Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.12. Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
Phương pháp tinh sạch này dựa vào liên kết giữa ion Ni2+
với vòng Imidazol của histidine. Khi protein tái tổ hợp được đưa qua cột, vòng Imidazol của Histidine sẽ liên kết với ion kim loại trên cột và giữ protein cần tinh chế ở lại trên cột. Các protein khơng có ái lực hoặc có ái lực yếu với ion kim loại trên cột thì sẽ bị rửa trôi.
Trước khi tiến hành tinh chế, chúng tôi xác định trạng thái tồn tại của protein tái tổ hợp để có thể chọn phương pháp tinh chế thích hợp. Protein được biểu hiện lượng lớn và tiến hành tinh chế theo phương pháp Hybrid Conditions của hệ thống tinh sạch ProBond Nickel-Chelating Resin (Invitrogen) gồm các bước sau:
Cặn tế bào hòa vào 8ml dung dịch đệm phá tế bào Denaturing Binding Buffer- DBB-pH 7,8(8M Urea; 20mM NaH2PO4 pH 7,8 ; 500mM NaCl). Phá tế bào bằng máy siêu âm trong thời gian 20 phút. Dịch phá được ly tâm 10.000v/p trong 5 phút; và 3.000v/p trong 15 phút để loại xác tế bào. Phần dịch nổi chứa protein được đưa lên cột ProBond Nickel-Chelating Resin đã chuẩn bị trước, lắc nhẹ cột trên máy vortex trong 30 phút ở nhiệt độ phòng để protein tái tổ hợp liên kết với Ni2+
.Gắn bằng 6ml DBB (2 lần). Các protein khơng có ái lực Ni2+ sẽ bị đẩy ra khỏi cột bằng
Khoa Công nghệ sinh học 38
cách rửa cột nhiều lần bằng các đệm Denaturing Wash Buffer-DWB-pH6,0(8M Urea; 20mM NaH2PO4 pH6,0 ; 500mM NaCl) (2 lần) và Native Wash Buffer- NWB-pH 8,0 (50mM.NaH2PO4 pH8,0 + NaCl.500mM + 20mM.Imidazole pH6,0) (4 lần). Cuối cùng protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch Native Elution Buffer-NEB-pH 8,0 (50mM.NaH2PO4 pH 8,0 + NaCl.500mM + 250mM.Immidazole pH 6,0) và được thu theo phân đoạn sau đó được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide.