên người, viết tắt là HIV-1 Năm 1985, Barin và cộng sự phân lập được

HIV thứ 2 ở Tây Phi, đặt tên là HIV-2 HIV-2 có những đặc tính rất giống với

virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ viết tắt là SIV cũng ở Tây Phi [12][24]

Trên huyết thanh cất giữ và nay khi thử lại với HIV-1, HIV-2 thì huyết thanh

của người mắc bệnh ở Zaire cất giữ từ năm 1959 đã dương tính với 1

HIV-1 cũng đã được phân lập trên HIV-1 bệnh phẩm của bệnh nhân ở Zaire cất giữ từ năm

1976 Trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ học thì HIV-2 có thể đã có ở Tây Phi từ năm

1966 Như vậy, có thể giả định HIV đã xuất hiện từ những năm 60 của thế kỷ

này hoặc trước đó vài trục năm Nhưng đến thập kỉ 80 mới bùng phát thành đại

dịch HIV/AIDS [12][20]

1.1.3 Tình hình dịch bệnh

1.1.3.1 Tình hình dịch bệnh trên thế giới

Theo UNAIDS, ước tính đến cuối năm 2009, đầu năm 2010; trên thế giới có

khoảng 65 triệu người đã nhiễm HIV/AIDS trong đó, khoảng 25 triệu người đã

chết vì căn bệnh này; 40,3 triệu người đang chung sống với HIV/AIDS Hàng

năm có khoảng 1,8 triệu người đã tử vong do các bệnh liên quan đến AIDS Con

số tử vong lên đến đỉnh điểm khoảng năm 2004, và do sự mở rộng của điều trị

kháng virus, và giảm 19% từ năm 2004 đến năm 2009 Đến đầu năm 2010, có

16.600.000 trẻ mồ côi do AIDS Khoảng một nửa số người nhiễm HIV ở độ tuổi

25 AIDS là nguyên nhân thứ hai gây tử vong nhiều nhất trong độ tuổi 20-24 trên

thế giới [33]

Hình 1.1: Sơ đồ phân bố số lượng người nhiễm HIV/AIDS trên thế giới 2009

Tổng số người nhiễm HIV hàng năm vào khoảng 2,5 triệu Mỗi ngày có gần

13.000 người nhiễm HIV trong đó có 50% là phụ nữ, 50% là thanh thiếu niên độ

tuổi 15-24 Đặc biệt, theo báo cáo của Liên hợp quốc: Trong những năm trở lại

đây, phụ nữ đang trở thành đối tượng có HIV ngày càng nhiều hơn nam giới, và

nguy cơ mắc HIV ở phụ nữ ngày càng lớn hơn nam giới [33]

Các khu vực khác trên thế giới như Tây, Trung, Đông Âu, Trung Á và Bắc Mỹ

có tỉ lệ nhiễm mới là tương đối ổn định trong vòng 5 năm trở lại đây Ở Châu Á có

khoảng 1 triệu người nhiễm mới mỗi năm; chiếm 20% số trường hợp nhiễm mới

trên toàn thế giới [15] [22]

Hình 1.2 : Sơ đồ số lượng người đang sống chung với HIV từ năm 1990-2009

trên thế giới

1.1.3.2 Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam

Tính đến ngày 31/12/2010, đại diện Cục Phòng chống HIV/AIDS Việt Nam

cho biết: Số trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống là 183.938 người Số bệnh nhân

AIDS hiện tại là 44.938 người Số người nhiễm HIV đã tử vong là 49.477 trường

hợp [37] Tính riêng trong 9 tháng đầu năm 2010, toàn quốc đã phát hiện được

9.128 người nhiễm HIV, 3.841 bệnh nhân AIDS và 1.498 người tử vong do AIDS

Việt Nam ước tính đến năm 2011 có khoảng 311.500 người bị nhiễm căn bệnh thế

kỷ này [33]

Số lượng người nhiễm HIV/AIDS tập trung chủ yếu ở các thành phố lớn và điển

hình là thành phố Hồ Chí Minh với 42.454 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống,

tiếp theo là Hà Nội với 16.830 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Thái Nguyên

với 5.206 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống….[1] [2] Cho đến hết 11/2010, đã

có trên 74% số xã, phường và 97,8% số quận/huyện trong toàn quốc đã có số người

nhiễm HIV/AIDS [3]

Phương thức lây truyền HIV ở nước ta chủ yếu là qua đường tình dục và tiêm

chích ma túy Phân tích hình thái nguy cơ lây nhiễm cho thấy, trong số những

người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 9 tháng đầu năm 2010 có 49% bị

nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10%

không rõ đường lây [2][3]

Hình 1.3: Ước tính số trường hợp nhiễm HIV/AIDS tại TP.HCM và Việt Nam từ

âm đạo, máu, các yếu tố đông máu, huyết tương, nước bọt, nước tiểu, dịch não tủy,

nước mắt và sữa mẹ Tuy nhiên chỉ có 3 phương thức lây truyền được xác định là:

