Phản ứng giải trình tự DNA được thực hiện trên máy xác định trình tự DNA tự
3.2.2.Kiểm tra trạng thái tồn tại của protein gp120B tái tổ hợp
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất, chất lượng protein tái tổ
hợp, và ảnh hưởng đến tính ổn định của plasmid trong tế bào. Nhiệt độ càng cao thì khả năng đào thải plasmid của chủng càng lớn, đồng thời cũng làm cho mRNA dễ bị phá hủy. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến trạng thái tồn tại của protein tái tổ hợp.
Khoa Công nghệ sinh học 49
Do đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra trạng thái tồn tại của protein tái tổ hợp để chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp. Tiến hành nuôi cấy tế bào E.coli BL21 StarTM (DE3) mang vector tái tổ hợp pETgp120B ở 37°C cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8. Sau đó tế bào được cảm ứng bằng IPTG 1mM là tiếp tục được nuôi lắc ở 25°C, 30°C, 37°C trong 3 giờ. Tế bào được phá bằng sóng siêu âm theo phương pháp đã trình bày ở trên. Các pha cặn và dịch nổi thu nhận sau lần ly tâm được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamid.
Hình 3.10: Xác định trạng thái tồn tại của protein tái tổ hợp gp120B
M: Thang Protein chuẩn; ĐC: Mẫu trước cảm ứng; C: protein thu được ở pha cặn sau khi ly tâm dịch phá 12.000v/p; HT: Mẫu protein thu được ở pha nổi sau khi ly tâm dịch phá 12.000v/p.
Kết quả điện di (Hình 3.10) cho thấy ở cả ba nhiệt độ 25°C, 30°C, 37°C pha nổi không có băng protein như kích thước protein tái tổ hợp, trong khi ở pha cặn xuất
Khoa Công nghệ sinh học 50
hiện băng có kích thước tương đương với kích thước của protein gp120B tái tổ hợp. Như vậy, protein tái tổ hợp gp120B biểu hiện trong chủng E.coli BL21 StarTM (DE3) dưới dạng protein thể vùi, dạng không hòa tan. Vì vậy, để tiết kiệm thời gian và chi phí sản xuất chúng tôi chọn nhiệt độ tối ưu để biểu hiện là 37°C.