Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế vector biểu hiện mang gen gp120 phân type B của virus H
3.1.5. Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn
Để khẳng định chắc chắn các dòng DNA plasmid có mang gen gp120B_EX, chúng tôi tiến hành xử lý cắt kiểm tra các DNA plasmid này bằng enzyme giới hạn
BamH I và Xho I. Khi điện di trên gel agarose, các dòng plasmid gắn sản phẩm PCR sau khi được cắt bằng hai enzyme giới hạn BamH I và Xho I sẽ văng ra một đoạn có kích thước tương đương với kích thước của sản phẩm PCR gắn vào. Chúng tôi sử dụng 5 dòng plasmid số 3, 4, 8, 10, 12 dự đoán có mang gen
gp120B_EX để thực hiện phản ứng cắt với hai enzyme giới hạn BamH I và Xho I. Sau đó kiểm tra điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.5).
Hình 3.5: Kiểm tra các dòng vector tái tổ hợp pET32a(+)
ĐC1: Thang DNA chuẩn 1 kb. ĐC2-6: Các dòng plasmid 3, 4, 8, 10, 12 cắt bằng
BamH I và Xho I, ĐC7: Đối chứng (đoạn gen gp120B_EX).
Kết quả phân tích sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp cho thấy ở đường chạy số 2, 3, 5, 6 xuất hiện băng có kích thước khoảng 540bp tương đương với kích thước của gen gp120B_EX. Đường chạy số 4 chỉ xuất hiện băng plasmid chưa bị xử lý bằng enzyme giới hạn, có khả năng do trình tự nhận biết của enzyme giới hạn
Khoa Công nghệ sinh học 44
BamH I và Xho I ở sản phẩm PCR đã bị biến đổi khiến cho enzyme không thể nhận biết để cắt. Từ kết quả trên, chúng tôi có thể kết luận sơ bộ đã thu được plasmid tái tổ hợp số 3, 4, 10, 12 mang gen gp120B_EX.
3.1.6. Tinh sạch DNA plasmid
Để khẳng định chính xác những plasmid tái tổ hợp mang gen gp120B_EX;
chúng tôi tiến hành giải trình tự plasmid đó. Vì chất lượng của phản ứng xác định trình tự phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh sạch của mẫu DNA plasmid, do đó phải tiến hành tinh sạch plasmid tái tổ hợp. Chúng tôi lựa chọn 3 dòng plasmid tái tổ hợp số 4, 10, 12 có khả năng mang gen gp120B_EX tinh sạch bằng S.N.A.P Miniprep Kit (Invitrogen). Kết quả tinh sạch được kiểm tra bằng điện di DNA trên gel agarose 1% và đo OD ở bước sóng 260-280nm.
Hình 3.6: Kết quả kiểm tra tinh sạch DNA plasmid
ĐC1-3: Tương ứng với dòng plasmid tái tổ hợp số 4, 10, 12
Kết quả đo OD260-280 và kết quả điện di kiểm tra cho thấy rằng các dòng plasmid đã hoàn toàn sạch, có thể sử dụng cho mục đích giải trình tự gen.
Khoa Công nghệ sinh học 45