- HIV qua đường tình dục khác giới chiếm 71%, qua đường tình dục đồng giới

(nam) chiếm 15% Nguy cơ lây nhiễm HIV tăng lên khi có bệnh lý gây viêm

nhiễm ở bộ phận sinh dục, có vết sây xát xảy ra khi giao hợp hoặc có quan

hệ tình dục với nhiều người

- Lây truyền qua đường máu: Do truyền máu và các sản phẩm của máu, ghép

tạng… không kiểm soát được HIV, do dùng chung bơm, kim tiêm (nguy cơ

cao với người tiêm chích ma túy), do dùng chung kim châm cứu, kim xăm da

v…v…

- Lây truyền từ mẹ sang con: Người mẹ nhiễm HIV có thể truyền cho con

trong thời kỳ mang thai, trong khi đẻ và cũng được xác nhận có thể lây sau

khi đẻ do trẻ bú sữa mẹ

Ngoài các phương thức lây truyền như trên, hiện nay chưa xác định được các

phương thức lây khác như đường hô hấp, qua muỗi hoặc côn trùng đốt, hôn, dùng

chung bát đũa…… [5]

1.1.4.2 Cơ chế sinh bệnh

HIV có ái tính chủ yếu với tế bào lympho TCD4 Ngoài ra HIV còn có thể xâm

nhập vào nhiều loại tế bào khác nhau như: Lympho bào B, đại thực bào, tế bào

nguồn, tế bào hình sao, tế bào xơ non…v v… HIV gây hủy diệt các tế bào TCD4

, do vậy dẫn đến suy giảm miễn dịch bao gồm cả miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch

thể Các rối loạn chính trong đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS

gồm:

- Giảm tế bào lympho T toàn phần, đặc biệt là CD4 giảm nặng, tỷ lệ

CD4/CD8 giảm (< 1)

- Giảm chức năng các tế bào miễn dịch: giảm hoặc mất đáp ứng da, giảm khả

năng tăng sinh tế bào đối với các chất gây phân bào và kháng nguyên, giảm

đáp ứng độc tế bào do giảm chức năng tế bào CD8 và tế bào NK (tế bào giết

tự nhiên)

- Tăng gamma globulin

- Tăng phức hợp miễn dịch, tăng các tự kháng thể và một số protein khác

trong huyết thanh

- Giảm đáp ứng kháng thể nguyên phát đối với các kháng nguyên mới tiếp xúc

lần đầu

- Giảm gamma interferon [5]

Hậu quả của các rối loạn đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS là

bệnh nhân bị các bệnh nhiễm trùng cơ hội (thường do các vi khuẩn, virus, nấm, ký

sinh trùng sinh sản trong tế bào) hoặc mắc các loại ung thư đặc biệt (Sarcoma

Kaposi) Thời gian trung bình từ khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS

khoảng 10 – 12 năm Sự tiến triển rất khác nhau giữa các bệnh nhân, phụ thuộc vào

cơ thể bệnh nhân, yếu tố virus và tác dụng của điều trị Mỗi giai đoạn bệnh liên

quan chặt chẽ đến số lượng tế bào CD4 [5]

Bảng 1.1: Số lượng tế bào T CD4+ trong máu ở các giai đoạn nhiễm bệnh

Giai đoạn Lƣợng tế bào T CD4+

trong máu

Bình thường 450 – 1280 tế bào/mm3 máu

Có suy giảm miễn dịch < 400 tế bào/mm3

máu Suy giảm miễn dịch trầm trọng

(chuyển sang AIDS)

< 200 tế bào/mm3

máu

1.1.4.3 Các giai đoạn của quá trình nhiễm HIV/AIDS

Tiến triển từ nhiễm HIV đến AIDS là một quá trình kéo dài Do vậy các biểu

hiện lâm sàng rất phức tạp và tùy thuộc các giai đoạn khác nhau Năm 1986, CDC

(Center Diseases Control and Prevention) – Hoa Kỳ đã phân loại quá trình nhiễm

HIV/AIDS thành các giai đoạn [10]

- Giai đoạn 1: Giai đoạn sơ nhiễm (hay giai đoạn cửa sổ);

- Giai đoạn 2: Nhiễm HIV không kèm triệu chứng (giai đoạn thầm lặng);

- Giai đoạn 3: Nhiễm HIV có triệu chứng (giai đoạn hội chứng hạch dai dẳng);

- Giai đoạn 4: Giai đoạn AIDS Trong giai đoạn này chia thành 2 thời kỳ:

Phức hợp cận AIDS và AIDS thực sự

1.2 Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human immune deficiency virus –

HIV)

1.2.1 Nguồn gốc HIV

Hiện nay, hầu hết các nhà khoa học cho rằng virus HIV có nguồn gốc từ virus

SIV (virus gây nội dịch không kèm triệu chứng ở nhiều loài khỉ tại Châu Phi)

Khảo sát tiến hành năm 1999 tại Đại học Alabama nhận thấy rằng HIV-1 rất giống

SIV tinh tinh (SIVcpz); và virus này đã có lúc vượt qua được giới hạn loài để đi từ

tinh tinh sang người Họ đưa ra kết luận rằng tinh tinh hoang dã đã bị nhiễm cùng

lúc 2 chủng SIV khác nhau, 2 chủng này “giao phối “ và sinh ra 1 chủng virus thứ

3, chủng tứ 3 này có thể đã được lây sang những con tinh tinh khác, và điều đáng

chú ý hơn, là chủng này có khả năng gây nhiễm cho người và gây ra AIDS [32]

Sau 17 năm nghiên cứu thực địa tại các vùng Đông, Tây, Xích đạo châu Phi, các

nhà khoa học đã chứng minh có ít nhất có 40 loài khỉ khác nhau bị nhiễm với 40

type SIV khác nhau; 3 nhóm HIV-1 và 8 phân type HIV-2 khác nhau là kết quả của

11 biến cố nhảy sang loài khác, trong đó có sự tham gia của 8 loài khỉ mặt xanh và

3 tinh tinh đối với tất cả các trường hợp gây nhiễm ở người Họ cũng kết luận rằng

3 nhóm HIV-1 (M, N và O) đều phát xuất từ SIV tìm thấy ở loài tinh tinh

chimpanzee, và mỗi nhóm đại diện cho 1 biến cố "nhảy" (crossover) riêng rẽ từ loài

tinh tinh sang người [32] HIV-2 tương ứng với SIVsm, là 1 chủng của SIV tìm

thấy ở loài khỉ mặt xanh (sooty mangabey), là loài khỉ bản địa vùng Tây Phi Type

HIV-1, có độc lực mạnh hơn, gây đại dịch nhiều hơn Tuy nhiên, chủng virus này

vẫn còn có một số khác biệt với HIV ở nhiều điểm quan trọng [12][18]

Hình1.4: Nguồn gốc các type HIV

1.2.2 Vài nét về virus HIV

Virus HIV là 1 retrovirus; thuộc họ retroviridae HIV thuộc nhóm Lentivirus

Mang đặc điểm của retrovirus

- Là loại RNA virus có enzyme phiên mã ngược mà bản chất là DNA

polymerase phụ thuộc vào RNA Enzyme phiên mã ngược này cho phép

tổng hợp DNA kép trong tế bào retrovirus thâm nhập

- DNA mới được tạo ra đều có những đoạn tự lặp lại, có kích thước khác nhau

được gọi là đoạn cuối dài tự lặp lại, nhờ vậy mà gắn được một cách ổn định

trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ và trở thành một tiền virus (provirus)

Tiền virus này sẽ như một gen của tế bào và truyền sang cho thế hệ khác khi

có sự phân bào, hoặc được phiên mã thành RNA thông tin, tổng hợp protein

của virus để hình thành một virus hoàn chỉnh [10]

Mang đặc điểm của Lentivirus

- Phát triển chậm

- Không biến đổi tế bào nhưng lại làm tiêu hủy tế bào

- Cấu trúc kháng nguyên dễ biến đổi [10]

1.2.3 Phân loại và phân type

HIV là 1 virus có tính thay đổi cao, đột biến dễ dàng Điều này có nghĩa là ngay

trong cơ thể của 1 người bị nhiễm cũng có nhiều chủng HIV Dựa trên những điểm

tương tự về di truyền, ta có thể phân loại vô số các chủng virus khác nhau đó thành

type, nhóm và phân type

Hình1.5: Sơ đồ phân type virus HIV

Có 2 type HIV [21]:

 HIV-1: Là loại virus chủ yếu gây nên đại dịch AIDS trên toàn thế giới; và

được phân thành 4 nhóm

 HIV-2: tập trung ở Tây Phi và hiếm khi được tìm thấy ở nơi khác HIV-2 có

8 phân type; bao gồm: A, B, C, D, E, F, G, H

Cả 2 type đều lây truyền qua quan hệ tình dục, qua đường máu, và từ mẹ sang

con; đều gây bệnh cảnh lâm sàng AIDS khá giống nhau và khó phân biệt Tuy

nhiên, HIV-2 không dễ lây như HIV-1, và thời gian kể từ lúc mới bắt đầu nhiễm

cho đến khi xuất hiện bệnh ngắn hơn trường hợp HIV-1 HIV-1 gây nên đại dịch

trên toàn thế giới; khi nhắc đến HIV mà không đề cập đến loại virus, thì chỉ chung

HIV-1 [21]

Các chủng HIV-1 có thể được phân thành 4 nhóm: nhóm “M” (major= chính);

nhóm “O” (outlier= ngoài rìa); nhóm “N” (new= mới hoặc non- M non- O); và

nhóm P (một chủng mới, có quan hệ rất gần với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ

được phát hiện ở người phụ nữ Cameroon vào năm 2009) Nhóm O dường như chỉ

xuất hiện tại vùng Tây Phi, còn nhóm N cực kỳ hiếm, chỉ mới được phát hiện năm

1998 tại Cameroon Trên 90% các trường hợp nhiễm HIV-1 đều thuộc nhóm M

Trong HIV-1 nhóm M, có ít nhất là 9 phân type (subtype hoặc clade) Những phân

type đó là A, B, C, D, F, G, H, J và K [12] [22]

Đôi khi 2 virus thuộc 2 phân type khác nhau cùng hiện diện trong tế bào của

người nhiễm và chúng hoà trộn các chất liệu di truyền để tạo thành 1 virus lai

(hybrid) mới Những chủng nào gây nhiễm được cho người khác sẽ được gọi là

CRFs (các thể tái tổ hợp lưu thông = circulating recombinant forms) Hiện nay đã

phát hiện có đến 30 CRF [22]

Các phân type HIV -1, CRF được phân bố không đều trên thế giới, trong đó các

phân type B và C phân bố rộng rãi nhất Phân type C chủ yếu gặp tại miền đông và

Nam Châu Phi, Ấn độ và Nepal và gây ra các vụ dịch HIV nặng nề nhất; khoảng

một nửa các trường hợp nhiễm hiện nay là do phân chủng này

Hình1.6: Phân bố các phân type HIV-1 M theo vùng địa lý ( 2008 )

Về mặt lịch sử, phân type B là phân type thường gặp nhất tại châu Âu, châu Mỹ,

Nhật, và châu Úc Hiện nay ít nhất 25 % những trường hợp mới nhiễm tại châu Âu

là do các phân type mới khác Ở Việt Nam, 97% số người nhiễm HIV là do virus

phân type CRF01_AE; còn lại là các phân type B; và một phần rất nhỏ các type

khác [32]

1.2.4 Đặc điểm của virus HIV

1.2.4.1 Đặc điểm về hình thái

Virus HIV có dạng hình cầu, đường kính 80-120nm Hạt virion có hình dạng

khối đa diện, với 20 mặt tam giác đều, đối xứng [10]

Hình1.7: Cấu trúc virus HIV

Từ ngoài vào trong cấu tạo virus gồm 3 lớp:

- Lớp vỏ: Là một màng lipid kép có những gai nhú khoảng 72 cái (theo lý

thuyết Gelderblom) Gai nhú là một glycoprotein có độ dài 9-10 nm và chiều

rộng 14nm có trọng lượng phân tử 120 kDa, vì vậy được đặt tên là protein

gp120 Gắn với gai nhú màng ngoài lipid kép là các glycoprotein xuyên

màng có trọng lượng phân tử 41kDa và ký hiệu là gp41 [12]

- Protein nền (matrix protein): ngay sát lớp vỏ có một lớp protein nền được tạo

thành từ các phân tử protein p17 [10]

- Lõi capsid: lõi hình trụ hơi lệch tâm cũng có một vỏ bọc protein (P24) , trong

nhân có bộ gen gồm hai sợi RNA có gắn enzyme sao mã ngược, một phân tử

RNA thông tin và các protein khác là P7 và P9 [10][12]

Hình 1.8: Vị trí các protein trong virus HIV

1.2.4.2 Cấu trúc gen và chức năng

Vật chất di truyền của HIV là sợi 2 RNA đơn (+) giống nhau Mỗi sợi dài 8,5 –

9,5 kb; có khoảng 9200 cặp bazơ với hai nhóm gen: nhóm gen cấu trúc và nhóm

gen điều hòa sinh trưởng [10]

Hình 1.9: Cấu trúc genome của virus HIV-1

Nhóm gen cấu trúc

 gag (group-specific antigen): mã hóa các kháng nguyên đặc hiệu nhóm gồm

các protein cấu trúc bên trong : p17 (protein nền MA, tương tác với gp41);

p24 (protein lõi CA); p6 (protein lõi, gắn với Vpr); p7 (nucleocapsit NC,

gắn với ARN p1 và p2) [10]

 pol (polymerase): mã hóa cho các enzyme: protease (p10: phân cắt

polyprotein Gag và Gag-Pol), Reverse transcriptase (p66 và p51: có bản chất

là DNA polymerase phụ thuộc RNA và protein p66 có hoạt tính Rnase H) và

Integrase (cài xen provirus vào nhiễm sắc thể tế bào chủ) [10]

 env (envelope): mã hóa cho các protein vỏ gp120 (protein vỏ SU, giúp virus

gắn xâm nhập vào tế bào chủ); gp41 (protein xuyên màng TM, đóng vai trò

chính trong quá trình dung hợp tế bào) [10]

Nhóm gen điều hòa

 tat: mã hóa cho protein tat (Trans Acivator of Transcription – yếu tố hoạt

hóa phiên mã), có vai trò quan trọng trong sự tăng cường phiên mã[14]

 rev: mã hóa cho protein rev (Regulator of Expression of Virion proteins –

yếu tố điều hòa sự biểu hiện các protein của virus), tăng cường biểu hiện các

RNA không được cắt nối và các RNA cắt nối một lần Rev được tích lũy

trong nhân và chuyển virus từ pha tổng hợp protein sớm sang pha tổng hợp

protein muộn bằng cách gắn với yếu tố RRE (Rev Response Element : yếu tố

phản ứng Rev) có trong các bản sao RNA virus không được cắt nối và được

cắt nối một lần [10][14]

 nef : mã hóa cho protein nef (Negative Regulator Factor - yếu tố điều hòa

âm), ức chế hoặc tăng cường sự tái bản virus, phụ thuộc vào chủng và loại tế

bào Trong các tế bào nhiễm, nef sẽ thay đổi con đường vận chuyển

endosome, qua đó giảm sự biểu hiện các protein CD4, MHC I và MHC II ở

bề mặt tế bào nhiễm Những thay đổi này có thể bảo vệ các tế bào nhiễm

HIV khỏi sự giám sát miễn dịch [14]

 vif : mã hóa protein vif (Virion Infectivity Factor – yếu tố lây nhiễm của

virus), làm tăng tính thâm nhập của virus vào các tế bào chủ tự do và giúp

ngăn cản sự xâm nhập của các enzyme tế bào chủ kìm hãm sự tái bản virus

vào các virion mới hình thành [10]

 vpu : mã hóa protein vpu (Viral Protein U : protein U của virus), có tác dụng

tăng cường sự giải phóng virus khỏi tế bào, làm giảm sự biểu hiện của CD4,

MHC I trên bề mặt tế bào [10]

 vpr: mã hóa protein vpr (Viral Protein R : protein R của virus), có tác dụng

tăng cường sự tái bản virus trong các tế bào ban đầu, là tín hiệu định vị nhân

[14][21]

1.2.5 Chu trình sống của virus HIV

Sau thời gian bị nhiễm virus, những tế bào bị nhiễm virus sẽ di chuyển đến tổ

chức lympho ngoại vi, tại đây virus nhân lên nhanh chóng Quá trình này diễn ra

qua các giai đoạn theo sơ đồ vòng đời của virus HIV (Hình 1.10), bao gồm các giai

đoạn:

Giai đoạn bám và gắn kết vào mặt tế bào: HIV bám vào bề mặt tế bào cảm thụ

nhờ sự phù hợp giữa thụ thể đặc hiệu tế bào gp120 của virus Trong đa số các

trường hợp, các thụ thể này là các phân tử CD4 của tế bào lympho T hỗ trợ hoặc

một số tế bào khác như bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào dòng

lympho [10][12]

Giai đoạn xâm nhập và chui vào tế bào: Nhờ phân tử CD4 và các đồng thụ thể

CCR5 với đại thực bào và CXCR4 với tế bào lympho T, virus được hòa màng vỏ

của HIV với màng tế bào và xâm nhập vào tế bào chủ [10]

Hình 1.10: Vòng đời của virus HIV Giai đoạn cởi bỏ vỏ và tiến hành sao chép ngược: Enzyme Reverse Transcriptase

sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA kép từ khuôn RNA genome virus DNA

kép được tạo ra từ sự phiên mã ngược (provirus-tiền virus) dài hơn RNA genome

Mỗi đầu có trình tự U3-R-U5, được gọi là đoạn lặp dài ở đầu chuỗi (LTR: long

terminal repeat) LTR chứa hầu hết các tín hiệu điều hòa phiên mã, chứa một

promoter, một đoạn tăng cường (enhancer), các tín hiệu kết thúc phiên mã và tín

hiệu gắn đuôi polyA Quá trình sao chép ngược này có thể bị lỗi và dẫn đến xuất

hiện các đột biến Những đột biến như vậy có thể gây ra sự kháng thuốc [10][12]

Giai đoạn nhân lên: Nhờ các tín hiệu định vị nhân, DNA chuỗi kép chui vào nhân

tế bào qua lỗ nhân Dưới tác dụng của enzyme Integrase và sự có mặt của đoạn

LTR, DNA chuỗi kép sẽ được gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ DNA virus

được tích hợp này sau đó có thể nằm yên không hoạt động trong giai đoạn tiềm

tàng của quá trình xâm nhiễm HIV.Tiền virus cũng có thể phiên mã để tạo thành

RNA genome và các mRNA dùng trong quá trình tạo thành virus mới.Trong quá

trình phiên mã, nhờ RNA-pol II của tế bào, tiền virus được tích hợp sẽ được phiên

mã thành các bản sao RNA Bản phiên mã ban đầu có chiều dài gần bằng RNA

monomer (khoảng 9,3kb) Sau đó một phần được gắn đuôi polyA ở đầu 3’ và gắn

mũ methylguanin ở đầu 5’ tạo thành các mRNA để dịch mã tạo các protein, phần

còn lại không được gắn mũ và đuôi polyA sẽ đóng vai trò làm RNA genome của

virus con cháu [12]

Giai đoạn nảy chồi: Từ các thành phần đã được tổng hợp, các hạt HIV mới được

lắp ráp bắt đầu ở màng sinh chất của tế bào chủ Protein env (GP160) bắt đầu được

glycosyl hóa ở màng lưới nội chất có hạt và được vận chuyển vào phức hệ Golgi

Tại đây, chúng tiếp tục được glycosyl hóa và phức hợp trimer của gp160 được hình

thành trước khi bị enzyme Protease của tế bào chủ trong bộ máy Golgi phân cắt

thành 2 glycoprotein vỏ gp41 và gp120 và được vận chuyển đến màng sinh chất

Các polyprotein gag và gag-pol cũng liên kết với bề mặt bên trong của màng sinh

chất, đồng thời cũng gắn với RNA genome của HIV khi hạt virus bắt đầu nảy chồi

ra từ tế bào vật chủ Trong hoặc sau khi nảy chồi, Protease của HIV sẽ phân cắt các

polyprotein gag và gag-pol thành các enzyme và protein cấu trúc của HIV Giai

đoạn phân cắt có thể bị ức chế bởi Protease Các thành phần cấu trúc khác nhau sau

đó được lắp ráp lại tạo thành hạt HIV trưởng thành [12]

Giai đoạn trưởng thành: Các hạt virus nảy chồi giải phóng khỏi tế bào và tiếp tục

gây nhiễm cho những tế bào mới [10]

1.1.6 Glycoprotein vỏ gp 120 của virus HIV

Gp120 là tên của các glycoprotein hình thành các gai nhô ra khỏi một hạt virus

HIV; và có 3 chức năng: Tìm các thụ thể thích hợp cho sự xâm nhập của virus; gắn

hạt virus với tế bào; trợ giúp và chỉ dẫn sự tiêm các vật liệu virus, trong đó chức

năng chính là liên kết với thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào người [15]

Gp120 có kích thước khoảng 1500 nucleotide (1,5kb), và được tổng hợp từ

khoảng 500 acid amin 3 phân tử gp 120 kết hợp như các heterdimer với một phân

tử glycoprotein xuyên màng (gp 41), tạo thành một cấu trúc trimer để hình thành

gai vỏ Vị trí liên kết CD4 của gp 120 bao gồm 400-430 acid amin [15]

Hình 1.11: Mô hình 1 gai trên bề mặt virus HIV

GP 120 có bản chất glycoprotein, được mã hóa bởi gen vỏ env Gen env được

dịch mã trong màng lưới nội chất có hạt từ các mRNA đã được cắt nối thành một

polyprotein (gp 160) Tại đây, phân tử polyprotein mới hình thành được glycosyl

hóa một phần và được vận chuyển đến bộ máy Golgi, nơi chúng sẽ bị protease của

tế bào chủ (furin) cắt ra thành các phân tử SU (gp120) và TM (gp41) [12]

Hình1.12: Quá trình tổng hợp gp120 trong tế bào

Glycoprotein gp120 không có domain xuyên màng Trình tự mã hoá gp120 ở

những chủng HIV khác nhau có biến đổi cao Sự biến đổi này có thể do biến đổi

sắp xếp ở 5 domain siêu biến (V1-V5); 5 domain siêu biến này tương ứng nằm ở

các vị trí từ acid amin thứ 128-152; từ 182-195; từ 300-330; từ 395-415; từ

460-467 [21]

Hình 1.13: gp120 có 5 domain siêu biến (V1-V5)

Trong đó vùng siêu biến thứ 3, gọi là vòng V3 đặc biệt quan trọng Vùng này

khoảng 30 amino acid được tạo bởi cầu nối disulfide giữa 2 Cystein sau cùng Là

một domain trung hòa kháng thể, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính

hướng của virus Vùng V3 cùng với các trình tự bảo thủ vẫn chưa được bộc lộ khi

liên kết với CD4 và là yếu tố quyết định chủ yếu của tính thay đổi thụ thể

chemokin Trong vùng V3 này, ngoài vùng bảo tồn gồm 5 aminoacid nằm trên đỉnh

vòng, các aminoacid còn lại thường thay đổi tạo nên các kháng nguyên khác nhau

trên bề mặt của virus, điều này gây khó khăn cho hệ miễn dịch trong việc sản xuất

ra các kháng thể đặc hiệu kháng các dạng khác nhau của virus HIV [13]

GP 120 có 4 vùng tương đối ổn định được gọi là C1 đến C4; tương ứng nằm ở

vị trí từ acid amin 33-60; từ 87-126; từ 231-276; từ 460-467 Những vùng này đóng

vai trò duy trì các cấu trúc cơ bản của virus [21]

Gp 120 được biết đến là một protein bị đường hóa nặng nhất, chứa tới 50% là

cacbohydrat Các phân tử đường đóng vai trò là các “ mũ” trên các gai gp 120, sẽ

bảo vệ gp 120 thoát khỏi sự phát hiện của hệ miễn dịch Vì vậy, nó rất dễ biến đổi

và lẩn tránh hệ miễn dịch của con người [17][19]

Hình 1.14: Tạo phức hợp gp120-CD4-đồng thụ thể

Khi gp120 liên kết với CD4, nó thay đổi cấu trúc để cho phép tương tác với các thụ

thể của chemokin (CCR5 và CXCR4) Sự liên kết của phức hợp gp120-CD4 với

thụ thể chemokin sẽ tạo ra các thay đổi hình dáng trong gp41 [15]

1.3 Phương pháp chẩn đoán sinh học phát hiện HIV

Gồm 2 phần cơ bản:

- Phát hiện HIV trong cơ thể

- Xác minh là có suy giảm miễn dịch do HIV

Trong tình trạng hiểu biết hiện nay nhiễm HIV coi như là suốt đời nhiễm HIV

Phát hiện nhiễm HIV dựa trên 3 nguyên tắc [6] :

- Huỳnh quang miễn dịch

- Enzyme liên kết miễn dịch: ELISA (Enzyme Linked Immunoadsorbent

Asay)

- Kỹ thuật ngưng kết vi lượng thụ động (Serodia)

- Kỹ thuật xét nghiệm Western Blot

- Kỹ thuật RIPA (Radioimmuno precipitation assay)

1.3.2 Những phương pháp phát hiện trực tiếp kháng nguyên

Áp dụng:

- Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV

- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả

phát hiện kháng thể không rõ ràng

- Theo dõi diễn biến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virus trong

các mục đích nghiên cứu khác

Các phương pháp [6][16] :

- Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Phát hiện kháng nguyên P24 của virus trong máu

1.3.3 Nuôi cấy từ các lympho bào để phân lập virus

Nguyên lý: Tách tế bào đơn nhân trong máu bệnh nhân và nuôi cấy chung với tế

bào đơn nhân của người lành đã được hoạt hóa trong môi trường nuôi cấy PHA

(phytohemagglutinin) thích hợp

Xác định sự nhân lên của virus bằng kỹ thuật [6] :

- ELISA phát hiện kháng nguyên P24 trong nước nổi môi trường nuôi cấy tế

bào

- Dùng đồng vị phóng xạ phát hiện enzyme sao chép ngược của virus (RT)

Phương pháp này dùng chủ yếu là để nghiên cứu, còn để chuẩn đoán thì ở giai

đoạn mới nhiễm rất khó phân lập, vì khi huyết thanh có kháng thể kháng HIV thì

việc phân lập được virus là rất hạn hữu

1.3.4 Chẩn đoán sinh học có suy giảm miễn dịch và có rối loạn miễn

đáng kể < 200 TCD4

/mm3 suy giảm miễn dịch nghiêm trọng, giảm lympho B, bình thường 25-280/mm3

- Theo dõi kháng nguyên P24:

Vừa có giá trị phát hiện sớm bệnh 50-70% (+) ở giai đoạn sơ nhiễm

Khi có hội chứng AIDS đầy đủ 50-70% (+) trở lại

Bệnh tiến triển trầm lặng thì kháng nguyên P24 giảm dần theo thời gian

- Dấu hiệu gián tiếp suy giảm miễn dịch [6][16]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Plasmid mang gen gp120 của phân type B lưu hành ở Việt Nam (mẫu số 6,

Quảng Ninh) được tách dòng thành công tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện

CNSH – Viện KH&CN VN Plasmid được sử dụng để khuếch đại vùng gen và

thiết kế vector biểu hiện trong E.coli

2.2 Vật liệu

2.2.1 Hóa chất và sinh phẩm

- Sinh phẩm:

 Bộ Kit tách dòng – TA cloning Kit(Invitrogen)

 Kit xác định trình tự - BigDye Terminator v3.1(Applied Biosystems)

 Kit tinh sạch plasmid – S.N.A.P.TM

(Invitrogen)

 Kit thôi gen – S.N.A.P free UV(Invitrogen)

- Hóa chất: Ethidium bromide, IPTG, X-gal, Ampiciline, H2O2, dung dịch

Bradford, màng polyvinylidene difluoride(PVDF), BSA, 4-chloro-1-naphtol,

Tris-HCl, glycine, APS, SDS; chloroform, iso-amylalcohol, EDTA, TEMED, ethanol,

methanol, glycerol, acid acetic, acrylamide, bis-Acrylamide; cao nấm men, trytone,

select agar, agarose; và một số hóa chất khác dùng trong sinh học phân tử của các

hãng BioLab, BioRad, Fermentas

2.2.2 Mồi nhân gen

Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu đã được chúng tôi thiết kế dựa trên trình tự

gen gp120 của virus HIV-1 phân type B Mồi được tổng hợp tại hãng Invitrogen,

Mỹ có trình tự như trong bảng 2.1:

Bảng 2.1: Mồi đặc hiệu dùng để nhân đoạn gen mã hóa protein gp120 phân type

B lưu hành ở Việt Nam

Nhiệt

độ bắt cặp

mồi

GP120BBAM 5’-GGGATCCTGTAACATCTCAGTCATTACACAAGC-3’ 67,5°C

GP120BXHO 5’-CCTCGAGATTAAAACTGTGCCTTACAATTTCTGG-3’ 70,5°C

Ghi chú: GGATCC : vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BamH I

CTCGAG : vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Xho I

2.2.3 Trang thiết bị

Lò vi sóng (Samsung); máy lắc ổn nhiệt 37°C (Multitron-Đức); máy khuấy từ

(Rotolab,Osi); máy ly tâm (microcentrifuge-sorvall,Mỹ); tủ lạnh sâu (Sanyo); máy

khuấy trộn vortex (rotolab,osi); máy soi ảnh gel (BIO-RAD); cân phân tích (mettle

toledo); tủ cấy vô trùng (Sanyo); nồi khử trùng (Nhật Bản); máy ly tâm lạnh

(sorvall biofuge fresco); bộ điện đi DNA; máy xác định trình tự DNA tự động (ABI

3100,applied biosystems-Mỹ); bộ điện di protein, bộ điện di chuyển màng

Mini-transblot (BioRad-Mỹ); máy PCR (MJ Research-Mỹ); pipettman các loại (gilson)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nhân bản gen mã hóa protein gp120 phân type B của virus HIV bằng

phương pháp PCR

Gen mã hóa protein gp120 phân type B (gp120B_EX) được khuếch đại và gắn

trình tự nhận biết của hai enzyme giới hạn BamH I và Xho I bằng kỹ thuật PCR sử

dụng cặp mồi GP120BAM và GP120XHO.Thành phần phản ứng được trình bày ở

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau : 94°C – 3 phút; 94°C – 1 phút;

68°C – 1 phút; 72°C – 1phút 30 giây; 30 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4); 72°C – 8

phút, kết thúc ở 4°C

2.3.2 Điện di DNA trên gel agarose 1%

Phương pháp này được dùng để phân tích định tính và định lượng trong việc thu

nhận mẫu acid nucleic; nguyên tắc là dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic

Các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi

chịu tác động của điện trường các phân tử này sẽ chuyển động về điện cực dương

Tính linh động của các phân tử acid này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lượng

phân tử (số lượng nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel

Hóa chất điện di: agarose 1% (1g agarose pha trong 100ml dung dịch TAE 1X);

dung dịch đệm TAE 50X (60,5g Tris base; 14,3ml acid acetic; 25ml EDTA 0,5M,

pH 8,0); ethidium bromide (EtBr) 10mg/ml; đệm tra mẫu 10X (0,1ml bromophenol

blue 10%; 0,3% glyxerol 100% và định mức bằng H2O đến 1ml)

2.3.3 Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector biểu hiện

Tạo dòng đoạn gen gp120b_EX được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản

phẩm PCR có trình tự nhận biết của 2 enzyme giới hạn BamH I và Xho I và vector

biểu hiện pET32a(+) cùng được xử lý bằng 2 enzyme giới hạn trên

Thành phần phản ứng gắn bao gồm: H2O khử ion vô trùng; Dung dịch đệm của

T4 DNA ligase; Sản phẩm PCR; Vector pET32a(+) đã mở vòng; T4 DNA ligase

Phản ứng được ủ ở 14°C trong 16 giờ đảm bảo nhiệt độ cho T4 DNA ligase hoạt

động

2.3.4 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli

Cơ chế biến nạp bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để

DNA plasmid dễ dàng chui vào tế bào thể nhận Những tế bào có khả năng tiếp

nhận DNA- plasmid ngoại lai được gọi là tế bào khả biến Quá trình biến nạp DNA

plasmid vào tế bào E.coli gồm 2 giai đoạn: Tạo tế bào khả biến và biến nạp

Tạo tế bào khả biến:

- Tế bào E.coli được nuôi qua đêm trong 5ml môi trường LB lỏng

- Pha loãng huyền dịch tế bào đã nuôi cấy theo tỷ lệ 1:100 trong 5ml môi

trường LB

- Nuôi lắc ở 37°C, 200v/phút Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế bào bằng

phương pháp quang phổ kế ở bước sóng 600nm Khi giá trị OD600 đạt từ 0,6

– 1 là đạt yêu cầu

- Chuyển 1ml dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng

- Để trên đá 10 phút Sau đó ly tâm thu sinh khối ở 4°C, tốc độ 4.000v/phút,

trong thời gian 10 phút; loại dịch nổi

- Rửa cặn tế bào bằng CaCl2 100mM (tỷ lệ 1:10) ở 4°C Ly tâm 4.000v/phút,

loại dịch nổi

- Rửa lại bằng CaCl2 100mM (tỷ lệ 1:20) ở 4°C; ly tâm thu cặn

- Hòa cặn tế bào thành huyền dịch trong 100µl CaCl2 100mM, giữ trong đá ít

nhất 1 giờ trước khi tiến hành biến nạp

Biến nạp:

- Bổ sung 3-4µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến

- Để trên đá trong 30 phút

- Sốc nhiệt ở 42°C trong 1phút 30 giây

- Chuyển ống tế bào vào trong đá xốp để 3 phút

- Bổ sung 250µl môi trường LB lỏng; nuôi lắc ở 37°C trong 1 giờ

- Cấy trải 100µl-150µl trên môi trường thạch LBA (môi trường LB đặc có bổ

sung Amp (100µg/ml))

- Ủ đĩa đã cấy trong tủ ấm 37°C qua đêm

2.3.5 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli

Để thu nhận plasmid tái tổ hợp, DNA plasmid được tách chiết lại từ tế bào vi

khuẩn đã biến nạp và kiểm tra bằng cách cắt với enzyme giới hạn Quá trình tách

chiết gồm các bước cơ bản: Phá màng; Loại protein; Tủa nucleic acid

- Cấy các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh vào 2ml môi trường LBA

Nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200v/phút

- Ly tâm hỗn hợp dịch tế bào đã biến nạp 12.000v/p trong 1 phút; loại dịch

nổi và thu cặn

- Bổ sung Sol I (Tris-HCl 50mM, pH 8,0 + EDTA 10mM, pH 8,0) và trộn

đều bằng máy vortex

- Bổ sung Sol II (NaOH 200mM + SDS 1%), đảo nhẹ bằng tay

- Bổ sung Sol III (Kac-Potasium Acetat 3M, pH 5,5), đảo nhẹ bằng tay

- Chiết bằng chloroform:isomylalcohol (24:1); đảo nhẹ

- Làm khô cặn và hòa tan lại trong dung dịch TE-RNase (100µg/ml)

- Ủ trong bể ổn nhiệt 37°C trong 1 giờ để loại ARN

- Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

2.3.6 Phương pháp kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn

Phản ứng cắt vector biểu hiện tái tổ hợp với enzyme hạn chế gồm các thành

phần: H2O khử ion vô trùng; Dung dịch đệm cho enzyme; BSA; Enzyme giới hạn

(EcoRI; BamH I; Xho I); DNA plasmid Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở